DE1927802C2 - DHO-Prostadienäure and pharmaceutical preparations containing them - Google Patents
DHO-Prostadienäure and pharmaceutical preparations containing themInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die DHO-Prostadicnsäuxc (PGD2) der FormelThe invention relates to the DHO Prostadicnsäuxc (PGD 2 ) of the formula
HOHO
\ H\ H
COOH1 COOH 1
OHOH
Die erfindungsgemäße Verbindung ist ein Derivat der Prostancarbonsäure, der folgende Strukturformel mit dem angezeigten Bezifferungssystem zugeordnet ist:The compound of the invention is a derivative of prostane carboxylic acid having the following structural formula is assigned to the displayed numbering system:
COOHCOOH
(Π)(Π)
Unter Bezug auf Prostancarbonsäure als Stammverbindung kommt der genannten Verbindung folgende systematische Bezeichnung zu:With reference to prostane carboxylic acid as the parent compound, the named compound comes as follows systematic name for:
9λ,Ι5(S)-Dihydroxy-11-oxoprosta-cis-S.trans-13-diensäure (im folgenden abgekürzt als DHOprostadiensäure bezeichnet).9λ, Ι5 (S) -dihydroxy-11-oxoprosta-cis-S.trans-13-dienoic acid (hereinafter referred to as DHOprostadienoic acid for short).
Die erfindungsgemäße Verbindung ähnelt in ihrer Struktur gewissen natürlichen Prostaglandinen, die ebenfalls als Derivate der Prostancarbonsäure, Formel II. anzusehen sind.The compound of the invention is similar in structure to certain natural prostaglandins, the are also to be regarded as derivatives of prostane carboxylic acid, formula II.
Ein Vergleich der Formeln der verschiedenen natürlichen Prostaglandine E mit der Formel I zeigt, daß sich diese hinsichtlich der Stellung des Ring-Oxoatoms und der Ringhydroxylgruppe unterscheiden. Die natürlichen Prostaglandine E sind 9-Oxo-11-hydroxyverbindungen, während die erfindungsgemäße Verbindung eine 9-Hydroxy-11-oxoverbindung ist.A comparison of the formulas of the various natural prostaglandins E with the formula I shows that these differ with regard to the position of the ring oxo atom and the ring hydroxyl group. The natural ones Prostaglandins E are 9-oxo-11-hydroxy compounds, while the compound of the invention is a 9-hydroxy-11-oxo compound.
In den Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindung der Formel I und der natürlichen Prostaglandine E zeigen sich erhebliche und völlig unerwartete Unterschiede. So ist die letztgenannte Verbindung beispielsweise äußerst wirksam in der Stimulierung der glatten Muskulatur, wie sich beispielsweise bei Versuchen an Streifen von Meerschweinchen-Ilcum, Kaninchcn-Duodenum und Rennmaus-Colon gezeigt hat. Vergleiche hierzu Horton.. ExDcrientia 21, 113 (1965). Die erfindungsgemaße Verbindung weist dagegen nur eine sehr viel geringere Wirkung auf die glatte Muskulatur auf als die natürlichen Prostaglandine E. Bezüglich der Meßmethoden vergleiche Pike et al, Proc. Nobel Symposium II, Stockholm (1966); lnteiscience Publishers, New York, S. 161 - 172 (1967).In the properties of the compound of the invention the formula I and the natural prostaglandins E show considerable and completely unexpected differences. For example, the latter compound is extremely effective in stimulating the smooth Musculature, as shown, for example, in experiments on strips of guinea pig ileum, rabbit duodenum and gerbil colon. Compare with this Horton .. ExDcrientia 21, 113 (1965). the In contrast, the compound according to the invention has only a very much smaller effect on the smooth muscles than the natural prostaglandins E. With regard to the measurement methods, compare Pike et al, Proc. Nobel Symposium II, Stockholm (1966); lnteiscience Publishers, New York, pp. 161-172 (1967).
Die natürlichen Prostaglandine E sind darüber hinaus bei intravenöser Verabreichung außerordentlich wirksame Mittel zur Erniedrigung des arteriellen Bluldnikkes. Vergleiche hierzu ebenfalls Horton. Lc. Die erfindungsgemäße Verbindung bewirkt dagegen nur eine geringe Erniedrigung des systemischen arteriellen Blutdruckes im Vergleich zu den natürlichen Prostancarbonsäurederivaten, was beispielsweise durch Messungen an betäubten (Pentobarbitalnatrium) pentolinium-behandelten Ratten mit in die Aorta und die rechte Herzkammer eingesetzten Kanülen Bezeigt werden konnte. Bezüglich der Meßmethoden wird auf die Arbeit von Pike et af, I. c. verwiesen.The natural prostaglandins E are also extremely effective when administered intravenously Means for lowering the arterial blue nikke. Compare with Horton as well. Lc. The compound according to the invention, on the other hand, only works a slight decrease in the systemic arterial blood pressure compared to the natural prostane carboxylic acid derivatives, what, for example, by measurements on anesthetized (pentobarbital sodium) pentolinium-treated Rats with cannulas inserted into the aorta and right ventricle are shown could. With regard to the measurement methods, reference is made to the work by Pike et af, I. c. referenced.
