DE3107168A1

DE3107168A1 - Nicht-aggregierte loesungen von polypeptiden

Info

Publication number: DE3107168A1
Application number: DE19813107168
Authority: DE
Inventors: A Michael Albisser; William David Lougheed
Original assignee: Hospital for Sick Children HSC
Current assignee: Hospital for Sick Children HSC
Priority date: 1980-02-29
Filing date: 1981-02-26
Publication date: 1981-12-24
Also published as: GB2070620B; ES8206973A1; GB2070620A; DK80781A; NL8100916A; ES500634A0

Description

Nicht-aggregierte Lösungen von Polypeptiden

Die Erfindung betrifft eine wäßrige Lösung mit einem pH 6,8 bis 8,0, die ein Polypeptid wie Insulin oder Glucagon in nicht-aggregierter Form sowie das Bicarbo= nat-Ion enthält. !

Es ist wohlbekannt, daß subkutane Insulin-Injektionen die meisten der durch Diabetes mellitus verursachten metabolischen Entgleisungen nicht zu normalisieren vermögen. Im Gegensatz hierzu wurde in den letzten Jahren gefunden, daß Insulin-Infusionen mit Hilfe von Insulin-Verabreichungsmechanismen mit einem geschlossenen Kreislauf oder offenen Kreislauf (closed-loop or openloop insulin delivery mechanisms) eine bemerkenswerte Besserung bei solchen Anomalien bewirken, und dies bereits nach kurzfristiger Anwendung. Systeme mit ge= schlossenem Kreislauf (closed-loop systems) regulieren die Insulin-Zufuhr auf der Grundlage kontinuierlicher Messungen der Blut-Glucose-Konzentration, wohingegen Systeme mit offenem Kreislauf (open-loop systems) die Insulin-Zufuhr nach einem sorgfältig erstellten Behänd= lungsplan regulieren, der üblicherweise eine basale Infusionsrate und erhöhte Insulin-Gaben zu den Mahl= zeiten vorsieht. Eine fast vollständige metabolische und hormonale Normalisierung kann durch vorprogrammier= te intraportale Insulin-Verabreichung erzielt werden.

Die weitere Entwicklung eines implantierbaren künst= liehen endokrinen Pankreas wurde bisher durch die Neigung des in Lösung befindlichen Insulins verhindert, auszufallen und/oder in den Vorratsbehältern der Systeme mit offenem Kreislauf allmählich zu aggregieren. Solche

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Aggregate stören den Insulinfluß und haben schließlich eine klinisch nicht-tragbare Blut-Glucose-Steuerung, und zwar ungeachtet des pH des verabreichten Insulins, zur Folge.

Es wurde gefunden, daß eine gute Glucose-Steuerung nur dann erreicht werden konnte, wenn die Vorratsbehälter und die für die Verabreichung erforderlichen Einzelteile jener Systeme alle ein bis drei Tage ersetzt wurden. Andererseits überwog die Tendenz in Richtung auf eine nicht-tragbare Hyperglykämie.

Die mikroskopische Prüfung der in den Verabreichungs=

systemen aufgetretenen Verstopfungen zeigte amorphe und kristalline Strukturen, die sich aufgrund nachfolponder Analysen als mit immunreaktivem Insulin hoch-angerei= 15 chert erwiesen. Ähnliche optische Untersuchungen zeigten bei Bestrahlung der in den Vorratsbehältern enthaltenen Lösungen mit polarisiertem Licht Suspensionen kristall!= ner oder amorpher Insulin-Aggregate. Die Größe dieser Aggregate nahm mit der Zeit zu, und schließlich akkumu=

j 20 lierten sie und verstopften die Eintrittsöffnungen der engen Katheter, die zum Transport des Insulins von den Pumpen zu den Patienten verwendet wurden. Dadurch stellte sich rasch Eyperglykämie ein, die auch durch Erhöhung

j der Pumpgeschwindigkeit nicht behoben werden konnte, da der Strömungsweg durch die Akkumulation der Aggregate verstopft war; außerdem bestand das Risiko einer Hypo=

! glykämie für den Fall, daß die Verstopfungen durch den J von der Pumpe erzeugten höheren Druck wieder beseitigt wurden. Kormoglykämie wurde erst dadurch wiederherge= stellt, daß alle 3 bis 4- Tage die Pumpe abgeschaltet, die Rohrleitungen gespült und die Vorratsbehälter er= j setzt wurden. !

