DE3045287T1 - Isotopically labeled vitamin d derivatives and processes for preparing same - Google Patents

Description

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WISCONSIN ALUMNI RESEARCH FOUNDATION 20 773

614 North Walnut Street,

Madison, Wisconsin 53707 / V.St.A.

Be s ehre ibung

Isotopisch markierte Vitamin-D-Derivate und Verfahren zu deren

Herstellung

Die Erfindung "betrifft isotopisch markierte Vitamin-D-Derivate.

Insbesondere betrifft die Erfindung radiomarkierte Vitamin-D-Derivate mit hoher spezifischer Wirksamkeit und Vitamin-D-Verbindungen, markiert mit den stabilen, schweren Isotopen von Kohlenstoff und Wasserstoff.

Vitamin D, ist ein wohlbekanntes Mittel zur Steuerung der Calcium- und Phosphor-Homöostase. Es ist bekannt, daß diese Verbindung beim normalen Tier oder Menschen den intestinalen

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Caiciumtransport und die Knochencalcium-Mobilisierung stimuliert und wirksam bei der Verhinderung von Rachitis ist.

Es ist auch wohlbekannt, daß,um wirksam zu sein, Vitamin D^ in vivo in seine hydroxylierten Formen umgewandelt werden muß. Beispielsweise wird das Vitamin zuerst in der Leber hydroxyliert unter Bildung von 25-Hydroxy-Vitamin-D, und wird weiter in der Niere hydroxyliert unter Bildung von 1oc,25-Dihydroxy-Vitamin-D, oder 24,25-Dihydroxy-Vitamin-D,. Die 1a-hydroxylierte Form des Vitamins wird im allgemeinen als die physiologisch aktive oder hormoneile Form des Vitamins und als verantwortlich dafür angesehen, was als die Vitamin D-artigen Wirksamkeiten bezeichnet wird, wie die Verstärkung der intestinalen Absorption Von Calcium und Phosphat, die Mobilisierung von Knochenmineral und die Zurückhaltung von Calcium in den Nieren. ■

Wesentlich für die Aufstellung der vorstehend erwähnten Fakten war die Zugänglichkeit einer Vielzahl von radiomarkierten Vitamin-D-Derivaten (vergleiche beispielsweise Suda et al., Anal. Biochem., 43_, 139 (1971), Neville und DeLuca, Biochemistry, £, 2201 (1966), Jones et al., Biochemistry, 14_, 1250 (1975), Bell und Scott, J. Label. Compds., % 339 (1973), DeLuca et al., Arch. Biochem. Biophys., 124, 122 (1968) und lamada et al., Anal. Biochem., 8J>, 34- (1978)). Jedoch wiesen derartige radiomarkierte Verbindungen entweder eine geringe spezifische Wirksamkeit (0,2 bis 10,6 Ci/mMol) auf und/oder erforderten mühsame Synthesen.

Die Erfindung betrifft isotopisch markierte Vitamin-D-Verbindungen und insbesondere bestimmte radiomarkierte Vitamin-D-Derivate (Hadiotracer) , gekennzeichnet durch sehr hohe spezifische Aktivität sowie ein wirksames und vielseitiges Verfahren zur Synthese derartiger Verbindungen.

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Insbesondere betrifft die Erfindung 26,27-radiomarkierte Derivate von 25-Hydroxycholecalciferol (25-OH-D,) und 1 cx,25-Dihydroxycholecalciferol (1 oc,25-(OH)₂Dx) und die 24-Hydroxyanalogen dieser Verbindungen, charakterisiert durch spezifische Aktivitäten von bis zu 160 Ci/mMol.

Das Verfahren der Erfindung bietet eine Anzahl von Vorteilen:

1. Einführung des gewünschten Isotops als letzte Stufe der Synthese mit den Radionukliden;

2. Die Vermeidung von Unsicherheiten, Unzuverlässxgkeiten und der großen praktischen Schwierigkeiten und Gefahren, die der Handhabung von Radionukliden durch eine mehrstufige chemische Synthese innewohnen;

3· Die Herstellung von radiomarkierten Verbindungen mit sehr

hoher spezifischer Aktivität;
4. Die Einführung jeglichen Isotops von Kohlenstoff oder Was-

1 ⁷I 14 ? ^

serstoff, zum Beispiel -Ό, G und H und ^H kann leicht erzielt werden.

Die erfindungsgemäßen radiomarkierten Vitamin-D-Derivate finden bequem Anwendung bei der Bestimmung von Vitamin-D-Metabolitgehalten im Blut und im Gewebe von Menschen und Tieren und können daher von unschätzbarem Wert bei der Bestimmung des Vorhandenseins oder NichtVorhandenseins von Erkrankungszuständen sein, wie Osteomalacie, Osteodystrophieund Hyperparathyroidismus. Beispielsweise sind derartige Verbindungen nützlich bei bekannten Untersuchungen auf 25-OH-D, (Bayard et al., Europ. J. Clin. Invest., 2_, 195 (1972), Belsey et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. , £3_, 554 (1971), Bouilon et al., Clin. Chem., 22, 364 (1976), Edelstein et al., Clin. Sei. Mol. Med., 46, 231 (1974), Eisman et al., Anal. Biochem., 80, 298 (1977), Garcia-JPascual et al., Clin. Chim. Acta, 68, 99 (1976), Haddad und Chyu, J. Clin. Endocrinol, Metab., ^, 992 (1971), Haddad et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 43_, 86 (1976), Jones, Clin. Chem. 24, 287 (1978) und Preece et al., Clin. Chem. Acta, 5_4, 235 (1974)) oder auf 1^,25-(OH)₂D, (Brumbaugh et al., Science, 183, 1089 (197^)₅ Eisman et al., Arch.

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Biochem. Biophys., 176, 235 (1976) und Clemens et al., din. Science MoI. lied., ^4, 329 (1978)) oder für multiple Untersuchungen sowohl von 25-OH-D^ als auch von 1,25-(0HpD₅- sowie von anderen Metaboliten (Caldas et al. , J. Lab. Clin. !led., 21, 840 (1978), Hughes et al., J. Clin. Invest., ^8, 61 (1970)) oder bei den kontinuierlichen Untersuchungen der Vitamin-D-Funktion, bei Bindungs-Protein-Untersuchungen, Target-Gewebe-Rezeptorisolation und Charakterisierung, autoradiografischen Untersuchungen und weiteren Untersuchungen aes Vitamin-D-Metabolismus.

Vitamin-D-Verbindungen, die mit stabilen, schweren Isotopen von Kohlenstoff oder Wasserstoff ( ^C oder H) markiert sind, sind auch nützlich für die Metabolitenanalyse im Blut und Geweben, insbesondere durch massenspektrometrische Methoden, wie gezeigt von Bjorkhem und Holmberg, Clin. Chim. Acta, 68, 215 (1976)).

Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind radiomarkierte Vitainin-D-Verbindungen mit den folgenden allgemeinen Strukturen:

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IL

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worin X ausgewählt ist aus der Gruppe von Wasserstoff, Hydroxy, Alkyl, O-Alkyl oder O-Acyl und worin der Substituent X sowohl die stereochemische R- als auch S-Konfiguration haben kann.

In allen Fällen in dieser Beschreibung und in den Ansprüchen bezieht sich der Ausdruck "Alkyl" auf eine Niedrigalkylgruppe mit etwa 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, sek.-Butyl, Isobutyl, tert.-Butyl, und der Ausdruck "Acyl" bedeutet entweder eine niedrigaliphatische Acylgruppe mit etwa 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen, wie Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl, oder eine aromatische Acylgruppe, wie Benzoyl oder Nitrobenzoyl.

Es versteht sich auch, daß, obwohl die vorstehenden Formeln so gezeichnet sind, daß sie Tritium oder Kohlenstoff-14 als die schweren Isotope einschließen, derartige Verbindungen worin Deuterium und Kohlenstoff-13 an die Stelle des Tritiums und Kohlenstoff-14 getreten sind, ebenfalls sehr angestrebt werden.

Die isotopxsch markierten Verbindungen gemäß der Erfindung werden bequem hergestellt nach einem Verfahren, das die Behandlung eines Esters von 24—X-26,27-Dinor-Vitamin-D-25-carbonsäure (worin X die vorstehend angegebene Bezeichnung hat) oder eines Esters der 1ot-Hydroxy-24-X-26,27-Dinor-Vitamin-D-25-carbonsäure,

χ 14.

mit einem Grignard-Reagens, wie CrH₂₁MgBr oder CH,MgBr, oder

χ 14 ^ anderen Alkylmetallen, wie C-\EULi oder CH_xLi oder den analo-

13 ^

gen deuterierten oder -"X-markierten Grignard- oder Methyllithium-Eeagentien, einbezieht. Beispiele für Substrate sind V, VI, VII und VIII nachstehend, worin R eine Alkylgruppe mit etwa 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen darstellt:

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D/l

"XtI

V HI

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Die Herstellung von isotopisch markierten Verbindungen mit den Strukturen I-IV umfaßt somit zwei Phasen: Die Synthese von geeigneten nichtmarkierten Ausgangsmaterialien, ζ. Β. Vitamin-D-Verbindungen vom Typ V bis VIII, gefolgt von der Einführung der gewünschten isotopischen Markierung an den 26- und 2^r/-Steilungen.

Die gewünschten Vitamin-D-Verbindungen V-VIII können hergestellt werden aus Ausgangsmaterialien, wie den Estern von Homocholensäure oder hydroxysubstituierten Homocholensäureestern, gemäß dem allgemeinen Schema, das in dem Verfahrensschema I gezeigt wird.

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Verfahrensschema I

AO

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In den in dem vorstehenden Schema gezeigten Formeln stellt fi einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis etwa 4- Kohlenstoffen dar, K¹ ist eine AIkoho!schutzgruppe, wie eine Acylgruppe (z. B.

Acetyl oder Benzoyl), X und I können jeweils Wasserstoff oder

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Hydroxyl sein, und X und Y können jeweils Wasserstoff oder O-Acyl sein. Die Herstellung der Verbindungen V-VIII umfaßt dann die Umwandlung der Acyl-geschützten Homocholensäureester (I) (selbst hergestellt durch Acylieren von freien Hydroxygruppen, nach wohlbekannten Acylierungsverfahren, z. B. Behandlung mit Essigsäureanhydrid/Pyridin, oder Benzoylchlorid/ Pyridin) in das entsprechende 5»7-Dien (2), unter Anwendung von beispielsweise der Dehydrogenierungsverfahrensweise von Hunzicker und Müllner (HeIv. Chim. Acta, 61_, 70, (1958)). Die anschließende Entfernung der Acylschutzgruppen durch Hydrolyse unter milden, alkalischen Bedingungen, ergibt den Hydroxyester 3. Dieses Dien wird in das gewünschte Vitamin-D-Produkt nach der wohlbekannten Verfahrensweise umgewandelt durch Bestrahlen mit Ultraviolettlicht, unter Bildung des Prävitamin-D-Zwischenprodukts, das dann thermisch zu dem Vitamin-D-Ester (V bis VIII) isomerisiert wird. Diese Umwandlungen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt (vergleiche beispielsweise US-Patentschriften 3 907 843, 3 741 996 und 3 772 361). Alternativ kann das Acyl-geschützte 5,7-Dien-Zwischenprodukt der Struktur 2 selbstverständlich direkt bestrahlt werden unter Bildung des acylierten Prävitamin-D-Ester-Zwischenprodukts, das dann thermisch isomerisiert wird (d. h. Erwärmen auf 80-90 ⁰C in Anwesenheit einer milden Base (z. B. 10 % KOH/Methanol)), unter Bewirkung sowohl der Umwandlung in die Vitamin 5>6-cis-Trien-Struktur als auch der Entfernung der Acylgruppen unter Bildung der Endprodukte der Struktur V-VIII.

