NL8100916A - Water bevattende oplossingen van polypeptiden. - Google Patents

Description

Λν - * X '— /

Water bevattende oplossingen van polypeptiden.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een water bevattende oplossing met een pH van 6,8 tot 8,0, die een polypeptide zoals insuline of glucagon in gedisaggregeerde vorm en het waterstofcarbonaation bevat.

5 Het is bekend, dat subcutane injecties met insuline tekort schie ten bij het normaliseren van de meeste metabolische stoornissen van diabetes mellitus. Daarentegen werd in de laatste jaren gevonden, dat insuline, dat ingegeven wordt door insuline-leveringsmechanismen van het gesloten of open-lustype vele onregelmatigheden opmerkelijk verbe-10 tert, zelfs na korte tijd toepassing. Systemen met gesloten lus reguleren de insuline-afgifte op basis van continu gemeten bloedglucosecon-centraties, terwijl systemen met open lus de insuline-afgifte regelen volgens een zorgvuldig geselecteerd schema, dat gewoonlijk een fundamentele infusieverhouding inhoudt, die bij etenstijd wordt versterkt.

15 Hen bijna volledige metabolische en hormonale normalisering kan bereikt worden met een voorgeprogrammeerde intra-portale insuline-afgifte.

De verdere ontwikkeling van een implanteerbare kunstmatige endocrine pancreas is verhinderd door de geneigdheid van insuline-oplossin-gen te precipiteren en/of geleidelijk te aggregeren in de reservoirs 20 van de systemen met open lus. Dergelijke aggregaten verstoren de insu-linestroom en resulteren eventueel in een klinisch onaanvaardbare bloedglucoseregeling, ongeacht de pH van het toe te dienen insuline.

Gevonden werd, dat een goede glucoseregeling alleen bereikt wordt, wanneer de reservoirs en afgiftecomponenten van deze systemen elke êên 25 tot drie dagen vervangen worden. Anders overheerst een neiging tot onaanvaardbare hyperglycemie.

Microscopisch onderzoek van de in de afgiftesystemen gevormde belemmeringen openbaarden amorfe en kristallijne structuren, die na analyse sterk geconcentreerd bleken te zijn met immunoreactief insuline.

30 Een soortgelijk optisch onderzoek van de oplossingen, die in het reservoir aanwezig waren, vertoonden bij belichting met gepolariseerd licht suspensies van kristallijne en amorfe aggregaten van insuline. De afmeting van deze aggregaten nam toe met de tijd en tenslotte accumuleerden en belemmerden deze aggregaten de ingangen van de smalle catheters, die 35 gebruikt worden om de insuline van de pompen naar de patiënten over te brengen. Dit resulteerde snel in hyperglycemie, die niet kon worden opgeheven door de pompsnelheid te vergroten, omdat de stromingsweg belemmerd was door de accumulatie van aggregaten en er was een hypoglyce- 81 009 1 6 ^ Ar 2 mie-risico, wanneer de belemmeringen werden verwijderd door de toegenomen druk, die met de pomp werd ontwikkeld. Normoglycemie werd hersteld door de pomp los te koppelen, de buizen door te spoelen en de reservoirs elke 3 tot 4 dagen te vervangen.

5 Een literatuuroverzicht openbaart, dat vele mechanismen of factoren verantwoordelijk zijn voor de vergroting van de geneigheid van insuline te aggregeren. Hieronder zijn plotselinge veranderingen van de stro-minsgweg, beweging, metaalionenconcentratie, pH verlaging, enz. Het blijkt dat, hoewel onder geschikte omstandigheden oplossingen van uit 10 êèn component bestaande monomere insulinen geformuleerd kunnen worden, deze insuline-oplossingen tenzij bij uiterst lage, d.w.z. fysiologische concentraties toenemend aggregeren, beginnend binnen enkele uren na de opslag onafhankelijk van de opslagtemperatuur.

De gebruikelijke werkwijze voor de bereiding van neutrale insuli-15 ne-oplossingen voor fysiologisch gebruik houdt het oplossen in van de insuline in zuur steriel water bij een pH van 2,5 tot 2,9 en daarna de verkregen oplossing op een pH van 7,0 tot 7,5 te brengen. Bij het vormen van insuline-oplossingen op deze wijze dient de insuline door het iso-elektrische punt ervan, namelijk 5,3 tot 5,4, gebracht te worden.