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Die Durchsicht der Literatur ergibt, daß viele Mechanis=
men oder Faktoren für die Zunahme der Neigung des Insu=
lins zur Aggregation verantwortlich sein können. Dazu
zählen plötzliche Veränderungen des Strömungsweges, der
Bewegung, der fretallionen-Konzentration, ein pH-Abfall
etc. Es gibt Anzeichen dafür, daß, auch wenn unter ge=
eigneten Bedingungen Lösungen von monomeren Einkompo=

nenten-Insulinen formuliert werden können, diese Insu= I linlösungen, außer bei Vorliegen extrem niedriger, d.h.

physiologischer, Konzentrationen, zunehmend aggregieren j

und daß dieser Vorgang bereits wenige Stunden nach Be= j

ginn der Aufbewahrung, und zwar unabhängig von der Auf= j

bewahrungstemperatur, einsetzt. j

j Das konventionelle Verfahren zur Herstellung neutraler '■

; 15 Insulin-Lösungen fürden physiologischen Gebrauch um= J

faßt das Auflösen des Insulins in saurem sterilem Wasser ι bei pH 2,5 bis 2,9 und die anschließende Einstellung

der erhaltenen Lösung auf einen pH 7)0 bis 7»5. Wenn j

Insulin-Lösungen auf diese V/eise angesetzt werden, muß !

■ j

20 das Insulin durch seinen isoelektrischen Punkt, nämlich j

ι pH 5)3 bis 5)4-) hindurchgeführt werden. Es wird ange= ^;

S nommen, daiä während dieser Überführung eine teilweise J

irreversible Aggregation stattfindet; der Grund dafür i

ist, daß Insulin bei pH 7 bis 7)5 weit weniger löslich j

ist als bei pH 2,5 bis 2,9. In der Tat liegt hierin die |

^! Ursache dafür, daß handelsübliches Insulin zunächst : bssser. bei saurem als bei neutralem pH aufgelöst wird.

Hunmehr wurde gefunden, daß es möglich ist, eine Insulin- i

Lösung herzustellen, in der bei pH 6,8 bis 8,0, d.h. !

bei oder nahe dem physiologischen pH, das Insulin weit j

weniger aggregiert und zu einem größeren Teil im mono= I

meren Zustand vorliegt. Dazu wird das Insulin nicht ,

nach seiner Auflösung durch seinen isoelektrischen Punkt I geführt, und dadurch wird jede irreversible Fällung

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•vermieden, die möglicherweise während des Übergangs vom sauren zum neutralen pH auftreten könnte.

Außerdem wurde gefunden, daß ein anderes Polypeptid, nämlich Glucagon, das normalerweise in Wasser bei pH 6,8 bis 8,0 nicht löslich ist, ebenfalls in diesem pH-Bereich aufgelöst werden kann. Im allgemeinen wird Glucagon in kristalliner Form aufbewahrt und erst un= mittelbar vor der subkutanen oder intravenösen Verab= reichung aufgelöst.

Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung neutrale Polypeptid-Lösungen, die durch ein Verfahren unter Aus= Schluß des ersten Schrittes, des Auflösens von Kristallen in saurem oder basischen Medium, hergestellt werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine wäßrige Lösung, die bei pH 6,8 bis 8,0 hergestellt wird und die ein Polypeptid aus der Gruppe des Insulins oder Glucagons in nicht-aggregierter Form sowie das Bicar= bonat-Ion in Konzentrationen von 2 mmolar bis 2,5 molar enthalt.

Das Insulin liegt im allgemeinen in der Lösung in einer Menge von 0,01 bis 500 Einheiten, vorzugsweise von 1 bis 100 Einheiten, pro 1 ml der Lösung vor.