Die Herstellung der Vitamin-D-Ester, V, kann durch direkte Anwendung des vorstehenden Schemas auf Homocholensäureester oder 3-0-Acylderivate davon (z. B. vorstehende Struktur 1, worin K Methyl ist, R Benzoyl ist, X¹ Wasserstoff ist) erzielt werden, die bekannte Verbindungen sind (vergleiche beispielsweise Campbell et al, Steroids, 1£, 567-577 (1969)).

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Die Vitamin-D-Ester der Strukturen VI-VIII können in gleicher Weise hergestellt werden durch Anwendung bekannter Verfahren, wie nachstehend beschrieben.

Ein zweckmäßiges Verfahren zur Herstellung der 1oc-Hydroxyvitamin-D-Ester der allgemeinen Struktur VI und VIII umfaßt die direkte C-1-Hydroxylierung von Verbindungen V oder VII unter Anwendung der allgemeinen Verfahren von Paaren et al. (Proc. Natl. Acad. Sei., ££> 2080 (1978)). Dieses Verfahren wird in dem Verfahrensschema 2 umrissen:

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Verfahrensschema 2:

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In den Strukturen des vorstehenden VerfahrensSchemas, stellt R

1 einen Alkylrest mit etwa 1 bis etwa 4- Kohlenstoffen dar, R bezeichnet eine Acyleinheit, wie Acetyl oder Benzoyl, X kann Wasserstoff oder Hydroxy sein, X kann Wasserstoff oder ein O-Acylsubstituent sein und Z stellt typischerweise einen Alkylrest dar, wie Methyl oder Äthyl, Propyl, usw., obwohl Zwischenprodukte, worin Z Wasserstoff oder eine Acylgruppe (Acetyl, ßenzoyl) ist, ebenfalls für die anschließende Umwandlung geeignet sind, wie in dem Schema gezeigt wird.

Das Verfahren umfaßt die Tosylierung des Hydroxyesters V (oder VII) zu der 3-0~^Tosyl^verbindung, gefolgt von der direkten Solvolyse dieses Tosylats in einem alkoholischen Lösungsmittel (z.B. Methanol, Äthanol, usw.), enthaltend einen geeigneten Puffer, wie Natriumacetat oder Natriumbicarbonat, unter Bildung des Cyclovitamin-Zwischenprodukts 4· (worin Z eine Alkylgruppe entsprechend dem Alkylrest des in der Solvolysereaktion verwendeten Lösungsmittels, z. B. wenn Methanol verwendet wird, Z = Methyl, wenn ein wäßriges Lösungsmittel verwendet wird, Z=H, usw., darstellt). Die Behandlung des Zwischenprodukts 4 mit Selendioxid und Hydroperoxid oder Alky!hydroperoxid (z. B. t-Butylhydroperoxid) führt dann zu dem 1a-Hydroxycyclovitamin-D-Zwischenprodukt 5, das nach Standardmethoden zu 6 acyliert wird. Die Solvolyse der Verbindung 6 in Ameisensäure führt zu einem Gemisch von i-O-Acyl-Vitamin-D-carbonsäureester-5-formiat und dem entsprechenden 5,6-trans-Isomeren. Die Formylgruppewird durch Hydrolyse unter sehr milden Bedingungen entfernt, die die Estergruppen am C-1 oder C-25 nicht hydrolysieren und das Gemisch wird anschließend durch Chromatografie (Dünnschichtoder Hochdruckflüssigkeits-Chromatografie) fraktioniert unter Bildung des reinen 1^a-O-Acyl-Zwischenprodukts der allgemeinen Struktur 7· Die anschließende basische Hydrolyse in alkoholischer Base entfernt die Acylgruppe und ergibt den gewünschten 1u-Hydroxy-Vitamin-D-Ester der Strukturen VI oder VIII. Ester der allgemeinen Struktur VI oder VIII sind neue Verbindungen.

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Eine alternative Herstellung Tür 1 os-Hydroxyverbindungen VI oder VIII aus Homocholensaureestern wird in dem Verfahrensschema umrissen, worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 4- Kohlenstoffatomen darstellt, X Wasserstoff oder Hydroxy Sein kann, R eine Acylgruppe, wie Acetyl oder Benzoyl ist, und X Wasserstoff oder O-Acyl ist. Dieses Verfahren umfaßt die Einführung einer 1cx-Hydroxyfunktion über ein Zwischenprodukt 1a,2a-Epoxy-4,6-dien-3-on-steroid (z. B. Produkt 9), unter Verfolgung der allgemeinen Verfahren von Barton et al., (J. Am. Chem. Soc, ^5, 2748 (1973))· Die Umwandlung der resultierenden 1cc-Hydroxy-5-en-verbindung (Verbindungen 10 und 11) in das 5>7-Dien (z. B. 12) und die anschließende Bestrahlung und thermische Isomerisierung folgen üblichen Verfahrensweisen, die bereits in Verbindung mit dem Verfahrensschema 1 diskutiert wurden, unter Bildung der gewünschten 1a-Hydroxyverbindungen VI oder VIII.

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Verfahrensschema

Π J

coo H

vj: Y= H

YlTi: X-- Oti

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Zur Herstellung von 24-Hydroxyvitainin-D-Estern der allgemeinen Strukturen VII und VIII nach den in den vorstellenden Schemata 1, 2 oder 3 umrissenen Verfahren wird als Grund-Vorlaufer ein 24—hydroxylierter Homocholensäureester benötigt. Derartige Verbindungen können nach verschiedenen Methoden hergestellt werden. Ein zweckmäßiger Veg zu 24-Hydroxycholensäureestern wird im Verfahreneschema 4 veranschaulicht.

Verfahrensschema 4

cocß.

/3.

Oi\

COOR

S

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Af \ ■■: ■■!..Γϊ.-Ο"

Der 22-Aldehyd 13» der leicht aus Stigmasterin nach dem Verfahren von Partridge et al., (HeIv. Chim. Acta, 5J£, 764 (1974)) erhältlich ist, wird kondensiert (Aldolreaktion) mit Brenztraubensäure unter Bildung,nach Verestern,des ungesättigten Ketoesters 14, worin E ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen ist, unter Anwendung von beispielsweise den allgemeinen Verfahren von Eyley und Williams (J. Chem. Soc. Perkin Trans. I., Seite 727 und 731 (1976)). Die Behandlung des Esters 14 mit NaBH^ in Pyridin bewirkt die Reduktion von sowohl der Doppelbindung als auch der Ketogruppe und ergibt den Hydroxyester 15 (vergleiche Eyley und Williams, vorstehend). Die Solvolyse der Verbindung 15 unter Anwendung üblicher Bedingungen (vergleiche beispielsweise Partridge et al., vorstehend) führt zu dem 24-Hydroxy-homocholensäureester 16, worin R ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen ist und R Wasserstoff oder eine Acylgruppe (z. B. Acetyl) sein kann, in Abhängigkeit von den gewählten Solvolysebedingungen.

Die Verbindung 16 kann leicht in den 24-Hydroxyvitamin-D-Ester VII nach dem im Verfahrensschema 1 gezeigten Verfahren umgewandelt werden.

Der Ester VII kann seinerseits als Ausgangsmaterial für die Herstellung des 1 α,24-Dihydroxyvitamin-D-Esters VIII gemäß dem Verfahren des VerfahrensSchemas 2 dienen. Alternativ kann die Verbindung 16 (mit R = H) umgewandelt werden in den 1a,24-Dihydroxyester VIII, nach dem im Verfahrensschema 3 gezeigten Verfahren.

<-^:-24-hydroxylierte Homocholensäureester-Analoge können auch zweckmäßig hergestellt werden aus 24,25-Dihydroxycholesterin oder aus 1a,24,25-Trihydroxycholesterin, die beide bekannte Verbindungen sind (Lam et al., Biochemistry, 1_2, 4851 (1973); Seki et al., Chem. Pharm. Bull. (Japan), 21., 2783-2785 (1973); Ikekawa et al., Chem. Pharm. Bull. (Japan), 2J5, 695-697 (1975)). Die Umwandlung dieser Cholesterinderivate in 24-Hydroxy-homocholensäureester oder 1a,24-Dihydroxyhomocholensäureester wird im Verfahrensschema 5 gezeigt.

Verfahrenssctiema

HO

12

Methode B

S..

2O

ΛΙ

coot:

Methode A

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Die Behandlung einer Methane llös-ung des 24,25-iiihyiroxyGholesterin-Ausgangsmaterials (17» worin Y « Wasserstoff oder Hydroxy ist) mit einem Überschuß einer .gesättigten Me tJa>ano !lösung von Natriummet aperjodat bei Raumteileratür während 2 Stunden führt zu dem erwarteten Spalfeungsprod'tailct, dem 24r-Alde;ihyd 18. Dieses Zwischenprodukt kann (n-ach Schutz der Hydroxyfuinktionen als Silyläther .) direkt mit 2-Lithio~2-methylmercapto-1,3-dithian (Metnode A, Verfahrenssehema 5) alkyliert werden und das resultierende 24-Hydroxy-25-orthotrithioester-Addukt kann direkt in den 24-Hydroxy-homocholensäureester 19 umgewandelt werden durch oxidative Alkoholyse des Orthothioesters. (Seebach, Angew. Chem., 22.» 469-470 (1969); Seeteach, Synthesis, Seite 17-36 (1969); Ellison et al., J. Org. Chem., j>£, 2757 (1972)).