Es ist auch bekannt, daß die natürlichen Prostaglandine E hochwirksarnc Mitte! zur Verhinderung einer Blutplättchen-Aggregation und einer Thrombusbildung sind, wie sie durch verschiedene physikalische Einwirkungen, z. B. arterielle Verletzung, verschiedene biochemische Mittel, z. B. Collagen, ADP und Thrombin, verursacht werden; die natürlichen Prostaglandine bewirken eine Verteilung der Blutgerinnsel, und zwar sowohl in vivo als auch in vitro. In diesem Zusammenhang wird auf die Arbeit von Emmons et al, British Medical Journal, 2, 468 (1967); Interscience Publishers, New York, S. 241-252 (1967) verwiesen. Die erfindungsgemäße Verbindung ist teilweise in derselben Weise wirksam, teilweise jedoch den natürlich vorkommenden Prostaglandinen stark überlegen. Die natürlichen Prostaglandine E sind aber auch, wie weiter vorn bereits gesagt wurde, starke Depressoren und Stimulantien der glatten Muskulatur. Diese letztgenannten biologischen Eigenschaften rufen natürlich unerwünschte physiologische Wirkungen bei einem PatientenIt is also known that the natural prostaglandins E are highly effective! to prevent a Platelet aggregation and thrombus formation are caused by various physical agents, z. B. arterial injury, various biochemical Medium, e.g. Collagen, ADP and thrombin; the natural prostaglandins cause blood clots to spread, both in vivo and in vitro. In this context refer to the work of Emmons et al, British Medical Journal, 2, 468 (1967); Interscience Publishers, New York, pp. 241-252 (1967). The compound of the present invention is partly in the same Wise effective, but in some cases far superior to naturally occurring prostaglandins. The natural ones Prostaglandins E are, however, as already mentioned above, strong depressors and stimulants the smooth muscles. These latter biological properties naturally cause undesirable ones physiological effects in a patient
•to hervor, wenn diesem die Substanz zur Verhütung und Regulierung einer Thrombose oder zur Entfernung von Blutgerinnseln verabreicht wird. Diese unerwünschten physiologischen Wirkungen treten jedoch überraschenderweise nicht auf. wenn man die erfindungsgemaße Verhinderung zu demselben Zweck verabreicht. Die erfindungsgemaße Verbindung eignet sich daher in hervorragender Weise zur Verhinderung einer Aggregation der Blutplättchen, zur Verminderung des adhäsiven Charakters der Blutplättchen und zur• to excel if this is the substance for contraception and Used to regulate thrombosis or to remove blood clots. These undesirable However, surprisingly, physiological effects do not occur. if one of the invention Prevention administered for the same purpose. The compound according to the invention is therefore suitable in excellent way to prevent platelet aggregation, to reduce the adhesive character of the platelets and for
so Entfernung bereits gebildeter Blutgerinnsel sowie zur Verhinderung der Entstehung von Blutgerinnseln bei Menschen und Säugetieren wie Kaninchen, Ratten und anderen Tieren mit wirtschaftlichem Wert. Die erfindungsgemäße Verbindung ist z. B. zur Behandlung und zur Propylaxe von Myocard-Infarkte und postoperativer Thrombose, zum Offenhalten von Gefäßverbindungen im Anschluß an die Operation, zur Behandlung von Atherosclerose und Arteriosclerose, zur Bekämpfung von Blutzusammenballungsdefekten infolge von Lipämie sowie anderen klinischen Zuständen, bei denen zum Krankheitsbild eine Störung des Fettstoffwechsels oder eine Hyperlipidämie gehört, geeignet.thus removing blood clots that have already formed and preventing blood clots from forming Humans and mammals such as rabbits, rats and other animals of economic value. The inventive Connection is z. B. for the treatment and prophylaxis of myocardial infarcts and postoperative Thrombosis, to keep vascular connections open after the operation, to treat Atherosclerosis and arteriosclerosis, to combat blood clotting defects due to lipemia as well as other clinical conditions in which the clinical picture is a disorder of the lipid metabolism or hyperlipidemia is suitable.
Zur Bekämpfung der genannten Krankheitszustände wird die erfindungsgemaße Verbindung systemisch, z. B.To combat the disease states mentioned, the compound according to the invention is used systemically, e.g. B.
intravenös, subkutan, intramuskulär, oral, rektal oder in Form von sterilen Implanten (für länger dauernde Wirkung) verabreicht. Soll, beispielsweise in Notfällen, eine rasche Wirkung erzielt werden, so wird dieintravenous, subcutaneous, intramuscular, oral, rectal or in the form of sterile implants (for long-term Effect) administered. If, for example in emergencies, a quick effect is to be achieved, the
intravenöse Art der Verabreichung bevorzugt.intravenous route of administration preferred.