Das Bicarbonat-Ion kann zu der wäßrigen Lösung in Form seiner Salze hinzugefügt werden, wie z.B. der Alkali- oder Ammoniumsalze, oder aber durch Erhöhung des Koh= lenstoffdioxid-Partialdrucks. Es wurde außerdem gefunden, daß es in einer entsprechend gepufferten Lösung möglich ist, die notwendigen Bicarbonat-Ionen durch Verwendung von Säuger-Serum oder einer Komponente des Säuger-Seroms zur Verfügung zu stellen. Diese Komponente des Säuger-Serums, die bei pH 7 elektronegativ geladen ist, wurde aus dem Serum durch Ultrafiltration, Abtrennung der Fraktion mit einem Molekulargewicht unter 500 und wei= tere Behandlung dieser Fraktion gewonnen.

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Zur Herstellung der das Bicarbonat-Ion enthaltenden Serum-Komponente eignet sich Serum, das von Säugern erhältlich ist, wie z.B. menschliches Serum, Hunde-Serum, Schweine-Serum oder Rinder-Serum. Aus einsehbaren Gründen werden menschliches Serum und Hunde-Serum wegen der mit ihrer Gewinnung verbundenen Schwierigkeiten üblicherweise nicht verwendet.

Das Verfahren zur Herstellung der das Bicarbonat-Ion enthaltenden Serum-Komponente umfaßt normalerweise zu= nächst die Gewinnung des frischen Serums aus Tierblut in der Weise, daß man das Blut gerinnen läßt und dann die Serum-Fraktion durch Zentrifugieren abtrennt. Ob= wohl diese Serum-Fraktion ihren Zweck erfüllt, wird es in der Praxis als zweckmäßig angesehen, diese Frak= tion weiter zu reinigen.

Zu diesem Zweck wird das Serum einem Filtrationsprozeß unterworfen, bei dem nur diejenigen Substanzen in das Filtrat gelangen, deren Molekulargewicht unter 500 liegt. Dieses niedermolekulare Produkt wird dann in der Weise weiterbehandelt, daß die negativ geladenen Kompo= nenten abgetrennt werden. Das kann dadurch erreicht werden, daß man das Gemisch aus Komponenten mit niedri= gern Molekulargewicht bei einem pH 7»0 bis 7»5 durch ein positiv geladenes Gel hindurchschickt. Dabei wird die das Bicarbonat-Ion enthaltende Komponente an das Gel gebunden. Nachfolgendes Auswaschen des Gels bei pH 2 bis 4 ermöglicht die Gewinnung eines Extrakts, in dem die Bicarbonat-Ionen enthalten sind. Dieser Extrakt kann zur Herstellung der gewünschten Insulin-Lösungen ver= wendet werden. Aus physiologischen Gründen kann es jedoch wünschenswert sein, diesen niedermolekularen Extrakt noch weiter zu reinigen und dadurch ein höher spezifisches Produkt zu erhalten, das für die Herstellung der Insulin-Lösungen Verwendung finden kann.

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Ein solcher Reinigungsschritt kann in der Weise durchge= führt werden, daß die elektronegativ geladenen Kompo= nenten des Rohextrakts mit Hilfe kontinuierlicher oder stufenweiser pH-Änderung eluiert werden. Dabei können die elektronegativ geladenen Komponenten bei pH 7>5 an ein positiv geladenes Gel gebunden werden; bei der anschließenden Elution werden dann die Fraktionen ge= sammelt, die die im pH-Bereich 2,5 bis 3*5 eluierten Komponenten enthalt en _f die von Gel abgetrennt werden.

Vor dem erwähnten Elutions-Schritt kann der Extiskt mit den Komponenten mit niedrigen Molekulargewichten zum Zweck der Reinigung und Anreicherung noch weiter be= handelt werden, so zum Beispiel in der Weise, daß man ihn in einem oder in mehreren Schritten der Ultrazen= trifugation unterwirft.

Die Herstellung der die Bicarbonat-Ionen enthaltenden Komponente aus dem Serum wird durch die folgenden Bei= spiele weiter erläutert.