Alternativ (Methode B, VerjPahreibschema 5) fcana das 24-Aldehyd^ Zwisehenprodukt 18 in difts 24-TMöacetal 20 umgewandelt werden durch Behandeln mit 1 ,^PrOrpandjaithiol in Caloroformlösung, die BiF^-Ätherat als Katalysatoi? enthält. Die Reaktion der Verbindung 20 (nach zeitweiligem BlocfcLeren der Hydroxylgruppen als Ätherfunk'tionen, z. B. Trimethyrlsilyläther) mit n-Butyllithium in Tetrahydrofuranlösung bei ni;ö<iriger Temperatur (-20° bis -70 ⁰C) unter Stickstoff- oder Argon-Atmosphäre führt zur Erzeugung des 24-Lithioderivats, d;as direkt eaj*bo^!äthoxyliert werdenkann durch Zusatz eines Überschusses vom Alkylehlorformiat (z. B. Äthylchlorformiat) gemäß: den allgemeinen Verfahren von Corey und Seebach (Angewandte Chemie, 2Z» 1135-1136 (1965)), unter Bildung des 24-Thioke!tal-2!5-carbonsäua?eester-Zwischenprodukts. Die Behandlung dieses Esters mit Hgü/lgClp in wäßrigem Aceton führt zur Hydrolyse des Thioketols unter Bildung des cc-letoesters 21, der direkt mit NaBH^. in Methanol zu dem gewünschten 24-Hydroxy-25-hiomoⁱei|i!ölenS:äuree'e:ter der Struktur 19 (worin R ein Alkylrest mit i-4- Kohlenstoffen ist uad J Vasaerstoff oder Hydroxy ist) reduziert werden. Der Ester 19 (mit Y = Wasserstoff) kann nach geeigneter Acylierung dear Hydroxygruppen (z. B. Acetylieirang odepp Benzoylierung) dann umgewandelt Wenden,in den 24-Hydro3cyvi:|amin-D-Este'r VII nach der Methode ;d es Ye rf ahrens scheiaias 1·, wohingegen der Ester 19 (mit

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Y = Hydroxy) den entspreehseiaden la^ VIII naoih dem gleichen Viör$3ä&ren ergibt.

Aus den Vitamin-D-Estern der Struktur V bis VIII können die gewünschten 26,27-radioimjarkierteiii Vitamin-D-Met&bolite der Strukturen IttIV M eine)?? einzigen Endstufe hea?g;esteilt werden, die darin besteht, die Verbindungen V, VI, VII oder VIII mit einem radiomarkierten Methyl-Grignard-Eeag.ens (ζ. Β. Wethylmagnesiumbromid oder üfet hy !magnesiumj odiLd )). φ&er einem radiomarkierten Methyllithiumreag<ens, zu behaiwielliiii Die folgenden typischen Umwandlungen veranschauliche!! dlsifse ßeak-

und die Vielfalt und den fiahmea djss Verfahrens

(1) V

oder

(2) VI C³H₃MgBr II (X=H)

oder

(3) · V ¹⁴CHoMg Br III (X=H)

oder

(4) VI ¹⁴CH_QMg Br IV (X-H)

oder

(5) VLI C³HoMgBr I (X=QH)

' ■

ι , oder C⁰H₃Li

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(6) VIII _ .Cj³IJMjUU- ]I (X=OII)

(7) VIII ^HCJI₃MgHr IV (X=OlI)

oder

Die Radiomarkierungsreaktionen, die durch die Beispiele (1) (7) vorstehend veranschaulicht sind, können zweckmäßig durchgeführt werden durch Reaktion einer Ätherlösung des entsprechenden Vitamin-D-Esters (z. B. Verbindungen V - VIII) mit einer Ätherlösung des gewünschten radiomarkierten Grignard-Reagens oder Methyllithiumreagens unter Eisbadkühlung, sollte während des Vermischens der Reaktionskomponenten die Reaktion zu heftig verlaufen. Die Reaktion wird anschließend bei Raumtemperatur während eines Zeitraums von etwa 1 Stunde durchgeführt und das radiomarkierte Produkt wird anschließend nach den Standardaufarbeitungsverfahren, die geeignet für Reaktionen vom Grignardtyp sind, isoliert (z. B. Zusatz von iUO oder verdünntem, wäßrigem HILCl und Äther, Abtrennen, Waschen und Trocknen der Ätherphase, gefolgt vom Verdampfen des Lösungsmittels). Die Reinigung des Produkts unter Anwendung beispielsweise der Hochdruckflüssigkeitschromatografie (HPLC) an mikroteilchenförmigen Siliziumdioxidgel-Säulen vervollständige die Synthese. Selbstverständlich ist es wesentlich, daß diese Arbeitsgänge in Laboratorien durchgeführt werden, die für eine sichere Handhabung der Radionuklide mit hoher spezifischer Aktivität ausgerüstet sind. Die Einführung von stabilen Isotopen von Kohlen-

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stoff und Wasserstoff ( ^C, H) wird nach dem gleichen Verfahren erzielt unter Anwendung des entsprechend markierten Methyl-Grignard- oder Methyllithium-Reagens, mit der Ausnahme, daß keine speziellen Strahlen-Sicherheitsyorkenrungen getroffen werden müssen, da die stabilen Isotope keine Strahlungsgefahr aufweisen.

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Die erforderlichen radiomarkierten Reagentien sind erhältlich von Lieferanten für.Radiochemikalien (ζ. Β. New England Nuclear, Boston, Mass.)· Reagentien mit sehr hoher spezifischer Aktivität sind verfügbar (z. B. CrIL₅MgBr 80 Ci/mMol). Die Anwendung derartiger Reagentien in dem vorstehend beschriebenen Verfahren führt beispielsweise zu 26,27-tritiierten Vitamin-D-Met about en der Struktur I oder II mit einer spezifischen Aktivität von 160 Ci/mMol. Derartige Radioaktivitätsgrade wurden bisher auf dem Vitamin-D-Gebiet nicht erzielt und es wäre tatsächlich unmöglich, Verbindungen mit einer derart hohen spezifischen Aktivität nach bisher bekannten und auf diesem Gebiet verwendeten radiochemischen Synthesen herzustellen. Durch die vorstehend beschriebene Radiosynthesemethode werden derartige Herstel-

14-lungen zur Routine. In gleicher Weise können 26,27- C-markierte Metabolite von Strukturen III und IV mit spezifischen Aktivitäten bis zu 120 mCi/mMol hergestellt werden durch Behandeln

14-der Verbindungen V - VIII mit dem entsprechenden C-Grignard-Reagens oder Methyllithiumreagens. Reagentien, die stabile Isotope enthalten, sind auch handelsübliche Produkte, beispielsweise sind Trideuteromethyljodid und ^C-Methyljodid bequem erhältlich und aus diesen Verbindungen werden, wie auf dem Fachgebiet bekannt, die geeigneten Grignard- oder Lithium-Reagentien leicht hergestellt.

Die erfolgreiche direkte Behandlung von seco-Steroiden, wie Verbindungen V bis VIII mit radiomarkierten Grignard-Reagentien und Alkylmetallen hochspezifischer Aktivität unter Bildung radiomarkierter Vitamin-D-Derivate und Analoger ist besonders erwähnenswert und überraschend. Die bekannte Chemie des Vitamin-D- cis-Trien-Chromophors und ihrer 5,5-Cyclovitaminderivate demonstriert, daß diese Verbindungen äußerst empfindlich gegen Licht, Sauerstoff, Metallkomplexbildung, protische und Lewis-Säuren und freie Radikale sind. Sie neigen sehr stark zur Umlagerung und die verfügbaren, angesammelten Anzeichen lassen vermuten, daß die Behandlung von V- VIII mit radiomarkierten Grignard-Reagentien oder Alkylmetallen mit hoher spezifischer Aktivität voraussichtlich eine ungünstige und irreversible

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Änderung des cis-Triensystems ergeben würde als Ergebnis der chemischen Natur der verwendeten Reagentien oder der Reaktionsbedingungen. Auch ergab die starke zu erwartende Strahlung, die von Reagentien mit einer hohen spezifischen Aktivität herrührt (beispielsweise 80 Ci/mMol für C^HJMgBr) Anlaß für die große Wahrscheinlichkeit, daß eine Radiolyse durch Reagentien und eine Autoradiolyse der Produkte auftreten könnte. Es lagen daher unbekannte Faktoren vor, die zu Komplikationen bei der Synthese von radiomarkierten Vitamin-D-Verbindungen nach den hier beschriebenen Methoden führen könnten.

Bisher wurde, obwohl radiomarkierte Vitamin-D-Metabolite notwendige und kritische Instrumente für die Entwicklung des Wissens über das endocrine Vitamin-D-System sind und auch wesentlich für jede der vielen Untersuchungen auf Vitamin-D-Metabolite im Blut und Geweben von Menschen und Tieren sind, keine einzige leichte Methode für die zweckmäßige Einführung von Radionukliden gefunden. Es liegt lediglich ein einziges Beispiel für die Anwendung eines Grignard-Reagens zur Einführung von Tritium vor (Bell und Scott, J. Label. Compounds, 9_, 339 (1973))· Dieses Beispiel bezieht sich jedoch auf ein 1-Desoxyseco-steroid mit einer geschützten 3-Hydroxylgruppe und auf die Anwendung von CrH^MgBr mit nur mäßiger spezifischer Aktivität (10,6 Ci/mMol). Es liegen keine Beispiele für die Reaktion von hochspezifisch aktiven Grignard-Reagentien oder Alkylmetallen mit Estern von 26,27-Dinor-Vitamin-D^-25-carbonsäure oder Estern von 1 a-Hydroxy-26,27-dinor-Vitamin-D;,-carbonsäure mit oder ohne Schutz der Hydroxygruppen des Ringes A vor.

Es gibt zwei Berichte über die Radiosynthese eines Vitamin-D-Metaboliten mit hoher spezifischer Aktivität (78 und 90 Ci/ mMol) (Yamada et al. , Anal. Bio ehem., 8J?, 3^ (1978) und Muccino et al., Steroids, £1_, 64-5 (1978)). In beiden Fällen wurde die Verbindung erhalten durch Tritiieren eines acetylenischen

3 Steroidzwischenprodukts unter Verwendung von ^o mit hoher spezifischer Aktivität zur Einführung des Radionuklids, Bedingungen, die häufig zu einer ungleichmäßigen Verteilung der

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Markierung führen. Beide Synthesen sind schwierig und mühsam und erfordern sieben Stufen nach der Einführung der Markierung, einschließlich der Umwandlung des Steroids in das seco-Steroid. Darüber hinaus sind derartige Verfahren nicht auf die Markierung der Verbindung mit Kohlenstoff-14- anwendbar, noch könnten sie zur Herstellung von Vitamin-D-Verbindungen mit spezifischen Aktivitäten von größer als 120 Ci/mMol verwendet werden.

Die Vorteile der erfindungsgemäßen Verfahren sind: Sie sind anwendbar auf die Einführung von Kohlenstoff-14, Kohlenstoff-13, Deuterium und Tritium; sie führen zu keiner ungleichmäßigen Verteilung der Markierung; sie ergeben (im Fall der Einführung des Radionuklids) Verbindungen mit sehr hoher spezifischer Aktivität (bis zu 160 Ci/mMol); sie führen zu Produkten, in denen die Lokalisation des Isotops eindeutig bekannt ist und worin das Isotop nicht durch Austauschverfahren (im Falle von Wasserstoff isotopen) verloren gehen kann; sie ermöglichen die Einführung des Radionuklids in der letzten Synthesestufe und erhöhen damit beträchtlich die Wirtschaftlichkeit und Vielfältigkeit des Verfahrens und verringern im EaIl von Radionukliden stark die Gefahren, die mit der Synthese von radiomarkiertem Material verbunden sind.