20 Verondersteld wordt, dat enige onomkeerbare aggregatie zal plaats hebben tijdens deze overgang; de rechtvaardiging is, dat insuline veel minder oplosbaar is bij een pH van 7 tot 7,5 dan bij een pH van 2,5 tot 2,9. Het is inderdaad om deze reden, dat handelsinsuline aanvankelijk bij zure in plaats van bij neutrale pH wordt opgelost.

25 Gevonden werd nu, dat het mogelijk is een oplossing van insuline te bereiden, waarin de insuline veel minder geaggregeerd wordt met een grotere hoeveelheid in de monomere toestand bij een pH van 6,8 tot 8,0, d.w.z. bij of nabij de fysiologische pH. Daartoe wordt de insuline niet door het iso-elektrische punt ervan gebracht na oplossing en dit ver-30 mijdt eventuele onomkeerbare precipitatie, die plaats zou kunnen hebben tijdens de overgang van zure tot neutrale pH.

Eveneens werd gevonden, dat een ander polypeptide, namelijk glucagon, dat niet gewoon in water oplosbaar is bij een pH van 6,8 tot 8,0, eveneens kan worden opgelost binnen dit pH-traject. In het algemeen 35 wordt glucagon bewaard in kristallijne vorm en wordt onmiddellijk voorafgaande aan een subcutane of intraveneuze toediening opgelost.

Derhalve is de onderhavige uitvinding gericht op neutrale polypep-tide-oplossingen, die bereid zijn volgens een werkwijze, die de begin-trap van oplossing van kristallen in zure of basische media uitsluit.

40 Dienovereenkomstig geeft de onderhavige uitvinding een water be- 8100916 3 vattende oplossing, bereid bij een pH van 6,8 tot 8,0, die een polypeptide bevat gekozen uit de groep van insuline of glucagon in gedisaggre-geerde vorm en die het waterstofcarbonaation bevat in een concentratie van 2 nmolair tot 2,5 molair.

5 De insuline is in het algemeen in de oplossing aanwezig in een hoeveelheid van 0,01 tot 500 eenheden per ml oplossing, waarbij 1 tot 100 eenheden de voorkeurshoeveelheid zijn.

Het waterstofcarbonaation kan aan de water bevattende oplossing worden toegevoegd in de vorm van zouten ervan, zoals bijvoorbeeld de 10 alkalimetaal- of ammoniumzouten ervan, of door vergroting van de partiële koolstofdioxide-druk. Ook werd gevonden, dat in een geschikt gebufferde oplossing het mogelijk is de noodzakelijke waterstofcarbonaat-ionen te verschaffen door toepassing van zoogdierserum of een component van zoogdierserum, dat van het serum is afgescheiden door ultrafiltra-15 tie, waarbij de fractie met een molecuulgewicht beneden 500 verkregen wordt en vervolgens deze fractie te behandelen, waarbij de component, die elektronegatief geladen is bij pH 7 verkregen wordt.

Het serum, dat geschikt is voor de bereiding van de component, die ' het waterstofcarbonaation bevat, is het serum dat verkrijgbaar is van 20 zoogdieren, zoals bijvoorbeeld menselijk serum, hondeserum, varkensse-rum of runderserum. Het zal duidelijk zijn, dat sera van mens en hond gewoonlijk niet gebruikt zullen worden vanwege de moeilijkheden, die ontmoet worden bij het verkrijgen ervan.

De werkwijze voor de bereiding van de component, die het water-25 stofcarbonaation bevat, houdt gewoonlijk het verkrijgen in van vers serum van het bloed van het dier door het bloed te laten klonteren en vervolgens de serumfractie na centrifugeren te verwijderen. Hoewel deze serumfractie zal voldoen, wordt het algemeen als goede praktijk opgevat deze fractie verder te zuiveren.