Beispiel 1

Frisches Serum wurde durch ein poröses Amicon^'-Filter filtriert, das nur Substanzen mit einem Molekularge= wicht unter 500 passieren ließ. Das aufgefangene Eluat der Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht wurde dann durch eine mit Diethylaminoethylcellulose [DEAE-Cellulose] befüllte Kolonne geschickt, die in üb= licher Weise gepackt worden war. Zum Schutz der kleinen Peptide wurde eine 0,01 bis 0,1 M Lösung von 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol [nachfolgend als "Tris" bezeichnet] in einer normalen (0,9 %) Kochsalz-Lösung benutzt, um das Gel in der Kolonne zu suspendieren. Der pH des Gels in der Kolonne wurde zwischen 7,0 und 7,5 gehalten. Das erwähnte niedermolekulare Produkt

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wurde unter Benutzung einer 0,1 bis 0,01 M Tris-Lösung in normaler (0,9 #) Kochsalz-Lösung als hydrostatischer Säulenkopf durch die Kolonne geschickt. Die bei diesem pH negativ geladenen Komponenten wurden an das positiv geladene Gel gebunden, während alle anderen Bestand= teile eluiert wurden. Dann wurde das Gel der Säule ent= nommen und langsam 0,01 M HCl hinzugefügt, bis der pH des Gels auf 2,5 gesunken war. Die erhaltene Lösung wurde anschließend mindestens 5 Minuten mit 25 000 g zentrifugiert, wobei sich das Gel als kompakter Boden= satz im Zentrifugengefäß sammelte. Der Überstand wurde danach abpipettiert und weiter gereinigt, zuerst durch 30-minütiges Erhitzen auf 100 ⁰C im geschlossenen Gefäß und anschließend durch 4-stündiges Ultrazentrifugieren mit 125 000 g. Der überstand am Ende dieses Verfahrens= Schrittes enthielt ausschließlich die hitzebeständigen Komponenten des Serums mit einem Molekulargewicht unter 5OQ, die bei pH 7 bis 7,5 negativ geladen sind.

Beispiel 2

Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde wiederholt, und der dabei erhaltene Überstand wurde durch fraktionierende Elution unter kontinuierlicher oder stufenweiser pH-Änderung weiter gereinigt, wobei der Überstand wieder in genau der gleichen V/eise an ΏΕΑΕ gebunden wurde, die in Beispiel 1 beschrieben wurde. Dann wurden Lösungen von 0,1 M Tris in bakteriostatischem Wasser durch die Säule geschickt. Dabei wurde der pH unter Verwendung von Salzsäure schrittweise in Intervallen von 0,5 pH-Einheiten von pH 7,5 auf pH 2,5 gesenkt und jede Frak= tion einzeln aufgefangen. Die Fraktionen zwischen pH 2,5 und 3,5 wurden vereinigt und dann der pH dieser Mischung durch Zusatz von Ammoniumhydroxid auf 7,5

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erhöht. Dabei wurde ein konzentrierter, relativ reiner Extrakt erhalten.

Vor Ausführung der in den Beispielen erwähnten Verfahrensschritte ist es möglich, die größeren Proteine und Lipide vor dem Ultrafiltrationsschritt leicht und rasch abzutrennen, so daß dadurch die Ultrafiltration etwa fünfmal schneller durchgeführt werden kann. Zu diesem Zweck wird das gesamte Serum in eine 2:1 -Mischung von Chloroform und Methanol eingebracht. Die Flüssigkeit wird gemischt und 15 Minuten lang absitzen lassen. Das Methanol, das die gewünschte Fraktion enthält, wird ab= pipettiert. Dann werden Methanol und Ethanol hinzuge= fügt, so daß die Lösung einen Alkohol-Gehalt zwischen 40 und 70 # besitzt. Die Lösung wird 10 Minuten mit 25 000 g zentrifugiert, und der überstand wird abpi= pettiert. Das Produkt kann dann als Ausgangsmaterial für Beispiel 1 oder Beispiel 2 eingesetzt, werden.

Die gleichen Ergebnisse können dadurch erhalten werden, daß man langsam den pH des gesamten Serums in Inter= vallen von 0,5 pH -Einheiten von 7,5 auf 2,5 erniedrigt und in ^eder einzelnen Fraktion den Niederschlag vom überstand (aktiver Teil) durch Zentrifugieren trennt. Durch Vereinigung der Überstände erhält man eine Lösung, die schneller dem in Beispiel 1 umrissenen Verfahren unterworfen werden kann.