Die Flexibilität.des neuen Verfahrens, dass es die zweckmäßige Einführung jeglichen Isotops von Kohlenstoff oder Wasserstoff ermöglicht, ist tatsächlich ein bemerkenswertes Merkmal der vorliegenden Erfindung. Beispielsweise werden die 26,27-Hexadeutero- oder 26,27-Di -^C-markierten-Vitamin-D^-Metabolite leicht hergestellt aus Vitamin-D-Estern der Struktur V - VIII durch

13 Behandeln mit dem geeigneten deuterierten oder ^C-Grignard- oder Methyllithium-Reagens. Von jedem der Esterausgangsmaterialien vom Typ V bis VIII hat man so die Wahl, in einer einzigen Stufe jede oder alle vier isotopisch markierten Vitamin-D-

■j. Verbindungen herzustellen: die 26,27- H-.Verbindung, die 26,27-

¹⁴C-Verbindung, die 26,27-²H-Verbindung und die 26,27-¹^C-Verbindung. Die Herstellung derartiger Derivate nach bisher bekannten Verfahren würde vier getrennte mehrstufige Synthesen erfordert

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Die Einführung der Isotopenmarkierung als letzte Stufe bringt bestimmte weitere wichtige praktische Vorteile, da sie einen verschwenderischen Verlust an Materialien aufgrund geringer Umwandlungsausbeute vermeidet. Bei der Herstellung von Vitamin-D-Verbindungen aus dem Steroid sind die letzten Stufen, d. h. die Bildung des 5,7-Diens und die anschließende Bildung des seco-Steroids durch Bestrahlung jeweils Umwandlungen mit geringer Ausbeute (z. B. 20-40 %). Wird folglich die Markierung in der Steroidstufe eingeführt, so geht wertvolles Isotopenmaterial verloren und das kostspielige Reagens wird aufgrund dieser Stufen mit niedriger Ausbeute verschwendet. Diese Verluste machen es ,ihrerseits notwendig, daß das Markierungsverfahren in einem relativ hohen Maßstab durchgeführt wird (was die Verwendung großer Mengen an kostspieligem Isotopenreagens erfordert, was besonders unzweckmäßig im Falle großer Mengen an gefährlichem .Radioisotop ist), um brauchbare Mengen des gewünschten radiomarkierten Produkts zu gewinnen. Darüber hinaus erfordert die Isolierung des Produkts aus den Reaktionsstufen mit niedriger Ausbeute, die vorstehend erwähnt wurden, eine sorgfältige und schwierige Chromatografie, die um so mühsamer und unpraktizierbar wird, wenn sie auf stark radioaktive Verbindungen angewendet wird. Das hier beschriebene neue Verfahren schaltet alle diese Probleme aus. Eine Reaktion vom Grignardtyp für die Einführung der Markierung läßt sieh leicht durchführen (selbst mit hochradioaktiven Reagentien) und wenn die Markierung als letzte Stufe eingeführt wird, werden keine weiteren chemischen Handhabungen benötigt und die Isolierung des Produkts erfordert gewöhnlich nicht mehr als eine einzige chromatografische Reinigungsstufe.

Jedes Verfahrensschema, bei dem die Radiomarkierung in einer frühen Stufe eingeführt wird, erfordert die Herstellung des gewünschten radiomarkierten Produkts in Mengen, die derart berechnet sind, daß sie dem erwarteten Bedürfnis nach dem Produkt während eines langen Zeitraums entsprechen, einfach, um die Notwendigkeit zu vermeiden, ein schwieriges und gefährliches Verfahren häufig zu wiederholen. Abgesehen von den zahlreichen

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praktischen Problemen des mehrstufigen Verarbeitens großer Mengen an Radionukliden stellt darüber hinaus die Lagerung der gewünschten Produkte während längerer Zeiträume selbstverständlich einen weiteren großen Nachteil dar, da alle radiomarkierten Materialien zersetzt werden, entweder durch den natürlichen Zerfall des Isotops, der zu einem Verlust an spezifischer Aktivität führt, und/oder durch Radiolyse (insbesondere bei markierten Präparaten mit hoher spezifischer Wirksamkeit), die zu sehr komplizierten Produktgemischen führen kann. Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden diese Schwierigkeiten wirksam überwunden, da die Bildung des radiomarkierten Produkts aus einem stabilen, zweckmäßig hergestellten Vorläufer (d. h. Verbindungen V, VI, VII oder VIII, die unbegrenzt als Kristalle oder in sauerstofffreien Lösungen in der Kälte gelagert werden können) in einer einzigen, leicht wiederholbaren Stufe, die Möglichkeit bietet, die Menge des radiomarkierten Produkts - sowie die Natur des spezifischen, eingeführten Isotops - den jeweiligen unmittelbaren Erfordernissen anzupassen.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt die einzige bisher berichtete Methode dar, die geeignet ist für die Synthese von tritiiertem 25-Hydroxyvitamin-D, mit einer spezifischen Aktivität von größer als 100 Ci/mMol und ist die erste strikt chemische Methode für die Synthese des Schlüsselhormons 1,25-Dihydroxyvitamin-D^ in radioaktiver Form. Die Erzeugung von Vitamin-D-Metaboliten in stark radiomarkierter Form, die Verwendung neuer Vitamin-D-Ester (Verbindungen V, VI, VII oder VIII) als Substrate für die Radiomarkierung, zusammen mit der experimentellen Flexibilität, die technische Einfachheit, die Wirtschaftlichkeit und die Sicherheit sind Schlüsselmerkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens, die es vom Stand der Technik unterscheiden.

Zwar beziehen sich die vorliegende Beschreibung und die Beispiele speziell auf die Verwendung von Vitamin-D-Estern der Strukturen V - VIII, worin der Substituent am Kohlenstoff-24 Wasserstoff oder Hydroxy ist, auf die Herstellung von 26,27-

markierten Vitamin-D-Verbindungen, jedoch ist es offensichtlich,

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if I=Y-U χ-U

daß Vitamin-D-Ester-Analoge, die C-24—Substituenten tragen, wie Alkyl, O-Alkyl oder O-Acyl, in gleicher Weise geeignete Substrate sind, die durch das Isotopen-Markierungsverfahren gemäß der Erfindung zu den entsprechenden 26,27-markierten Vitamin-D-Verbindungen der Struktur I-IV führen können, worin X Alkyl, O-Alkyl bzw. Hydroxy ist.

Acylierte Derivate oder andere O-geschützte Derivate (z. B. O-Silylester) von Vitamin-D-Estern der Struktur V bis VIII sind selbstverständlich geeignete, alternative Ausgangsmaterialien zur Einführung der isotopischen Markierung am Kohlenstoff-26 und 27 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Derartige 0-geschützte Derivate sind als Zwischenprodukte für die Herstellung von Estern V - VIII verfügbar oder werden leicht hergestellt aus Estern V - VIII durch Acylieren oder Silylieren, und ihre Anwendung für die Einführung von Markierungen kann eine selbstverständliche und offensichtliche Erstreckung des hier beschriebenen Isotopenmarkierungsverfahrens darstellen.

Es sei erwähnt, daß bestimmte Zwischenprodukte der Synthesen von Vitamin-D-Estern V bis VIII ebenfalls geeignete Substrate für die Einführung isotopischer Markierungen sind und derartige markierte Zwischenprodukte können anschließend in die markierten Vitamin-D-Substanzen I-IV umgewandelt werden. Beispielsweise ergeben die Cyclovitamin-D-Zwischenprodukte.der Struktur 5 und im Verfahrensschema 2 bei der Behandlung mit dem entsprechend radiomarkierten Reagens vom Grignard-Typ die entsprechende 26,27-markierte 1oc,25-Dihydroxy-24—X-cyclovitamin-D-verbindung, die nach den vorstehend zitierten Verfahren von Paaren et al. leicht umgewandelt werden kann in das 26,27-markierte 1a,25-Dihydroxy-24-X-vitamin-D,. (Verbindungen II oder IV). Das Zwischenprodukt 4 des Verfahrenschemas 2, behandelt in analoger Weise, führt zu 26,27-markiertem 25-Hydroxy-24—X-vitamin-D, (Strukturen I oder III). In gleicher Weise können die 5>7-Dien-Zwischenprodukte der Strukturen 2 oder 3 des Verfahrensschemas 1 umgewandelt werden in 26,27-markierte 5*7-Dien-Steroide, die nach der üblichen Bestrahlungs/thermischen Isomerisierungs-iOlge jegliche

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der Verbindungen I - IV je nach Wunsch ergibt. Da mit derartigen Zwischenprodukten die Einführung der Markierung in einer Stufe erfolgt, die von dem Endprodukt weiter entfernt ist, sind derartige Modifikationen des allgemeinen Verfahrens im allgemeinen nicht bevorzugt. Sie stellen jedoch eine attraktive Alternative unter bestimmten Umständen dar. Beispielsweise kann die Herstellung von 26,27-markierter 1a,25-Dihydroxy-cyclovitamin--D-verbindung aus den Zwischenprodukten 5 oder 6 (Verfahrensschema 2) vorteilhaft sein, wenn sowohl das 5>6-cis- als auch das entsprechende 5»6-trans-26,27-markierte-1a,25-Dihydroxy-24-X-vitamin-D-produkt gewünscht werden, da beide bei der Solvolyse des Cyclovitamins nach den Verfahren von Paaren et al. gebildet werden. In gleicher Weise kann die Einführung der Radiomarkierung in 5>7-Dien-Zwischenprodukte (z. B. Verbindungen 3 oder 12) angezeigt sein, wenn die 26,27-markierten Prävitamin-D-Verbindungen (oder 26,27-markierten Tachysterinverbindungen) gewünscht werden, da letztere Zwischenprodukte der Bestrahlung der 5,7-Diene sind.

In den folgenden Beispielen wurden Ultraviolettabsorptions-(UV)-Spektren in Äthanol mit einem Beckmann Aufzeichnungs-Spektrofotometer, Modell 24 (Beckman Instruments, Fullerton, CaI.) aufgenommen; kernmagnetische Resonanz-(IiMR)-Spektren wurden in CDCl, mit einem Bruker WH-270-Spektrometer (Bruker Instruments, Inc., Wheaton, 111.) erhalten; Massenspektren wurden bei 100 ⁰C über Umgebung mit einem AEI (Associated Electrical Industries) MS-9, gekoppelt ans ein DS^O-Datensystem, erhalten; Hochdruckflüssigkeitschromatografie (HPLC) wurde mit einem Waters Associates Modell ALC/GPC-204 Flüssigkeitschromatografen (Waters Associates, MiIford, Mass.) durchgeführt; Bestrahlungen wurden in einem Quarzreaktionsgefäß mit einer 125 W Hanovia 8A36 Lampe, ausgerüstet mit einem Corex-Filter, durchgeführt; Radioaktivität wurde mit einem Flüssig-Szintillationszähler Packard Modell 3255 (Packard Instrument Company, Inc., Downers Grove, 111.) gemessen. Sephadex LH-20 ist ein Hydroxypropylätherderivat eines Polydextrans, Handelsprodukt der Pharmacia Chemicals,Piscataway, New Jersey; Lipidex 5000 ist ein 50 %

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gesättigtes Hydroxyalkoxypropylierungsprodukt von Sephadex LH-20, mit einer durchschnittlichen Alkoxygruppenkettenlänge von 15 Kohlenstoffen, erhältlich von Packard Instruments, Inc., Downers Grove, 111.; die halbpräparative HPLC-Säule war 0,6 χ 25 cm und war gepackt mit mikroteilchenförmigem Siliziumdioxidgel (5 Mikron Teilchen ), präparative Schichtchromatografie wurde an 20 χ 20 cm Siliziumdioxidgelplatten mit einer Bettdicke von 0,75 oder 0,25 cm durchgeführt.