Intravenöse Injektion oder Infusion wird vorzugsweise mit sterilen wäßrigen isotonischen Lösungen oder Suspensionen durchgefühn. Für subkutane oder intramuskuläre Injektionen verwendet man sterile Lösungen der erfindungsgemäßen Verbindung in Form der Säuren, Salze oder Ester in wäßrigen oder nicht wäßrigen Medien. Für die orale Verabreichung eignen sich Tabletten, Kapseln und flüssige Präparate wie Sirape. Elixiere und einfache Lösungen, wobei in diesen ι ο Präparaten die üblichen pharmazeutischen Träger- oder Streckmittel verwendet werden können. Für die rektale Verabreichung eignen sich am besten Suppositorien. die in üblicher und bekannter Weise hergestellt werden. Für Gewebeimplantate verwendet man sterile Tabletten oder Siüconkautschukkapseln oder andere geeignete Objekte, die die zu verabreichende Substanz enthalten oder mit dieser imprägniert sind.Intravenous injection or infusion is preferred durchgefühn with sterile aqueous isotonic solutions or suspensions. For subcutaneous or intramuscular Injections are used sterile solutions of the compound according to the invention in the form of Acids, salts or esters in aqueous or non-aqueous media. Suitable for oral administration tablets, capsules and liquid preparations such as syrape. Elixirs and simple solutions, being in these ι ο Preparations the usual pharmaceutical carriers or excipients can be used. For the rectal Administration suppositories are best. which are produced in the usual and known manner. For Tissue implants are sterile tablets or silicone rubber capsules or other suitable ones Objects that contain or are impregnated with the substance to be administered.
Die Mittel werden in Mengen von etwa 0,002 bis etwa 10 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag verwendet, wobei die im Einzelfall anzuwendende exakte Dosis vom Alter, vom Gewicht und dem Zustand des Patienten sowie auch von der Häufigkeit und der Art der Verabreichung abhängt.The funds are used in amounts of about 0.002 to about 10 mg per kilogram of body weight per day, The exact dose to be used in each individual case depends on the age, weight and condition of the Patient as well as the frequency and type of administration.
Zum Nachweis des technischen Fortschritts der erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber den natürlich vorkommenden Prostaglandinderivaten der Ε-Reihe sowie dem bekannten PGDt wurden nachstehende Vergleichsversuche durchgeführt.To demonstrate the technical progress of the compounds according to the invention compared to the naturally occurring prostaglandin derivatives of the Ε series and the known PGD t , the following comparative experiments were carried out.
Die Verbindungen wurden auf ihre Wirksamkeit bezüglich Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation (IBA), der Stimulierung der glatten Muskulatur (SGM) und als Blutdrucksenker (BDS\getesu:.The compounds were tested for effectiveness in inhibiting platelet aggregation (IBA), smooth muscle stimulation (SGM) and as an antihypertensive agent (BDS \ getesu :.
Die Stimulierungswirkung arf die glatte Muskulatur wurde am isolierten Rennmaus-Col: τ gemäß der J5 Meßmethode von Pike et al. aaO bestimmt.The stimulating effect is the smooth muscles was on the isolated gerbil Col: τ according to J5 Measurement method from Pike et al. loc. cit. determined.
Die Wirkung als Blutdrucksenker wurde an betäubten (Pentobarbitalnatrium) pentoliniumbehandelten Ratten, wie vorstehend bereits erwähnt, ermittelt, wobei bezüglich der Meßmethoden ebenfalls auf Pike et al. *o aaO hingewiesen wird.The effect as a hypotensive agent was determined on anesthetized (pentobarbital sodium) pentolinium-treated rats, as already mentioned above, with Pike et al. * o aaO is pointed out.
Beim Test der Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation handelt es sich um die Inhibierung von ADP-induzierler Blutplättchen-Aggregation in blutplättchenreichem menschlichem Plasma. Die Blutplätt- « chen-Aggregation wurde an einem Aggregometer gemessen.The test of inhibition of platelet aggregation is the inhibition of ADP-inducing platelet aggregation in platelet-rich human plasma. The platelet aggregation was measured on an aggregometer measured.
Weitere Daten und insbesondere eine genaue Beschreibung der IBA-Bestimmungsmethoden können aus der Veröffentlichung von Edward E. Nishizawa et al. >° in Prostaglandis, Band 9, Nr. 1 (]anuar 1975) S. 109 f. entnommen werden.Further data and in particular a precise description of the IBA determination methods can be provided from the publication by Edward E. Nishizawa et al. > ° in Prostaglandis, Volume 9, No. 1 (] January 1975) p. 109 f. can be removed.
Die Versuchsergebnissc sind aus nachstehender Tabelle zu entnehmen.The test results can be found in the table below.
»Konzentration« diejenige Konzentration bezeichnet wird, bei der die zu untersuchende Wirkung zu 50% eintritt (in .ug/ml)."Concentration" is the concentration at which the investigated effect is 50% occurs (in .g / ml).