Die Fähigkeit derjenigen Verbindungen, die in Lösungen Bicarbonat-Ionen bereitzustellen befähigt sind, Insulin (und andere Polypeptide wie Glucagon) aufzulösen, wurde mit Hilfe einer einfachen reproduzierbaren Unter= JO suchungsmethode nachgewiesen, mit der die Auflösungs= zeiten von Zink-Insulin-Kristallen gemessen wurde, die verschiedenartigen wäßrigen Lösungen ausgesetzt wurden,

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einschließlich solcher Lösungen, die Bicarbonat-Ionen enthielten! Der Test wurde folgendermaßen durchgeführt: Mit Hilfe einer Nadelspitze (25 G needle) wurden Schwei* ne-Insulin-Kristalle auf einen reinen Objektträger ge= bracht und so verteilt, daß "10 bis 30 Kristalle über das mikroskopische Blickfeld verteilt waren. Ein ali= quoter Anteil von 25 pl der Probelösung wurde mit der Pipette so aufgetragen, daß er in Form eines Tröpfchens die Kristalle bedeckte. In den meisten Fällen verblie= ben die Kristalle nach Zugabe der Probelösung auf der Oberfläche des Objektträgers. In denjenigen Fällen, in denen die Kristalle von der Oberfläche ab- und in die Lösung hineingeschwemmt wurden, wurden wegen der damit verbundenen Erhöhung der Auflose-Geschwindigkeit die Ergebnisse verworfen. Die pH -Werte der Probelösungen wurden gemessen und, falls erforderlich, durch Zusatz voniNNaOH oder 1 N HGl auf pH 7,5 eingestellt.

Tabelle 1 zeigt die Auflösungszeiten (angegeben als Mittelwert ± SEM) verschiedener Verbindungen in ver= schiedenen Konzentrationen.

Tabelle 1

Verbindung

25 Natrium-Katrium-Kalium-Ämmonium-Lithium-

30 Kohlensäure

Bicarbonat

Auflösungs=	SEM	5	Konzentration	mmol/1
zeit ±	)	20		mmol/1
'(Sek."			Il
50 +		150	ti
360 +		25	It

II
ti

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	Verbindung	- 12 -	3107168	I	unverdünnt
		rabelle 1 (Fortsetzung)		0,9 % NaCl
	Milchsäure	Auflösungs= zeit + SuM	Konz entration
	Ameisensäure	(s)
5	Natriumpyruvat	>1200	150 mmol/1
	Taurin	>1200	II
	L-Prolin	Il	physiologisch _t
	Prolin	It	ti
	Cystin	It	It
10	Cystein	ti	Il
	L-Asparaginsäure L-Serin	tt	It
	L-Threonin	M	ti
	L-Glutamin	It s^ Carboxyl- "^ Endgruppe "	tt tt
15	L-Alanin	ti	Il
	L-Methionin	ti	Il
	L-Isoleucin	tt	It
	L-Leucin	Il	ti
	Lysin	π	tt
20	Ornithin	ti	tt
	Histidin	ti
	tt	ti
	tt	ti
25	Menschliches Serum 212 + 7 (nach Fasten)	physiologisch
	Harnstoff	20 % bei 300Sek.25 mmol/1
	Destill. H₂O	Null bei 1800
	Ringer's Lactat	It
30	Normale Koch= Salzlösung	Il

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Entsprechende Untersuchungen wurden mit der die Bicar= bonat-Ionen enthaltenden Komponente durchgeführt, die aus dem Serum gewonnen wurde. In allen Fällen lösten sich die Zink-Insulin-Kristalle binnen 1 bis 3 Minuten auf. Alle die hochgereinigten Serumkomponenten, die nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren erhalten wurden, zeigten kürzere Auflösungszeiten von 40 bis 50 Sekunden.

Das Polypeptid Glucagon wurde wie oben beschrieben ge= testet, wobei die die Bicarbonat-Ionen enthaltende gereinigte Serum-Komponente verwendet wurde. Sämtliche Kristalle lösten sich in 120 bis 140 Sekunden auf. Eine 150 mmolare Lösung von Natriumbicarbonat in destillier= tem Wasser (pH 7,5) löste das Glucagon in 45 +, 12 Se= künden auf. Demgegenüber wurde nach 30 Minuten noch keine Auflösung in destilliertem Wasser, Ringer's Lactat, normaler Kochsalzlösung oder einer Lösung von 5 °/> menschlichem Serum-Albumin in normaler Kochsalz= lösung, alle bei pH 7,5, beobachtet.