Die Strukturbezeichnungen in den folgenden Beispielen mit römischen oder arabischen Ziffern beziehen sich auf die in der vorstehenden Beschreibung und den Verfahrensschemata derart identifizierten Strukturen.

Beispiel 1

a) Herstellung von 25-Hydroxy(26,27- H)-vitamin D* (Verbindung I , X-H)

Eine Lösung von 1 mg (2,5 JiMo 1 26,27-Dinorvitamin-D2-25-carbonsäuremethylester (Verbindung V, H = Methyl) in trockenem Äther wird mit einem Überschuß von C^H^MgBr (80 Ci/mMol in Äther während 1 Stunde bei Kaumtemperatur (unter Argonatmosphäre) behandelt. Anschließend wird zu dem Keaktionsgemisch Wasser gefügt, die Ätherschicht wird abgetrennt und die wäßrige Schicht wird zwei weitere Male mit Äther extrahiert. Die vereinten Ätherfraktionen werden mit Wasser und Salzlösung gewaschen, Lösungsmittel wird verdampft und der Rückstand wird gereinigt durch Chromatografie durch Säulen von Sephadex LH-20 (2 χ 50 cm), entwickelt mit CHCl^/Hexan (1:1) und Lipidex 5000 (1 χ 50 cm) unter Verwendung von CHCl,/Hexan (1 : 10) unter Bildung von 32 mCi von 25-Hydroxy-(26,27-⁵H)-Vitamin-D₃ (I, X - H)- Das so gereinigte Produkt (160 Ci/mMol) ist mindestens 96 % rein, bestimmt durch HPLC (0,4-5 χ 25 cm, Säule mit mikroteilchenf örmigem Siliziumdioxidgel, 4- % Propanol in Hexan als Eluierlösungsmittel).

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b) Herstellung von 25-Hydroxy-(26,27-²H₆)-Vitamin-D₃ (Verbindung I, Χ - H)

Deuteriertes Methyl-Grignard-Reagens wird hergestellt durch Zusatz von ²H-,-Methyloodid (60 uMol) in 0,5 ml trockenem Äther zu; Magnesiumspänen (50 uMol). Nach dem Auflösen des Metalls werden 2 mg (5 ,uMol) 26,27-Dinor-Vitamin-D.,-25-carbonsäuremethylester (Verbindung V, R * Methyl) in 0,5 ml Äther zugesetzt und die Reaktion wird bei Raumtemperatur 2 Stunden durchgeführt. Wasser und Äther werden zugesetzt, die Ätherphase wird abgetrennt und die wäßrige Phase wird zweimal mit Äther extrahiert. Die vereinten organischen Phasen werden mit H₂O und Salzlösung gewaschen und über MgSO. getrocknet und das Lösungsmittel wird verdampft. Die Chromatografie des Produkts durch Sephadex LH-20 (2 χ 50 cm, CHCWHexan, 1:1, als Lösungsmittel) und Lipidex 5000 (1 χ 50 cm, CHCl^/Hexan, 1 : 10) ergibt 25-Hydroxy-26,27-hexadeutero-Vitamin-D^. Die Verbindung zeigt ein Maximum von 264- mn. im Ultraviolettspektrum und der Flolekularionen-Peak bei m/e 4-06 bestätigt die Einführung von sechs Deuteriumatomen.

Beispiel 2

a) Herstellung von 1a,25-Dihydroxy-(26,27-%)-Vitamin-D₅ (II, X - H)

Ein großer Überschuß von (^H)-Methylmagnesiumjodid wird frisch hergestellt aus (-⁵H)-Methyl j od id (80 Ci/mMol) und Magnesiumpulver in trockenem peroxidfreiem Äther und wird tropfenweise zu einer gerührten Lösung der Verbindung VI (R =» Methyl) in Äther unter Argon gefügt. Nach beendeter Zugabe wird das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Wasser wird vorsichtig zugesetzt und die wäßrige Phase wird mehrfach mit Äther extrahiert. Die vereinten Ätherphasen werden mit Wasser und Salzlösung gewaschen. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand wird durch azeotrope Destillatio]

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von Wasser mit Benzol getrocknet. Der Rückstand wird in 10 ml Säulenlösungsmittel auf eine Sephadex-LH-20-Säule (2 χ 65 cm) aufgetragen und mit Chloroform/Hexan (13 : 7) eluiert. Das gewünschte Produkt eluiert von 900 bis 1100 ml. Im HPLC (0,62 χ 25 cm mikroteilchenförmige Siliziumdioxidgelsäule) entwickelt mit 12 % 2-Propanol/Hexan, eluiert 1α,25-Dihydroxy-(26,27-⁵H)-Vitamin-D₃ (160 Ci/mMol) bei etwa 52 ml und ist homogen. Das Produkt zeigt ein Ultraviolett absorptionsmaxi,mum bei 263 um; und zeigt ein Molekularion bei m/e 4-28 in seinem Massenspektrum, was die Einführung von sechs Tritiumatomen anzeigt.

b) Herstellung von 1a,25-Dihydroxy-(26,27-²H₆)-Vitamin-D,

Zu einer Ätherlösung von Trideuteromethylmagnesiumjodid, hergestellt wie in Beispiel 1 b) beschrieben, wird 1 mg 1ct-Hydroxy-26,27-dinorvitamin-D^-25-carbonsäuremethylester (Verbindung VI, R = Methyl) in 0,5 ml trockenem Äther gefügt. Nach 1,5 Stunden bei Raumtemperatur wird Wasser zu dem Reaktionsgemisch gefügt und das Produkt wird isoliert durch Extrahieren mit Äther, Waschen und Trocknen der Ätherphasen wie in Beispiel 1 b) beschrieben. Das Produkt wird direkt durch HPLC (0,62 χ 25 cm Säule von mikroteilchenförmigem Siliziumdioxidgel) unter Verwendung von 10 % 2-Propanol in Hexan als Lösungsmittel gereinigt, unter Bildung des 26,27-Hexadeuteroanalogen von 1a,25-Dihydroxy-

vitamin-D, in reiner Form (JL _v 264 nm; Massenspektrum, m/e . y max

422 (M⁺)).
Beispiel 3

Herstellung von 26,27-Dinorvitamin~D;,-25-carbonsäuremethylester (Verbindung V, R = Methyl)

a) Methyl~3ß~hydroxy-25~homo-5,7-choladien-25-oat (3» worin X-Y-H und k - Methyl)

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Methyl-3ß-hydroxy-25-homo-5·-·cholen-25■··■oat-3-··benzoat, 1 (X = Ύ^Λ - H, ß = Methyl, H¹ » Benzoyl) (0,5 g, 0,99 mMol), Natriumbicarbonat (0,55 S, 6,5 mMol) und 1,3-Dibrom-5,5-diniethylliydantoin (0,16 g, 0,56 mMol) in Hexan (10 ml) werden unter Stickstoff 20 Minuten bei 80 ⁰C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend gekühlt und filtriert. Der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels aus dem Filtrat erhaltene Rückstand wird in einer Lösung von 2,4,6-Trimethylpyridin (1 ml) in Xylol (10 ml) gelöst und unter Rückfluß unter Stickstoff 1,5 Stunden erwärmt. Das Reaktionsgemisch wird gekühlt, mit Benzol verdünnt und nacheinander mit 1 η HCl, verdünntem NaHCO,, und Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand wird in einer Lös.ung von p-Toluolsulfonsäure (0,06 g) in Dioxan (12 ml) gelöst und 40 Minuten bei 70 ⁰C erwärmt. Nach dem Kühlen des Reaktionsgemische werden Wasser und Äther zugesetzt. Die Phasen werden getrennt und die organische Phase wird mit verdünntem Natriumbicarbonat, Wasser und Salzlösung gewaschen. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand (Verbindung 2, worin X

1 1

= Y = H, R *= Methyl und R ist Benzoyl) wird gelöst in einem Gemisch von Äther (3,0 ml) und 0,4 m methanolischem Kaliumhydroxid (5 ml). Nach 2,5 Stunden bei Raumtemperatur werden Wasser und Äther zugesetzt und die organische Phase wird abgetrennt und wiederholt mit Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wird verdampft und der Rückstand wird an einer Siliziumdioxidgelsäule (1 χ 15 cm), eluiert mit 25 % Äthylacetat/Hexan, chromatografiert unter Bildung des Produkts Methyl-3ß-hydroxy-25-homo-5,7-choladien-25-oat (3, X-I=H, H- Me) (0,08 g, 0,2 mMol): UV 294, 282, 272, 264 (Schulter) nm; NMR 0,67 (s, 18-CH₅), 1,01 (d, J - 6,5 Hz, 21-CH^), 1,04 (s, 19-CH₅), 3,72 (s, -CO₂CH₃), 5,43, 5,64 (2m, 6H, 7H).

b) Methyl-3ß-hydroxy-25-homo-9,10-secochola-5,7,10(i9)-trien-25-oat. (26,27-Dinorvitamin-D;z-25-carbonsäuremethylester, Verbindung V, R = CH₃).

Eine Lösung von Methyl-3ß-hydroxy-25-homo-5,7-choladien-25-oat (28 mg) in 20 % Äthanol/ßenfPL, (J50/*L) unter Stickstoff,

gekühlt in einem Eisbad, wird mit UV-Licht 7»5 Minuten "bestrahlt. Die Lösungsmittel werden verdampft und der Rückstand wird durch HPLC (10,6 χ 25 cm mikroteilchenförmiges Siliziumdioxidgel-Säule, entwickelt mit 1,5 % 2-Propanol/Hexan) gereinigt, unter Bildung des Ausgangsmaterials (2$ mg) und des gewünschten Prä-Vitaminesters (5 mg): UV ^ 260, K_mia 233 nm, *_max/*_min 1,5.

Der Prävitaminester wird unter Rückfluß unter Stickstoff in Äthanol während 4,5 Stunden erwärmt unter Bewirkung einer Doppelbindung-Isomerisierung und Bildung des entsprechenden Vitaminesters V (R = CH₅): UV I^ 264, λ ^ 228, *_max/*_min 1,8; NMR 0,54 (s, 18-CH₅), 0,94 (d, J = 6,2 Hz, 21-CH₃), 3,67 (s, -CO₂CH₃), 3,94 (m, 3CC-H), 4,82, 5,05 (2m, 19-H's), 6,03, 6,23 (ABq, J = Hz, 6H, 7H); Massenspektrum m/e (relative Intensität) 400 (0,85, M⁺), 382 (0,07 M⁺ - H₂O), 369 (0,09, M⁺ - OCH₃), 367 (0,35, M⁺ - H₂O - CH₃), 341 (0,10, M⁺ -CO₂CH₃), 271 (0,16, M⁺ - Seitenkette), 253 (0,21, M⁺ - H₃O - Seitenkette), 166 (0,31), 158 (0,76), 136 (1,00), 118 (0,91). Die Verbindung ist homogen durch HPLC.