Verbindunglink
SGM BDS IBASGM BDS IBA
(Fp. 62,8-63,3° C)(M.p. 62.8-63.3 ° C)
PGD1
PGE,
PGE2
PGE3 PGD 1
PGE,
PGE 2
PGE 3
6060
4 14 1
7 77 7
7 67 6
Vergleichcomparison
6565
Die in der Tabelle angegebenen Werte ergeben sich aus der nachstehenden Bcwertungsskaln, wobei mit Wie aus den Vergleichsdaten ersichtlich ist, ist PGD2 bezüglich Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation zehnmal wirksamer als PGEi (dem besten Vergieichsmittel), besitzt eine wesentlich günstigere geringere Wirkung auf die glatte Muskulatur und geringere blutdrucksenkende Wirkung.The values given in the table result from the evaluation scale below, whereby with As can be seen from the comparative data, PGD 2 is ten times more effective than PGEi (the best comparative agent) in terms of inhibiting platelet aggregation, and has a significantly more favorable, lesser effect on the smooth Muscles and less antihypertensive effect.
Die LD50-Werte wurden durch intravenöse Verabreichung der Testverbindung in 95%igem Ethanol in einer Konzentration von 0,5 ml je kg nach der mathematischen Bestimmungsmethode von Spearman-Kärber, Statistical Method in Biological Assay, D. H. Finney. Hafner Publishing Comp. (1964), S. 524-530. bestimmt.The LD50 values were obtained by intravenous administration the test compound in 95% ethanol at a concentration of 0.5 ml per kg according to the mathematical Determination method by Spearman-Kärber, Statistical Method in Biological Assay, D. H. Finney. Hafner Publishing Comp. (1964), pp. 524-530. certainly.
Für die erfindungsgemäße Verbindung wurde bei Mäusen ein LD»-Wert von 264 mg/kg ermittelt, während bei PGEj der LD*)-Wen 70 mg/kg beträgt und PGEi eine so starke gefäßverengende Wirkung aufweist, daß selbst bei Dosen unter ! mg/kg fast alle Versuchstiere starben.For the compound according to the invention, an LD »value of 264 mg / kg was determined in mice, while with PGEj the LD *) - Wen is 70 mg / kg and PGEi has such a strong vasoconstricting effect that even with doses below! mg / kg almost all Experimental animals died.
Die getestete Verbindung erwies sich somit den Vergleichsverbindungen überlegen.The tested compound thus proved to be superior to the comparison compounds.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann durch aerobe Inkubation von nur-cis-SÄlLH-Eicosatetraencarbonsäure(im folgenden abgekürzt als E-tetraensäure bezeichnet) mit bestimmten wäßrigen Präparaten, die aus Schafsamenblasen erhalten worden sind, gewonnen werden.The compound according to the invention can be prepared by aerobic incubation of only-cis-SALLH-eicosatetraenecarboxylic acid (im hereinafter referred to as E-tetraenoic acid) with certain aqueous preparations that obtained from sheep seed vesicles.
Es sind bereits zahlreiche Untersuchungen zur aeroben Inkubation von verschiedenen langkettigen ungesättigten Fettsäuren durchgeführt worden, wobei man auch die drei Säuren mit 20 Kohlenstoffatomen, die oben erwähnt worden sind, zusammen mit verschiedenen aus Schafsamenblasen erhaltenen Präparaten verwendet hat. In diesem Zusammenhang wird auf folgende Arbeit verwiesen:There are already numerous studies on the aerobic incubation of various long-chain unsaturated fatty acids have been carried out, also including the three acids with 20 carbon atoms, the have been mentioned above, together with various preparations obtained from sheep seed vesicles has used. In this context, reference is made to the following work:
Proc. Nobel Symposium II. Stockholm (1966): Interscience Publishers. New York. S.31 -56(1967).Proc. Nobel Symposium II. Stockholm (1966): Interscience Publishers. New York. Pp. 31-56 (1967).
Bei der Untersuchung der Inkubation von E-triensäure mit isolierten Mikrosomen von Schafsamenblasen trennten Nugteren et al., Rec. Trav. Cheim. 85, 405 (1966), ein Inkiibationsprodukt ab. das sich als PGD, erwies.When studying the incubation of e-trienoic acid with isolated microsomes from sheep seminal vesicles separated Nugteren et al., Rec. Trav. Cheim. 85, 405 (1966), an incipient product. that turns out to be PGD, proved.
Große Ausbeuten an erfindungsgcmäßcr Verbindung lassen sich gewinnen, wenn man E-Tctraensäure oder ein wasserlösliches Salz derselben inkubiert, und zwar zusammen mit einer Mischung aus dem Enzymsystem. welches in der Mikrosomfraktion von Schafsamenblasen enthalten ist. und der teilchenfreien überstehenden Fraktion, die man aus wäßrigen Homogcnatcn dieser Drüsen gewinnt. Unter »teilchenfrei« wird in diesemLarge yields of the compound of the invention can be obtained by incubating E-Tctraenic acid or a water-soluble salt thereof, namely along with a mixture from the enzyme system. which is in the microsome fraction of sheep seed vesicles is included. and the particle-free supernatant fraction obtained from aqueous homogeneities of this Glands wins. Under "particle-free" becomes in this
Zusammenhang der Zustand verstanden, in demsich die Flüssigkeit nach dem Sedimentieren in einer Hochleistungs-Zentrifuge, d. h. nach dem Sedimentieren mit etwa 100 00Ox^ befindet. Die teilchenfreie Fraktion kann auch ohne Hilfe einer Zentrifuge, z. B. durch Filtrieren durch ein Filter oder eine Membran mit entsprechender Porengröße, gewonnen werden.Context understood the state in which the Liquid after sedimentation in a high-performance centrifuge, d. H. after sedimentation with about 100 00Ox ^ is located. The particle-free fraction can also be done without the aid of a centrifuge, e.g. B. by filtering through a filter or membrane with corresponding pore size can be obtained.