30 Tot dit doel wordt het serum vervolgens op een zodanige wijze ge filtreerd, dat alleen die stoffen met een molecuulgewicht kleiner dan 500 passeren. Het produkt met het lage molecuulgewicht wordt vervolgens op een zodanige wijze behandeld, dat de negatief geladen componenten worden afgescheiden. Dit kan bewerkstelligd worden door het produkt met 35 het lage molecuulgewicht door een positief geladen gel te leiden bij een pH van 7,0 tot 7,5. De component, die het waterstofcarbonaation bevat, wordt op deze wijze aan de gel gebonden. Een daaropvolgnde wasbehandeling van de gel bij een pH van 2 tot 4 maakt de verzameling mogelijk van het extract, dat de waterstofcarbonaationen bevat. Dit extract 40 kan vervolgens gebruikt worden voor de bereiding van de gewenste insu- 81 0 09 1 6 .... - 4 line-oplossingen. Om fysiologische redenen echter kan het gewenst zijn dit extract met het lage molecuulgewicht verder te zuiveren en een meer specifiek produkt te verkrijgen, dat gebruikt kan worden hij de bereiding van insuline-oplossingen.

5 Dit kan worden uigevoerd door gradiëntsgewijze of trapsgewijze ρΗ-elutie van de elektronegatief geladen componenten van het onzuivere extract. Dit kan het binden van deze componenten, die bij pH 7,5 elektronegatief geladen zijn, inhouden aan een positief geladen gel en daaropvolgende behandeling ervan op een zodanige wijze, dat die frac-10 ties, die uit de gel tussen pH 2,5 en 3,5 ongebonden komen, verzameld worden.

Voorafgaande aan de elutietrap kan het extract met het lage molecuulgewicht verder behandeld worden om dit te zuiveren en te concentreren, zoals bijvoorbeeld door onderwerping aan een of meer ultracentri-15 fugetrappen.

De bereiding uit serum van de component, die de waterstofcarbo-naationen bevat, zal beter begrepen worden door verwijzing naar de volgende voorbeelden.

Voorbeeld I

R

20 Vers serum werd gefiltreerd door een poreus Amicon filter, die alleen stoffen met een molecuulgewicht kleiner dan 500 laat passeren. Een eluent met laag molecuulgewicht werd verzameld. Dit eluent met laag molecuulgewicht werd vervolgens door een kolom geleid, die gevuld was met diethylaminoethylcellulose (DEAE cellulose). De kolom was op de 25 gebruikelijke wijze gevuld. Teneinde de kleine peptiden te beschermen werd 0,01 tot 0,1 molair 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propaandiol (hierna aangeduid als Tris) in normale (0,9 %) zoutoplossing gebruikt om de gel in de kolom te suspenderen. De pH van de gel in de kolom werd tussen 7,0 en 7,5 gehouden. Het produkt met laag molecuulgewicht werd door 30 de kolom gevoerd onder toepassing van 0,1 tot 0,01 molair Tris in normale (0,9 %) zoutoplossing als de hydrostatische kop voor de kolom.

De componenten, die bij deze pH negatief geladen waren, werden aan de positief geladen gel gebonden, terwijl alle andere bestanddelen ge-ëlueerd werden. De gel werd vervolgens uit de kolom verwijderd en 0,01 35 molair HC1 werd langzaam toegevoegd tot de pH van de gel tot 2,5 was verminderd. Deze oplossing werd vervolgens gefiltreerd bij 25.000 g gedurende 5 minuten. De bovenstaande laag werd vervolgens afgepipetteerd; de gel was tijdens het centrifugeren onderin het reservoir verdicht.

Het bovenstaande extract werd verder gezuiverd door in een gesloten re-40 servoir 30 minuten tot 100°C te verhitten, gevolgd door ultracentrifu- 81 009 1 6 5 geren bij 125.000 g gedurende 4 uren. De bovenstaande laag van het proces bevatte bij dit punt slechts de tegen warmte stabiele componenten van het serum, die een molecuulgewicht hebben kleiner dan 500 en negatief geladen zijn bij een pH van 7 tot 7,5.