Beispiel 4

Herstellung von 1 o-Hydroxyvitamin-D-ester VI (R = CH,) nach der Cyclovitaminmethod e

a) 6-Methoxy-3,5-cyclo-26,27-dinorvitamin-D^-25-carbonsäuremethylester (4, X = H, R « Z » Methyl)

Methyl-26,27-dinorvitamin-D₃-25~carbonsäuremethylester (V, R « Methyl) (25 mg) in trockenem Pyridin (0,3 ml) wird mit p-Toluolsulfonylchlorid (50 mg) 72 Stunden in der Dunkelheit bei 5 °C behandelt. Das Reaktionsgemisch wird zu 10 % Natriumbicarbonat auf Eis gefügt. Die wäßrige Phase wird mit Äther/Chloroform (4:1) mehrfach extrahiert. Die vereinten organischen Phasen werden mit Chlorwasserstoffsäure, verdünntem Natriumbicarbonat, Wasser und gesättigtem Natriumchlorid gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Durch Verdampfen des Lösungsmittels

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erhält man das 3-O-Tosylderivat, das einen Fleck im TLC (40 % Äthylacetat/Hexan, Rf 0,62) ergibt. Die gesamte Probe des Tosylats wird bei 55 ° unter Stickstoff in einem Gemisch von trockenem Methanol (0,5 ml), Natriumbicarbonat und Methylenchlorid (0,1 ml) erwärmt. Weiteres Lösungsmittel wird je nach Bedarf zum Ausgleich des Verdampfens zugesetzt. Nach 11,5 Stunden werden Äther und Wasser zugesetzt. Die Phasen werden getrennt und die organische Phase wird mehrfach mit Wasser und gesättigtem Natriumchlorid gewaschen und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Das TLC zeigt einen Hauptfleck mit einem Rf von 0,42 (20 % Äthylacetat/Hexan), der den Cyclovitaminester 4 (R = Z = Me, X = H) darstellt.

b) '1a-Hydroxy-6-methoxy-3, 5-cyclo-26,27-dinorvitamin-D_;2.-25-carbonsäuremethylester (5, R=Z «Methyl, X » Wasserstoff)

Zu Selendioxid (2,8 mg) in trockenem Methylenchlorid (1 ml) bei 0 wird t-Buty!hydroperoxid (11 ul) gefügt. Das Gemisch wird 30 Minuten unter Stickstoff gerührt. Cyclovitamin 4 (R - Z-Methyl, X = H) in Methylenchlorid (1,0 ml) wird in einer Portion zugesetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 0 gerührt und weitere 7 Minuten bei Raumtemperatur und mit gesättigtem Natriumbicarbonat abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wird mit Methylenchlorid mehrfach extrahiert und die vereinten organischen Phasen werden mit Wasser gewaschen, mit Natriumchlorid gesättigt und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Der Rückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatografie (50 % Äthylacetat/ Hexan) gereinigt unter Bildung der 1oc-Hydroxyverbindung 5 (8,5 mg, Rf 0,35) und des entsprechenden 1-Ketoderivats (5,8 mg, Rf 0,58). Die Verbindung 5 (R = Z - Me, X - H) ist homogen im TLC.

c) 1α-Acetoxy-6-methoxy-3,5-cyclo-26,27-dinorvitaminisierter-D,-25-carbonsäuremethylester (6,R=Z= Methyl, R - Acetyl, X - Wasserstoff)

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loc-Hydroxycyclo vitamin 5 (R = Z -Me, X = H) (8,5 mg) und Essigsäureanhydrid (0,1 ml) in trockenem Pyridin (0,2 ml) werden unter Stickstoff 1,5 Stunden bei 55 ° erwärmt. Das Reaktionsgemisch wird auf Eis gegossen und Kaliumcarbonat wird zugesetzt, bis das Schäumen aufhört. Das Gemisch wird mit Äther extrahiert, mit Wasser gewaschen und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Durch Verdampfen des Lösungsmittels erhält man 8,7 mg des 1-Acetoxyprodukts (40 % Äthylacetat/Hexan, Rf 0,55).

d) Reduktion von 1-Ketocyclovitamin

Der 1-Oxo-cyclovitamin D-ester, erhalten wie in Beispiel 4 b) beschrieben, (5*8 mg) wird gelöst in Tetrahydrofuran (0,6 ml) und Methanol (0,1 ml), dem NalfflL (1 mg) zugesetzt werden. Wenn die Heaktion vollständig ist (0,5 Stunden) werden Wasser und Äther zugesetzt und die Phasen werden getrennt. Durch Verdampfen des Lösungsmittels nach dem Aufarbeiten erhält man 1 oc-Hydroxycyclovitamin-D-ester 5 (R ~ Z = Me, X = H) , der gereinigt wird durch präparative Schichtchromatografie (50 % Äthylacetat/ Hexan, Rf 0,30).

e) 1a-Acetoxy-26,27-dinorvitamin-D,-25-carbonsäuremethylester (7,R= Methyl, R¹ = Acetyl, X - Wasserstoff)

Eine Lösung von 1a-Acetoxy-6-methoxy-3,5-cyclo-26,27-dinorvita~ min-D^-25-carbonsäuremethylester (hergestellt wie vorstehend unter c)) (8,7 mg) in trockenem 1,2-Dimethoxyäthanol (0,3 ml) wird mit Ameisensäure (0,1 ml) bei 55 °C unter Stickstoff während 15 Minuten behandelt. Das Reaktionsgemisch wird auf Eis gegossen und Natriumbicarbonat wird zugesetzt, bis das Schäumen aufhört. Das Produkt wird mit Äther extrahiert, mit Wasser gewaschen, bis die wäßrige Phase einen pH von 6 hat, mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Dieses Produkt (der J-SO^miatester) in Tetrahydrofuran (0,1 ml) und Methanol (0,3 ml) wird mit einigen Tropfen von gesättigtem Natriumbicarbonat während 5 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Wasser und Äther werden zugesetzt

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und die Phasen werden getrennt. Die Ätherphase wird mit Wasser gewaschen, mit Natriumchlorid gesättigt und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird durch präparative Schichtchromatografie gereinigt. Die Bande mit einem Ef von 0,2 enthält ein Gemisch von ¹J⁷ (R = Me, R = Acetyl, X « H) und dem entsprechenden 5,6-'i;rans-Isomeren. Das Gemisch wird durch HPLC (2,5 % 2-Propanol/ Hexan), mikroteilchenförmige Siliziumdioxidgel-Säule) getrennt, mit zwei Durchläufen durch die Säule (Recyclisierungsmodus) unter Bildung von 7 (2,0 mg) und dem entsprechenden 5,6-trans-Isomeren in reiner Form.

f) 1α-Hydroxy-26,27-dinorvitamin-D_:,-25-carbonsäuremethylester .(VI, R = CH₃)

Eine Lösung des Acetat esters 7 (E = Me, Il = Acetyl, X = H) in Äther (0,2 ml) wird mit 0,1 m methanolischem Kaiiumhydroxid (0,075 ml) hei Raumtemperatur behandelt. Nach etwa 1 Stunde ist die Reaktion vollständig. Wasser und Äther werden zugesetzt und die Phasen werden getrennt. Die wäßrige Phase wird mit Äther extrahiert. Die vereinten Ätherextrakte werden mit Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Durch Verdampfen des Äthers erhielt man das gewünschte Produkt VI (R = Me) (1,87 mg), das einen Fleck bei der TLC-Analyse zeigt und bei der HPLC-Analyse homogen ist (7»5 % 2-Propanol/ Hexan): UV \^ 265, *_min 228 nm, 7l_max/7l_min 1,72; NMR S 0,54 (s, 18-CH₃), 0,94(d,J= 6,2 Hz, 21-CH₅), 3,63 (s, -CO₂CH₃), 4,21 (m, 3ct-H), 4,40 (m, 1ß-H), 4,96, 5,28 (19 E und Z H's), 5,97, 6,32 (AB Quartett, J - 10,8 Hz, 6 und 7 H's); Massenspektrum m/e(Zusammensetzung, m/e berechnet, relative Intensität) 416,2930 (C₂₆H₄₀O₄, 416,2927, 0,10), 398,2812 (C₂₅H₃₈O₃, 398,2821, 0,09), 380,2694 (C₂₆H₂₆)₂, 380,2716, 0,22), 152,0840 (C₉H₁₂O₂, 152,0837, 0,29), 134,0745 (C₉H₁₀O, 134,0732, 1,00). Das entsprechende 5,6-trans-Isomere, 1a-Hydroxy-5,6-trans 26,27-dinorvitamin-D^-25-carbonsäuremethylester, wird erhalten durch Hydrolyse der 5»6-trans-1a-Acetoxyverbindung unter den gleichen Bedingungen.

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Beispiel 5

Herstellung von Ια-Hydroxyvitamin-D;,-ester VI (R = CH,) aus Homocholensäureester

a) Methyl-25-homo-1,4,6-cholatrien-3-on-25-oat (8, E - Methyl, X = Wasserstoff)

Ein Gemisch von Homocholensäuremethylester und 2,3-Dichlor-5>6-dicyano-1,4-benzochinon (3>5 molarer Überschuß) in trockenem Dioxan wird unter Rückfluß 20 bis 24 Stunden erwärmt. Das Reaktionsgemisch wird gekühlt und filtriert. Der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird durch eine neutrale Aluminiumoxidsäule, eluiert mit Methylenchlorid, filtriert. Das erhaltene Material wird durch Chromatografie über Siliziumdioxidgel, eluiert mit Aceton/Hexan, gereinigt und anschließend als solches für die nächste Stufe verwendet.

b) 1a ,2a-0xido-25-homochola-4,6-dien-3-on-25-säure (9, X-H)

Das wie im Teil a) erhaltene Trienon 8 wird in Äther/Methanol mit wäßrigem Kaiiumhydroxid zur Umwandlung des Esters in die Säure hydrolysiert. Das gekühlte Gemisch wird mit H~O verdünnt und mit Äther zur Entfernung von organischem, löslichem Material extrahiert. Die wäßrige Phase wird anschließend mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure angesäuert und sorgfältig mit mehreren Portionen Äther extrahiert. Die vereinten organischen Phasen werden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Eine Portion des nach Verdampfen des Lösungsmittels erhaltenen Rückstands, äquivalent zu 3,6 mMol Steroid, wird in Methanol gelöst, so daß die Endkonzentration des Steroids 0,05 bis 0,1 m beträgt. Zu dieser Lösung werden 10 % Natriumhydroxid (0,45 ml) und 30 % ^₂°2 ^²»^ ^m1^ Sefügt und das resultierende Gemisch wird bei Raumtemperatur 16 Stunden stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird mit methanolischer

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Chlorwasserstoffsäure angesäuert; das Lösungsmittel wird

konzentriert; und die Ausfällung, die das gewünschte 1a,2a-

Epoxyderivat 9 (X = H) darstellt, wird gesammelt und für die nächste Stufe verwendet.

c) Methyl-1a,3ß-dihydroxy-25-homo-5-cholen-25-oat-1 ,J-diacetat (11, R = Me, R¹ = Acetyl, X = Wasserstoff)

Epoxydienon 9 (X = H) (0,25 g)> gelöst in trockenem Tetrahydrofuran "bei -33 ⁰C, wird in einer Portion zu einer Lösung von Natrium (20-facher Überschuß) in flüssigem Ammoniak für eine endgültige Steroidkonzentration von 0^015 m gefügt. Nach 10 Minuten wird Ammoniumchlorid (2,5 g) in kleinen Portionen während 1 Stunde zugesetzt. Das Ammoniak läßt man verdampfen u»d 1 n-Chlorwasserstoffsäure und Äther werden vorsichtig zu dem Reaktionsgemisch gefügt. Die Phasen werden getrennt und die wässrige Phase wird wiederholt mit Äther extrahiert. Die vereinten organischen Phasen werden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösung wird konzentriert und mit überschüssigem Diazomethan in Äther behandelt. Das Lösungsmittel wird verdampft und der Rückstand wird durch Siliziumdioxidgel-Chromatografie, eluiert mit Aceton/ Hexan, gereinigt unter Bildung des 1a-Hydroxyzwischenprodukts 10 (X - H, R = Methyl).