Kleine, aber annähernd gleiche Mengen an PGEi und DHOprostadiensäure werden gewonnen, wenn man E-tetraensäure mit gewaschenen Mikrosomen von Schafsamenblasen in einem wäßrigen Puffer, pH 7,5. in der von Nugteren et aL beschriebenen Weise inkubiert Wird Glutathion (5χ \0~4 Molkonzentration) zu solch einem Inkubationäreaktiensgemisch gegeben, so erhöht sich die Ausbeute an PGEi um den Faktor IZ während die Ausbeute an eifindungsgemäßer Verbindung sich nur um den Faktor 4 erhöht. Wird dagegen E-tetraensäure mit gewaschenen Mikrosomen und gleichzeitig mit der teilchenfreien überstehenden Flüssigkeit, die aus den Schafsamenblasen erhalten worden ist inkubiert, so erhöht sich die Ausbeute an PGEi nur um den Faktor 9, während die Ausbeute an erfindungsjemäßer Verbindung um den Faktor 13 steigt Bei der Inkubation von E-tetraensäure mit Schafsamenblasenpräparaten, die durch Zentrifugation eines wäßrigen Drüsenhomogenates bei etwa 8500 χ g-erhalten worden sind,gewinnt man erhebliche Mengen sowohl von PGEi als auch erfindungsgemäßer Verbindung. Wird dieser Inkubationsmischung zusätzliche teilchenfreie überstehende Flüssigkeit zugegeben, so erhöht sich die Ausbeute an ungesättigter DHOsäure um etwa 30%. während gleichzeitig die Ausbeute an PGE( abnimmt. Bei der Inkubation von E-tetraensäure mit teilchenfreier Flüssigkeit allein erhält man etwa dieselben Mengen an PGEi und ungesättigter DHOsäure, die auch bei der Inkubation mit gewaschenen Mikrosomen allein erhalten werden.Small but approximately equal amounts of PGEi and DHOprostadienoic acid are obtained if E-tetraenoic acid is mixed with washed microsomes from sheep seminal vesicles in an aqueous buffer, pH 7.5. incubated in the manner described by Nugteren et al. If glutathione (5χ \ 0 ~ 4 molar concentration) is added to such an incubation reaction mixture, the yield of PGEi increases by a factor of IZ, while the yield of the compound according to the invention increases only by a factor of 4. If, on the other hand, E-tetraenoic acid is incubated with washed microsomes and at the same time with the particle-free supernatant fluid obtained from the sheep seed vesicles, the yield of PGEi increases by a factor of only 9, while the yield of the compound according to the invention increases by a factor of 13 the incubation of E-tetraenoic acid with sheep seminal vesicle preparations obtained by centrifugation of an aqueous gland homogenate at about 8500 μg, considerable amounts of both PGEi and the compound according to the invention are obtained. If additional particle-free supernatant liquid is added to this incubation mixture, the yield of unsaturated DHO acid increases by about 30%. while at the same time the yield of PGE ( decreases. When E-tetraenoic acid is incubated with particle-free liquid alone, approximately the same amounts of PGEi and unsaturated DHO acid are obtained as are obtained when incubated with washed microsomes alone.
Die erfindungsgemäße Verbindung ist das Hauptprodukt, wenn E-tetraensäure mit dem Enzymsystem aus Scha'iamenblasenmikrosomen in Gegenwart der teilchenfreien Flüssigkeit aus solchen Drüsen inkubiert wird. In der Flüssigkeit ist offenbar ein Faktor vorhanden, der die Bildung von PGDi und der Verbindung der Formel I begünstigt. Dieser Faktor ist wärmeempfindlich, was man daran erkennt, daß ein großer Teil der Wirkung de; teilchenfreien Flüssigkeit zur Bildung der ungesättigten DHOsäure verlorengeht, wenn man diese zum Sieden erhitzt Die Wirkung zur Bildung von PGEi nimmt bei dieser Behandlung dagegen nur geringfügig ab. Es ist daher ratsam, eine native teilchenfreie Flüssigkeit zu verwenden, in der nicht etwa durch une ungünstige Behandlung dieser notwendige Faktor zerstört worden ist.The compound of the invention is the main product when E-tetraenoic acid is related to the enzyme system Egg vesicle microsomes in the presence of the particle-free Fluid from such glands is incubated. Apparently there is a factor in the liquid present, which favors the formation of PGDi and the compound of formula I. This factor is sensitive to heat, which can be seen from the fact that a large part of the effect de; particle-free liquid to the formation of the unsaturated DHO acid is lost when it is heated to the boil In contrast, the formation of PGEi decreases only slightly with this treatment. It is therefore advisable to have a to use native particle-free liquid, in which not about unfavorable treatment of this necessary factor has been destroyed.