5 Voorbeeld II

Voorbeeld I werd herhaald en de daarbij verkregen bovenstaande laag werd verder gezuiverd door gradiëntsgewijze of trapsgewijze pH elutie, waarbij de bovenstaande laag opnieuw gebonden werd aan DEAE op een identieke wijze zoals beschreven in voorbeeld I. Oplossingen van 10 0,1 molair Tris in bacteriostatisch water werden vervolgens door de kolom geleid. De pH werd geleidelijk verminden! onder toepassing van wa-terstofchloride van 7,5 tot 2,5 met intervallen van 0,5 en elke fractie werd verzameld. De fracties tussen pH 2,5 en 3,5 werden vervolgens gemengd. De pH van het mengsel werd met ammoniumhydroxide op 7,5 ge-15 bracht. Een geconcentreerd relatief zuiver extract werd vervolgens verkregen.

Voorafgaande aan de uitvoering van de voorafgaande voorbeelden is het mogelijk snel en gemakkelijk de grotere proteïnen en lipiden voorafgaande aan de ultrafiltratietrap te verwijderen en dit maakt het mo-20 gelijk dat de ultrafiltratie ongeveer vijf maal sneller wordt uitgevoerd. Teneinde dit te bewerkstelligen wordt het gehele serum toegevoegd aan een 2:1 mengsel van chloroform en methanol. Deze oplossing wordt gemengd en krijgt 15 minuten de tijd uit te zakken. De methanol, die de gewenste fractie bevat, wordt afgepipetteerd. Methanol en etha-25 nol worden vervolgens toegevoegd om een oplossing te geven met een alcoholgehalte tussen 40 en 70 %. De oplossing wordt 10 minuten gecentrifugeerd bij 25.000 g en de bovenstaande laag wordt afgepipetteerd. Het produkt kan als uitgangsprodukt gebruikt worden voor voorbeeld I of voorbeeld II.

30 Dezelfde resultaten kunnen bereikt worden door langzame verlaging van de pH van het totale serum van 7,5 tot 2,5 en bij intervallen van 0,5 door afscheiding van het precipitaat van de bovenstaande laag (actieve deel) door centrifugeren. Het verenigen van de bovenstaande lagen geeft vervolgens een oplossing, die sneller verwerkt kan worden onder 35 toepassing van de in voorbeeld I uiteengezette werkwijze.

Het vermogen van de verbindingen, die in staat zijn waterstofcar-bonaationen te verschaffen in oplossingen om insuline (en andere poly-peptiden zoals glucagon) op te lossen, is bepaald door een eenvoudig reproduceerbare proef, die de oplostijden meet van zinkinsulinekristal-40 len, die worden blootgesteld aan verschillende water bevattende oplos- 8100916 * - F _ 5- ^ 6 singen, inclusief oplossingen die waterstofcarbonaationen bevatten. De proef omvat het overbrengen van varkensinsulinekristallen op een schoon microscoop-objectglaasje onder toepassing van de punt van een naald 25 G, zodat 10 tot 30 kristallen verdeeld werden in het gezichtsveld.

5 Een hoeveelheid van 25/ul van de proefoplossing werd gepipetteerd voor het vormen van een kleine druppel, die de kristallen bedekte. In de meeste gevallen bleven de kristallen op het oppervlak van het ob-jectglaasje na de toevoeging van de proefoplossingen. In die gevallen, waarbij de kristallen omhoog dreven in de oplossing werden de resulta-10 ten afgedankt aangezien dit de oplosmate vergrootte. De pH's van de proefoplossingen werden gemeten en de eerstgenoemden werden waar geschikt op een pH van 7,5 ingesteld onder toepassing van 1 N NaOH of 1 N HC1.

Tabel A laat de oplostijden zien (uitgedrukt als het gemiddelde 15 + SEM) van verschillende verbindingen bij verschillende concentraties.

81 009 1 6

. A

7

TABEL A

Verbinding Oplostijd +SEM (sec) Concentratie natrium 50 +5 150 mmol/1 natrium 360 +20 25 mmol/1 kalium v^water sto fcarbonaat " " (HCO3) ammonium " “ lithium

kcjolzuur " M

melkzuur 1200 150 mmol/1 mierezuur 1200 natriumpyruvaat " fysiologisch taurine " fysiologisch L-proline proline

cystine M

L-asparaginezuur " " L-serine eindstandig " " L-treonine <carboxyl " " L-glutamine ” " L-alanine " " L-methionine ” . ” L-isoleucine " L-leucine "