Diese 1a-hydroxylierte Verbindung wird erwärmt (60 ) mit Essigsäureanhydrid/Pyridin (1 : 1) bis die Acetylierung vollständig ist (etwa 3 Stunden, zweckmäßig überwacht durch TLC). Das Gemisch wird auf Eis gegossen. Äther wird zugesetzt und Kaliumcarbonat wird zugefügt, bis das Schäumen aufhört. Die Phasen werden getrennt und die organische Phase wird mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure, verdünntem Natriumbicarbonat, Wasser und Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Durch Verdampfen des Lösungsmittels erhält man den Ester 11 (R χ= Methyl, R¹ = Acetyl, X¹ = H).

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d) Methyl-1a,3ß-dihydroxy-25-homo-5,7-choladien-25-oat-1 ,3-diacetat (12,E= Methyl, E¹ - Acetyl, X¹ - Wasserstoff)

Die Verbindung 11 (X = H) (1,2 mMol), Natriumbicarbonat (500 mg) und 1,3-Dibrom-5,5-dimethy!hydantoin (0,84 mMol) werden bei 75 unter Stickstoff während 20 Minuten erwärmt. Das Reaktionsgemisch wird gekühlt, filtriert und das Lösungsmittel wird entfernt. Der Rückstand wird in Xylol (15 ml) und Collidin (3,5 ml) gelöst und unter Rückfluß unter Stickstoff während 1,5 Stunden erwärmt. Benzol wird zugesetzt und die organische Phase wird mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure, verdünntem Natriumbicarbonat, Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird in Dioxan (14 ml) gelöst, wozu p-Toluolsulfonsäure (65 mg) gefügt werden, und wird unter Stickstoff während 35 Minuten bei 70 °C erwärmt. Äther wird zugesetzt und die organische Phase wird mit verdünntem Natriumbicarbonat, Wasser, gesättigtem Natriumchlorid gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird durch Siliziumdioxidgel-Dünnschichtchromatografie, eluiert zweimal mit 10 % Aceton/Hexan, gereinigt, unter Bildung des Produkts 12 (R =■ Me, R = Acetyl, X¹ = H).

e) 1a-Hydroxy-26,27-dinorvitamin-D,-25-carbonsäuremethylester (VI) (R = Me)

1 1

Eine Lösung von 5,7-Dien-diacetat 12 (R = Acetyl, X=H, R = CH₃) (30 mg) in 20 % Äthanol/Benzol (150 ml) unter Stickstoff bei 0 ⁰C wird während 20 Minuten in einem Quarzreaktionsgefäß mit einer 125-Watt-Hanovia-8A36-Lampe, ausgerüstet mit einem Corex-Filter, bestrahlt. Das Lösungsmittel wird verdampft und das gewonnene Material wird in Äthanol gelöst und unter Rückfluß unter Stickstoff während 5 Stunden erwärmt. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand wird in Äther und 0,1 m methanolischem Kaliumhydroxid (2 : 1) gelöst und bei Raumtemperatur stehengelassen, bis die Hydrolyse vollständig

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ist (überwacht durch TLC). Wasser und Äther werden zugesetzt und die Phasen werden getrennt. Die wäßrige Phase wird mit Äther extrahiert. Die vereinten Ätherextrakte werden mit Wasser und mit Salzlösung gewaschen. Durch Verdampfen des Lösungsmittels erhält man ein Produktgemisch, aus dem der gewünschte Vitamin-D-Ester VI (R = CH,) abgetrennt wird durch HPLC-Chromatografie (0,6 χ 25 cm mikroteilchenförmige Siliziumdioxidgel-Säule) unter Verwendung von 7 % 2-Propanol in Hexan als Eluierlosungsmittel.

Beispiel 6

Herstellung von 24-Hydroxyvitamin-D-Ester VII (R = Methyl)

a) Aldo!kondensation zum Ketoester (14, R = Methyl)

Zu 20 ml Diisopropylamin in 14 ml trockenem THi¹, gekühlt auf

0 ⁰C, fügt man 8,9 ml n-Butyllithium (1,6 m in Hexan); 0,5 ml Brenztraubensäure in THP (1,0 ml) werden anschließend tropfen- ^; weise zugesetzt und die Lösung wird 1 Stunde bei 0 ⁰C gerührt. Das Gemisch wird auf -78 ⁰C gekühlt und 2,0 g des 22-Aldehyds (13), gelöst in 10 ml trockenem THi¹, werden zugesetzt. Nach

1 Stunde läßt man die Lösung auf 0 ⁰C erwärmen und rührt anschließend während weiterer 3 Stunden. Das Reaktionsgemisch wird mit 1 ml Eisessig abgeschreckt, mit Äther und ^O verdünnt und die Schichten werden getrennt. Die organische Phase wird mit 1 n-HCl, Wasser und gesättigtem NaCl (aq) gewaschen. Die organische Schicht wird über wasserfreiem Na^SO^ getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird im Äther aufgenommen und mit ätherischem Diazomethan behandelt unter Umwandlung der Säure in ihren Methylester. Das resultierende Öl wird über Siliziumdioxidgel (100-200 mexh) chromatografiert mit 5 % Äthylacetat in Hexan als Eluiermittel unter Bildung des Ketoesters 14 (R = Methyl).

b) Reduktion der Verbindung 14 zum oc-Hydroxyester 15 (R = Methyl) Zu einer Lösung von 1 g des Enons (14) in 30 ml trockenem

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Pyridin werden 178 ^mg NaBH^. zugesetzt und das Gemisch wird "bei Raumtemperatur etwa 48 Stunden gerührt. Das Gemisch wird in HpO gegossen und mit Äther extrahiert. Die vereinten Extrakte werden mit 1 n-HCl, 1 n-NaHCO,, gesättigtem NaCl (aq) gewaschen und über wasserfreiem Na^SO^ getrocknet. Die organische Schicht wird im Vakuum zu einem öl konzentriert, über Siliziumdioxidgel (100-200 mesh) chromatografiert unter Verwendung von 5 % Äthylacetat in Hexan als Eluiermittel und 800 mg α-Hydroxyester 15 werden erhalten.

c) Solvolyse von 15 zum 24-Hydroxyhomocholenester 16 (R= Methyl, H¹ = Acetyl)

Eine Lösung von 648 mg der Verbindung 15 in 30 ml Eisessig wird 16 Stunden auf 70 ⁰C erwärmt. Die Lösung wird gekühlt und neutralisiert mit 10 % NaOH (aq) (geeist). Die Lösung wird anschließend in Äther extrahiert. Die vereinten Extrakte werden mit 1 n-NCl, 1 n-NaHCO.,, gesättigtem NaGl (aq) gewaschen, über wasserfreiem Na~SO^ getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der rohe Feststoff wird über Siliziumdioxidgel (100-200 mesh) chromatografiert mit 5 % Äthylacetat/Hexan als Eluiermittel, unter Bildung von Methyl-3ß»24-dihydroxy-25-homo-5-cholen-25-oat-3-acetat (16, worin R = Methyl, R = Acetyl) in etwa 80 % Ausbeute.

d) Umwandlung des Esters 16 in den 24-Hydroxyvitamin-D,-ester VII (B = Methyl)

Eine Lösung von 500 mg des Esters 16 (E = Acetyl, R = Methyl) in 3 ml Pyridin wird mit 1 ml Essigsäureanhydrid bei Raumtemperatur über Nacht behandelt unter Bildung des entsprechenden 3,24-Diacetats nach üblichem Aufarbeiten. Dieses Material (510 mg) wird umgewandelt in das Methyl-3ß,24-dihydroxy-25~homo-5,7-choladien-25-oat-3»24-diacetat unter Anwendung der im Beispiel 3 a) beschriebenen Arbeitsweise. Die Hydrolyse des Diacetats gemäß Beispiel 3a) führt dann zum Methyl-3ß>24-dihydroxy-25-homo-5»7-choladien-25-oat (100 mg), das an einer

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kurzen Säule von Siliziumdioxidgel (1 χ 20 cm, 100-200 mesh), eluiert mit Äthylacetat/Hexan (1 : 4) gereinigt wird, oder durch präparative Dünnschichtchromatografie (0,75 cm an Siliziumdioxidgelplatten, ithylacetat/Hexan). Unterzieht man dieses 5»7-Dienzwischenprodukt der Bestrahlungsverfahrensweise des Beispiels 3b) erhält man den entsprechenden 24-Hydroxyprävitamin-D-ester, der gereinigt wird durch HPLC (0,6 χ 25 cm, Siliziumdioxidgelsäule, 5 % 2-Propanol/Hexan-Lösungsmittel) und naschließend umgewandelt wird durch Erwärmen wie in Bei-' spiel 3 b) beschrieben in den gewünschten 24—Hydroxyvitamin-D-ester VII (worin R = Methyl). Die Reinheit wird durch HPLC bewertet und, falls notwendig, wird das Produkt durch HPLC gereinigt unter Anwendung der für die Reinigung der Prävitaminverbindung genannten Bedingungen.

Beispiel 7

Herstellung von Äthyl-3ß,24~dihydroxy-25-homo-9,'10-seco-5,7_i ^/10-(19)-cholatrien-25-oat (24-Hydroxy-26,27-dinorvitamin-D,-25-carbonsäureäthylester (Verbindung VII, R = Äthyl) aus 24,25-Dihydroxycholesterin (Methode A)

a) 3ß-Hydroxychol-5-en-24-al (18, Y = H)

Zu einer Methanol- (10 ml) Lösung von 1,5 g 24,25-Dihydroxycholesterin (17» Y = H) (hergestellt wie von Lam et al., in Biochemistry, 12_, 4851 (1973) beschrieben), wird eine gesättigte Methanollösung von Natriummetaperjodat gefügt. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt und mit Chloroform extrahiert. Die organischen Extrakte werden mit Wasser und Salzlösung gewaschen, über Kaliumcarbonat getrocknet und verdampft unter Bildung von etwa 1 g des gewünschten 24-Aldehyds (18, Y' - H).