Die Schafr.amenblasenmikrosomen werden als solche verwendet und wandeln in ihrem Enzymsystem E-Tetraensäure in die gewünschte ungesättigte DHOsäure um. Es ist aber auch möglich, das Enzymsystem aus den Mikrosomen zu isolieren und, falls gewünscht, weiter zu reinigen. Das Enzymsystem ist für die Inkubation sowohl vor der Abtrennung als auch nach der Abtrennung und Reinigung geeignet.The sheep's vesicle microsomes are called as such uses and converts E-tetraenoic acid into the desired unsaturated DHO acid in their enzyme system around. But it is also possible to isolate the enzyme system from the microsomes and, if desired, further cleaning. The enzyme system is suitable for both pre-separation and post-incubation suitable for separation and cleaning.
Die Abtrennung des Enzymsystems aus den Mikrosomen wird so durchgeführt, daß man die Mikrosomen mit einer waschaktiven Substanz, vorzugsweise einer nichtionischen waschaktiven Substanz, z. B. Isooctylphenoxypolyethylethanol, behandelt. Andere waschaktive Substanzen, z. B. Natriumlaurylsulfat, können ebenfalls verwendet werden. Mit einem bestimmten nichtionischen Waschrohstoff (Cutsum, Fischer Scientific Company, Pittsburgh, Pa.) ergibt sich in einprozentiger Waschrohstoff-Konzentration eine maximale Freisetzung des Enzymsystems; aber auch bei nur 0,l°/oiger-Konzentration werden mehr als 50% der Enzymaktivität unverändert aus den Mikrosomen freigesetzt. Bei Natriumlaurylsulfat liegt die opjvnale Konzentration für die Freisetzung (Solubilisierung) bei 033%.The separation of the enzyme system from the microsomes is carried out in such a way that the microsomes with a detergent substance, preferably a nonionic detergent substance, e.g. B. Isooctylphenoxypolyethylethanol, treated. Other detergent substances, e.g. B. sodium lauryl sulfate, can can also be used. With a certain nonionic washing raw material (Cutsum, Fischer Scientific Company, Pittsburgh, Pa.), Maximum release results at a one percent detergent base concentration of the enzyme system; but even with only 0.1% concentration more than 50% of the Enzyme activity released unchanged from the microsomes. In the case of sodium lauryl sulfate, the opjvnale lies Concentration for release (solubilization) at 033%.
ίο Nach der Freisetzung wird zentrifugiert, vorzugsweise bei etwa 100 000 χ g. wobei man eine klare überstehende Flüssigkeit gewinnt, die anstellt der Mikrosomensuspension als Quelle für das notwe idige Enzymsystem verwendet wird.ίο After the release it is centrifuged, preferably at about 100,000 χ g. a clear supernatant liquid is obtained which, instead of the microsome suspension, is used as a source for the necessary enzyme system.
Das Enzymsystem wird durch schrittweise Ausfällung des Proteins aus der nach dem Zentrifugieren vorliegenden teilchenfreien Flüssigkeit gereinigt. Setzt man beispielsweise der zentrinigierten Flüssigkeit Ammoniumsulfat bis zur 30%igen Sättigung zu, so wird das Protein ausgefällt, während das Enzym in der Flüssigkeit bleibt. Auf diese t-Vaise wird alles nicht-enzymatische Protein entfernt Füg. man dann weiteres Ammoniumsulfat bis zur 60%igen Sättigung der Flüssigkeit zu, so tritt eine weitere Proteinfällung ein, in der praktisch die gesamte Enzymaktivität enthalten ist. Die nach 30%iger Ammoniumsulfatsättigung verbleibende überstehende Flüssigkeit und die Proteinausfällung nach 60%iger Ammoniumsulfatsättigung werden anstelle der Mikrosomensuspension als Quelle für das notwendige Enzymsystem verwendetThe enzyme system is made by gradually precipitating the protein from it after centrifugation present particle-free liquid purified. For example, if the centrifuged liquid is used Ammonium sulfate is added up to 30% saturation, so the protein is precipitated while the enzyme is in the Liquid remains. On this t-Vaise everything becomes non-enzymatic Protein removes add. then more ammonium sulfate until the 60% saturation If liquid is added, a further protein precipitation occurs, in which practically the entire enzyme activity is contained. The supernatant liquid remaining after 30% ammonium sulfate saturation and the protein precipitation after 60% ammonium sulfate saturation, the microsome suspension is used as the source for the necessary enzyme system used
Das Enzymsystem kann weiterhin gereinigt werden, indem man eine Lösung des Proteins, welches durch 60%ige Ammoniumsulfatsättigung ausgefällt worden ist, in einem verdünnten schwach alkalischen wäßrigen Puffer gegen denselben Puffer dialysiert.The enzyme system can be further purified by adding a solution of the protein which is passed through 60% ammonium sulfate saturation has been precipitated in a dilute weakly alkaline aqueous Buffer dialyzed against the same buffer.