Lysine ornithine M " histidine menselijk serum (Fasting) 212+7 fysiologisch ureum 20 % bij 300 sec 25 mmol/1 gedestilleerd Η£θ nul bij 1800 sec

Ringer's lactaat " onverdund

Normale zoutoplossing " 0,9 % NaCl 8100916 Λ «* 8

Soortgelijke proeven werden uitgevoerd met de component, die waterstof carbonaationen bevatte, die uit serum was verkregen. In alle gevallen losten de zinkinsulinekristallen in 1 tot 3 minuten op. Alle sterk gezuiverde serumcomponenten verkregen volgens de methode van 5 voorbeeld II hadden snellere oplostijden van 40 tot 50 seconden.

Het polypeptide glucagon werd zoals hiervoor beproefd onder toepassing van de gezuiverde component uit serum, dat de waterstofcarbo-naationen bevatte. Alle kristallen losten in 120 tot 140 seconden op.

Een 150 mmol oplossing van natriumwaterstofcarbonaat (pH 7,5) in gedes-10 tilleerd water loste het glucagon op in 45+12 seconden. Echter werd geen oplossing waargenomen na 3Ó minuten in gedestilleerd water,

Ringer's lactaat, normale zoutoplossing of 5 % menselijk serum albumine in normale zoutoplossing, alle bij pH 7,5.

De toevoeging van 1 tot 1,5 % van de serumfractie aan de insuli-15 ne-olossingen heeft de vastlegging van 270 dagen continue infusie mogelijk gemaakt. Geen verstopping van de afgiftesystemen is voorgekomen.

De oplossing in het reservoir is regelmatig onderzocht onder een vergroting van 400x en geen insuline-aggregaten zijn waargenomen. VSör de uitvoering van het gebruik van de serumfractie werd aggregatie waarge-20 nomen op de derde of vierde dag.

De toevoeging van 0,1 g schoon geëtste koper aan 10 ml van 5 een-heden/ml bevattende neutrale insuline-oplossingen veroorzaakt een ernstige zichtbare aggregatie binnen 4 uren. Zowel beweging als verhoogde temperaturen (37°C) versnellen het proces sterk. Schudden van insuli-25 ne-oplossingen bij 37°C, die 0,01 g/ml koper bevatten, is dus een uitstekende methode voor het onderzoeken van het "anti-aggregatie" effect van een of ander toevoegsel. Tot dit doel werden natriumwaterstofcarbo-naatoplossingen met concentraties van 2,5, 25, 250 en 2.500 mmolair bereid. Biostatisch water werd als verdunningsmiddel gebruikt. Neutraal 30 varkensinsuline werd aan elk toegevoegd om een eindconcentratie te geven van 5 eenheden/ml. Aan elk steriel flesje van 10 ml werd 0,1 g koper toegevoegd. Controleflesjes werden op exact dezelfde wijze samengesteld zoals hiervoor, evenwel werd geen waterstofcarbonaat toegevoegd.

De flesjes werden op een Eberback schudder bij 37°C geroerd. De proef 35 werd in drievoud bij een pH van 7,5 uitgevoerd. Alle controleflesjes vertoonden een sterke aggregatie na 4 uren. Tot op heden bleven alle flesjes, die waterstofcarbonaat bevatten, 35 dagen schoon.

8100916 M __

Claims (7)

1. Water bevattende oplossing, die een polypeptide, zoals insuline of glucagon en het waterstofcarbonaation in een concentratie van 2 mmo-lair tot 2,5 molair bevat.

2. Oplossing volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het poly peptide insuline is.

3. Oplossing volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het polypeptide glucagon is.

4. Oplossing volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het water-10 stofcarbonaation in de oplossing is gebracht door de toevoeging aan de oplossing van de componenten van zoogdierserum met een molecuulgewicht lager dan 500.

5. Oplossing volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de insuline aanwezig is in een hoeveelheid van 0,1 tot 500 eenheden insuline per ml 15 oplossing.

6. Oplossing volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de insuline aanwezig is in een hoeveelheid van 1 tot 100 eenheden insuline per mL oplossing.

7. Oplossing volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de insuline 20 aanwezig is in gedisaggregeerde vorm. 8100916 m