Die Addition von 1 bis 1,5$ der Serum-Fraktion zu den Insulin-Lösungen hat bisher 27O Tage einer kontinuier= liehen Infusion ermöglicht. Es hat keinerlei Verstopfung der Verabreichungssysteme stattgefunden. Die Lösung im Vorratsbehälter wurde regelmäßig unter 400-facher Ver= größerung untersucht, und keinerlei Insulin-Aggregate wurden beobachtet. Demgegenüber wurde vor der Einführung der Anwendung der Serum-Fraktion eine Aggregation spä= testens am dritten oder vierten Tage beobachtet.

Der Zusatz von 0,1 g reinen geätzten Kupfers zu 10 ml einer neutralen Insulin-Lösung mit 5 U/ml verursacht innerhalb von 4 Stunden eine starke, sichtbare Aggrega= tion. Dieser Prozeß wird durch Bewegung und auch durch

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erhöhte Temperatur (37 °C) noch erheblich beschleunigt. Demzufolge ist das Schütteln von Insulin-Lösungen mit 0,01 g/ml Kupfer bei 37 °C eine ausgezeichnete Methode zur Prüfung des "Anti-Aggregations"-Effektes irgend= eines Additivs. Zu diesem Zweck wurden Natrium-bicar= bonat-Lösungen mit den Konzentrationen 2,5 ₅ 25» 250 und 25OO mmolar hergestellt. Als Lösungsmittel diente biostatisches Wasser. Zu jeder Probe wurde neutrales Schweine-Insulin hinzugefügt, so daß sie eine Endkon= zentration von 5 U/ ml besaß. In jedes sterile Röhr= chen mit 10 ml wurde 0,1 g Kupfer eingebracht. Kon= trollröhrchen wurden genau wie vorstehend beschrieben vorbereitet, jedoch ohne Bicarbonat-Zusatz. Die Röhr= chen wurden bei 37 C in einer Schüttelapparatur (Eberback shaker) bewegt. Der Versuch wurde in drei« fächer Ausführung bei pE 7,5 vorgenommen. Alle Kon= trollröhrchen zeigten nach 4- Stunden starke Aggregation. Sämtliche Röhrchen, die Bicarbonat enthielten, sind bisher 35 Tage lang klar geblieben.

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Claims

VON KREISLER SCHÖ'NWALD EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING WERNER PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler+1973 Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr.J.F.Fues,Köin Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipi.-Ing. G. Setting, Köln Dr. H.-K. Werner, Köln DEICHMANNHAUS AM HAUfTBAHNHOF D-5000 KOLN 1 25.2.81 AvK/GP/IM THE HOSPITAL FOR SICK CHILDREN, University Avenue, Toronto, Ontario (Canada). Patentansprüche

1.)Wäßrige Lösung eines Polypeptide aus der Gruppe des Insulins und Glucagons, die Bicarbonat-Ionen in Kon= zentrationen von 2 mmolar bis 2,5 molar enthält.

2. Wäßrige Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid Insulin ist.

3. Wäßrige Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid Glucagon ist.

4. Wäßrige Lösung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bicarbonat-Ionen in der Weise in die Lösung eingebracht v/erden, daß der Lösung diejenigen Komponen= ten des Säuger-Serums zugesetzt werden, die ein Mole= kulargewicht unterhalb von 500 haben.

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Telefon: (0221) 131041 ■ Telex: 8882307 dopa d ■ Telegramm: Dompatent Köln

5- Wäßrige Lösung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Insulin in einer Menge von 0,1 bis 500 Einhei= ten (Units) pro ml der Lösung vorliegt.

6. Wäßrige Lösung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Insulin in einer Pienge von 1 bis 100 Einheiten pro ml der Lösung vorliegt.

7. Wäßrige Lösung nach Anspruch ι _{und 2/} dadurch gekennzeichnet daß das Insulin in nicht-aggregierter Form vorliegt.

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