Weitere Reinigung des Enzymsystems ist möglich, indem man die dialysierte Pufferlösung durch einen Ionenaustauscher leitet, vorzugsweise eine Kolonne mit einer dialkylaminoalkylsubstituierten Cellulose. Ein Beispiel für einen derartigen Ionenaustauscher ist Diethylaminoethylcellulose. Praktisch die gesamte enzymatische Aktivität befindet sich während der Chromatographie in der Lösungsmittelfront. Verunreinigungen bleiben in der Kolonne. Das F.luat, welches dieFurther purification of the enzyme system is possible by passing the dialyzed buffer solution through a Ion exchanger passes, preferably a column with a dialkylaminoalkyl-substituted cellulose. A An example of such an ion exchanger is diethylaminoethyl cellulose. Virtually all of the enzymatic Activity is in the solvent front during chromatography. Impurities stay in the column. The F.luat, which the
4S enzymatische Aktivität cnthäl·. wird anstelle der Mikrosomensuspension als Quelle für das Enzymsystem verwendet. 4 S enzymatic activity included. is used instead of the microsome suspension as a source for the enzyme system.
Alle vorstehend erwähnten alternativen Enzymsystempräparate sollten durch ein Antioxidans, ζ. Β. eine kleine Menge Hydrochinon (5 χ 10~4 molar) geschützt werden. D&5 Antioxidans ist nicht notwendig, wenn Mikrosomen als solche verwendet werden.All of the alternative enzyme system preparations mentioned above should be supplemented with an antioxidant, ζ. Β. a small amount of hydroquinone (5 χ 10 ~ 4 molar) to be protected. D & 5 antioxidant is not necessary when microsomes are used as such.
Die Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindung, aus dem Inkubations-Reaktionsgemisch erfolgt mit Hilfe bekannter Methoden. Beispielsweise kann man die enzymatische Reaktion durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels oder eines Lösungsmittelgemisches, welches wenigstens teilweise in Wasser löslich ist, abstoppen. Das Protein, welches sich dabei abscheidet, wird beispielsweise durch Abzentrifugieren entfernt. Das Prostancarbönsäurederivat wird dann durch Ansäuern der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt, worauf eine Extraktion mit einem Fettlösungsmittel, z. B. Chloroform, durchgeführt wird. Die Verdampfung des Fettlösu'.gsmittels ergibt die gewünschte Verbindung, die dann in üblicher Weise, z. B. durch präparative Dünnschichtchromatographie an Silicagel, gereinigt werden kann.The compound according to the invention is isolated from the incubation reaction mixture with Using known methods. For example, you can start the enzymatic reaction by adding an organic Solvent or a solvent mixture which is at least partially soluble in water, stop. The protein that is deposited in the process is removed, for example, by centrifugation. The prostane carbonic acid derivative is then separated off by acidifying the supernatant liquid, followed by extraction with a fat solvent, e.g. B. chloroform, is carried out. The evaporation of the fat solvent produces the desired compound, which then in the usual way, z. B. by preparative thin layer chromatography on silica gel, purified can be.
Die erfindungsgcniiißc Verbindung kann in die pharmakologisch verträglichen Salze umgewandelt werden, indem man sie mit ausreichenden Mengen der anorganischen oder organischen Basen neutralisiert, die die gewünschten Kationen oder Amine enthalten. Die > Umwandlung erfolgt mit Hilfe üblicher Methoden, wobei man die Methode im Einzelfall nach den Löslichkeilseigenschaften des herzustellenden Salzes auswählt. Sollen die anorganischen Salze der genannten Säuren hergestellt werden, so löst man die letzteren in ι« Wasser, welches eine stöchiometrische Menge des Hydroxids. Carbonats oder Dicarbonats. welches dem gewünschten anorganischen Salz entspricht, enthalt. Verwendet man Natriumhydroxid, Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat, so erhält man eine Lösung des is Natriumsalzes des Prostancarbonsäurederivates. Durch Verdampfen des Wassers oder Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels mäßiger Polarität, beispiels- ^■nirA AinAr jjj^dtireri AlksT^!.*· /"w*i'*f Aik-rton^ **rh^U man das feste anorganische Salz. -»The compound of the invention can be converted into the pharmacologically acceptable salts by neutralizing them with sufficient amounts of the inorganic or organic bases which contain the desired cations or amines. The> conversion takes place with the help of conventional methods, the method being selected in each individual case according to the solubility wedge properties of the salt to be produced. If the inorganic salts of the acids mentioned are to be prepared, the latter are dissolved in water, which is a stoichiometric amount of the hydroxide. Carbonate or dicarbonate. which corresponds to the desired inorganic salt contains. If sodium hydroxide, sodium carbonate or sodium bicarbonate is used, a solution of the sodium salt of the prostane carboxylic acid derivative is obtained. By evaporating the water or adding a water-miscible solvent of moderate polarity, for example ^ ■ nirA AinAr jjj ^ dtireri AlksT ^!. * · / " W * i '* f Aik-rton ^ ** rh ^ U one the solid inorganic Salt. -"
Das folgende Beispiel dient der weiteren Erläuterung der Erfindung.The following example serves to further explain the invention.
Beispiel
DHOprostadiensäureexample
DHOprostadienoic acid
Fett- und Bindegewebe werden von Schafsamenblasen entfernt, die sechs Monate bei -20° C gelagert worden waren. Die Drüsen werden anschließend in ein 30%iges Homogenat (Naßgewicht/Volumen) in 0.25mo-Iarer wäßriger Sucroselösung ungewandelt. Das Homogenat wird bei 8500 χ g zentrifugiert, so daß man eine vorläufige überstehende Flüssigkeit erhält, die frei von Kernen und Mitochondrien ist. Diese vorläufige Flüssigkeit wird dann nochmals I Stunde bei 105 000 χ g >> zentrifugiert, wobei die Mikrosomen aus der teilchenfreien Lösung abgeschieden werden. Die gewonnenen Mikrosomen werden in einer Menge einer 0.25molaren wäßrigen Sucroselösung resuspendiert, die der Hälfte der ursprünglichen wäßrigen Sucrosemenge entspricht. Das Ammoniumsulz der E-Telraensäure (50 mg) wird in der leilchenfrcien Flüssigkeit aus 250 g Drüsen gelöst, worauf eine wäßrige Sucrosesuspension von Mikrosomen aus 500 g Drüsen zugefügt wird. Die Mischung wird dann bei 37°C 30 Minuten inkubiert, und zwar unter Schütteln und Zutritt von Luft. Die enzymatische Reaktion wird dann abgestoppt, indem man 7 I einer Mischung aus gleichen Volumenteilen Chloroform und Methanol zusetzt. Das ausfallende Protein wird ab/entrifugicrt. Zu der klaren überstehenden Flüssigkeit gibt man 3 I Chloroform und 2 I wäßrige Ameisensäure (1%). Die Mischung wird mehrere Male invertiert und dann durch Zentrifugieren geklärt. Die Chloroformsrhirht wird abgetrennt und eingedampft, wobei ein Rückstand verbleibt. Der Rückstand wird der präparativcn Dünnschichtchromatographie an Silicagel G (nach Stahl) unter Verwendung von Benzol : Dioxan : Essigsäure (80 : 20 : 2) unterworfen; daran schließt sich eine Ethanolcluierung des DHO-Prostadiensäure-Fraktion und eine Eindampfung des Eluats an; auf diese Weise erhält man das gewünschte Produkt. Fp. 62,8-63,3° C.Fat and connective tissue are removed from sheep semen vesicles that have been stored at -20 ° C for six months. The glands are then converted into a 30% homogenate (wet weight / volume) in 0.25 molar aqueous sucrose solution. The homogenate is centrifuged at 8500 χ g to obtain a preliminary supernatant fluid free of nuclei and mitochondria. This preliminary liquid is then centrifuged again for 1 hour at 105,000 χ g >> , the microsomes being separated from the particle-free solution. The microsomes obtained are resuspended in an amount of 0.25 molar aqueous sucrose solution which corresponds to half of the original aqueous sucrose amount. The ammonium sulfate of E-telraenic acid (50 mg) is dissolved in the lilac-free liquid from 250 g glands, whereupon an aqueous sucrose suspension of microsomes from 500 g glands is added. The mixture is then incubated at 37 ° C. for 30 minutes, with shaking and the admission of air. The enzymatic reaction is then stopped by adding 7 l of a mixture of equal parts by volume of chloroform and methanol. The precipitated protein is removed / entrifugicrt. 3 l of chloroform and 2 l of aqueous formic acid (1%) are added to the clear supernatant liquid. The mixture is inverted several times and then clarified by centrifugation. The chloroform mixture is separated off and evaporated, leaving a residue. The residue is subjected to preparative thin-layer chromatography on silica gel G (according to Stahl) using benzene: dioxane: acetic acid (80: 20: 2); this is followed by an ethanol concentration of the DHO-prostate acid fraction and an evaporation of the eluate; in this way the desired product is obtained. M.p. 62.8-63.3 ° C.
Analyse für CoHuO,Analysis for CoHuO,
Berechaet: C = 68.14 H = 9.15
gefunden: C = 68.04 H = 9.14Calculated: C = 68.14 H = 9.15
found: C = 68.04 H = 9.14
Das NMR-Spektrum ist in Hayashi, M and T. Tanouchi. J. Org. Chem. 38: (H), 2P5 (1973) und Jenny, E. F.. P. Schaublin, H. Fritz und H. Fuhrer. Tetrahedron Leiters 2235 (1974) veröffentlicht.The NMR spectrum is given in Hayashi, M and T. Tanouchi. J. Org. Chem. 38: (H), 2P5 (1973) and Jenny, E. F .. P. Schaublin, H. Fritz, and H. Fuhrer. Tetrahedron Leiters 2235 (1974) published.
Claims (2)
HO1. DHO prostadic acid (PGD 2 ) of the formula
HO
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