Der 24~Aldehyd wird umgewandelt in sein 3-0-Silylätherderivat in üblicher Weise: Reaktion einer THF/Pyridin-(1 : 1) Lösung des Aldehyds mit Hexamethyldisilazan (1,5 ml)

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3Q45287

Trimethylchlorsilan (1 ml) bei Raumtemperatur während 0,5 Stunden ergibt das 3-0-Trimethylsilylprodukt, das, gelöst in THF, kräftig mit K₂CO, getrocknet wird und anschließend als Lösung in THi¹ für die nächste Stufe verwendet wird.

b) Äthyl-3ß,2^dihydroxy-25-homochol-5-en-25-oat (19, Y - H, R - Et)

Zu einer Tetrahydrofuranlösung des Lithiumsalzes von 2-Methylmercapto-1,3-dithian (hergestellt wie beschrieben von Seebach, Angew. Chem., ££, 469-470 (196?); Ellison et al., J. Org. Chem. 22., '2757 (1972) beschrieben), gehalten bei -78 ° unter einer Atmosphäre von Argon, wird tropfenweise eine THF-Lösung des 24-Aldehyd -3-0-silyläthers (hergestellt wie vorstehend in a) beschrieben) (ca. 0,8 Mol Aldehyd pro Mol Lithiumorthothioesterreagens) gefügt. Nach dem Zusatz des Aldehyds läßt man das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmen und arbeitet dann auf durch Zusatz von Wasser und Extrahieren des Produkts in CHCl-,.

Die Chloroformlösung wird mit verdünnter KOH-Lösung und anschließend mit Wasser gewaschen und über Na₂SO₂, getrocknet. Das auf diese Weise erhaltene 24—Hydroxy-25-orthothioesterzwischenprodukt wird anschließend zu einem Gemisch von HgCl₂ (3,5 äquiv.) und HgO (2,0 äquiv.) in 95 % Äthanol gefügt zur Bewirkung einer Äthanolyse des Orthothioesters zum 25-Carbonsäureester (Ellison et al., vorstehend). Die Temperatur wird auf 50 ° angehoben und das Gemisch wird unter Argon über Nacht gerührt. Ausgefällte Feststoffe werden abfiltriert und mit CHpCIp gewaschen und das Filtrat wird mit Wasser verdünnt, mit CH₂Cl₂ extrahiert, mit Ammoniumchlorid, Natriumbicarbonat, gefolgt von Wasser und Salzlösung, gewaschen, die Lösung wird getrocknet (Na₂SO.) und durch Verdampfen des Lösungsmittels erhält man das gewünschte Hydrolyseprodukt Äthyl-3ß,24- dihydroxy-25-homochol-5-en-25-oat.

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c) Die Umwandlung von Äthyl-3ß>24—dihydroxy-25-homocho1-5-en-25-oat in den 24-Hydroxy-26,27-dinorvitamin-D,~25-säureäthylester (VIII, R « Äthyl) wird erzielt durch Unterziehen des Esters 19 (ϊ =■ H, fi « Äthyl) der Stufenfolge und den Bedingungen, die in Beispiel 6 d) beschrieben werden.

Beispiel 8

Herstellung von Äthyl-3ß,24—dihydroxy-25-homochol-5-en--25-oat (19, Y = H, R » Äthyl) aus 24,25-Dihydroxycholesterin (Methode B)

a) Herstellung von 24~Thioacetal (20, ϊ = H)

Zu einer Chloroformlösung des 24—Aldehyds 18 (ϊ =» H) (1 g), hergsstellt wie in Beispiel 7 a) beschrieben, wird ein Überschuß von 1,3-Dithiopropan (2 ml) gefügt und das Gemisch wird bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird nach etwa 30 Minuten das Gemisch in einem Eisbad gekühlt und 1 ml Bi^-Ätherat wird zugesetzt und man läßt die resultierende Lösung über Nacht in der Kälte stehen. Die kalte Lösung wird anschließend mit 5 % wäßriger KOH-Lösung gewaschen, gefolgt vom Vaschen mit HoO und Trocknen über K^CO,. Durch Verdampfen des Lösungsmittels erhält man dann das gewünschte 24,24—Dithioacetalderivat 20 (Y = H). Dieses Material wird in sein J-O-Trimethylsilylätherderivat, wie in Beispiel 7 a) beschrieben, umgewandelt.

b) Äthyl-3ß-hydroxy-24-oxo-25-homochol-5-en-25-oat (21, Y= H, R - Äthyl)

Eine Lösung (0,1 m) des, wie vorstehend beschrieben, erhaltenen 3-0-silylierten Thioacetalderivats in trockenem Tetrahydrofuran, gehalten bei -25 C unter einer Argonatmosphäre, wird mit 1,5 Äquivalenten n-Butyllithium in Hexan (1,5i Lösung) behandelt und das Gemisch wird 3»5 Stunden gerührt unter Bildung des 24—Lithioderivats. Die Temperatur wird auf -70 ° gesenkt und ein großer Überschuß an Äthylchlorformiat (ClCOOEt) wird langsam als Lösung in trockenem THF zugesetzt und die

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Reaktion wird 7 Stunden gerührt. Anschließend läßt man auf Raumtemperatur erwärmen, Wasser wird zugesetzt und das Gemisch wird mit CHCl, extrahiert. Die CHCl,-Extrakte werden mit verdünntem EOH und H₂O gewaschen und anschließend getrocknet und verdampft unter Bildung des 25-Carboäthoxy-24,24-thioketalderivats. Das Thioketal wird direkt hydrolysiert durch Zusatz einer Acetonitrillösung des vorstehenden Produkts (1 mMol) zu einer Lösung von überschüssigem N-Chlorsuccinimid (5 mMol) und AgNO^ (4 mMol) in Acetonitril/H^O (5 : 1). Nach 1 Stunde bei 50 ° wird gesättigte NaCl-Lösung zugesetzt, die Ausfällung wird durch Filtrieren entfernt und das Piltrat wird nach dem Verdünnen mit CH₂Cl₂ mit Natriumbisulf it- und Natriumbicarbonatlösungen, gefolgt von Wasser und Salzlösung, gewaschen. Nach dem Trocknen und Verdampfen des Lösungsmittels erhält man das gewünschte 24-Keto-25-äthylesterprodukt (21,Y=H, R = Et).

c) Äthyl-3ß,24-dihydroxy-25-homochol-5-en-25-oat (19, Y = H, R - Et)

Eine Methanollösung (10 ml) des 24-Ketoprodukts (100 mg), wie vorstehend in b) erhalten, wird mit einem Überschuß von NaBH^, bei Raumtemperatur während 45 Minuten behandelt. Durch Zusatz von verdünnter wäßriger Essigsäure und Extrahieren mit Methylenchlorid erhält man nach der Chromatografie an einer Siliziumdioxidgelsäule, entwickelt mit Äthylacetat/Hexan, 85 mg, des gewünschten 24-Hydroxy-25-esterprodukts (1.9, Y = H, R = Et).

Beispiel 9

Herstellung von 1a,24-Dihydroxy-26,27-dinorvitamin-D,-25-carbonsäureäthylester (VIII, R » Et). (Äthyl-1cx,3ß,24-trihydroxy-25-homo-9,10-seco-5,7,10(i9)-cholatrien-25-oat) aus 1a,24,25-Trihydroxycholesterin

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Eine Methanollösung von 1a,24,25-Trihydroxycholesterin wird einer Perjodatspaltung, genau wie in Beispiel 7 a) unterzogen, unter Bildung des 1a-Hydroxy-24-aldehydzwischenprodukts (18, X β OH). Dieser Aldehyd wird in seinen 1,3-Ditrimethylsilyläther umgewandelt unter Anwendung der in Beispiel 7 a) angegebenen Bedingungen. Das Silylätherderivat wird anschließend mit 2-Lithio-2-methylmercapto-1,3-dithian, genau wie in Beispiel 7 b) beschrieben, behandelt und der resultierende 24-Hydroxy-25-orthothioester wird einer Äthanolyse unter Anwendung der im Beispiel 7 b) beschriebenen Bedingungen unterzogen, unter Bildung von Äthyl-1ct,3ß,24— trihydroxy-25-homochol-5-en-25-oat (19, E - Äthyl, Y = OH). Nach dem Acetylieren dieses Triolesters mit überschüssigem Essigsäureanhydrid in Pyridin ,bei 80 ° während 4 Stunden, wird das resultierende 1,3,24-Triäcetat den Verfahrensweisen der Beispiele 5 d) und 5 e) unterzogen unter Bildung des gewünschten Produkts 1oc,24— Dihydroxy-26,27-dinorvitamin-D_:5-25-carbonsäureäthylester (VIII, R = Äthyl), wobei der einzige Unterschied darin besteht, daß das Endprodukt durch KPLC-Chromatografie (0,6 χ 25 cm Siliziumdioxidgelsäule) mit 10 % 2-Propanol in Hexan als Eluiermittel, gereinigt wird.

Beispiel 10

Herstellung von 1a,24—Dihydroxy-26,27-dinorvitamin-D^-25-carbonsäureäthylester (VIII, R ~ Äthyl) über Cyclovitaminzwischenprodukte

24—Hydroxy-26,27-dinorvitamin-Dx-25-carbonsäureäthylester (VII, R « Äthyl), wie nach einer der Synthesen der Beispiele 7 oder 8 erhalten, wird am C-3 tosyliert und anschließend in MeOH/ NaOAc genau wie in Beispiel 4 a) beschrieben solvolysiert unter Bildung von (etwa 40 %) 24—Hydroxy-6-methoxy-3,5-cyclo-26,27-dinorvitamin-D;,-24-carbonsäurearylester (Verbindung 4·, H = Et, X = OH, Z = Me). Die Oxidation dieses Materials mit SeO₂ in Anwesenheit von t-*-Butylhydroperoxid , wie detailiert im Beispiel 4 b) angegeben, ergibt das entsprechende

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Ια-Hydroxyderivat (H = Et, X = OH, Z » Me) in etwa 50 % Ausbeute. Durch Acetylieren dieses Produkts, wie in Beispiel 4· c), erhält man das 1,24~DiacetatZwischenprodukt, das in Ameisensäure solvolysiert wird, genau wie in Beispiel 4 e) beschrieben, unter Bildung eines Gemischs der 5i6-cis- und 5>6-trans-J-O-Formylvitamin-D-Ester.Die Formylgruppen werden direkt durch kurze basische Hydrolyse, genau wie in Beispiel Λ e), entfernt und man erhält ein Gemisch von 1a,24—Diacetoxy-26,27-dinorvitamin-Dv-25-carbonsäureäthylester und dem entsprechenden 5>6-trans-Isomeren. Die 5>6-cis- und -trans-Isomeren werden An Siliziumdioxidgelplatten (Äthylacetat/Hexan) und HPLC (Siliziumdioxidgelsäule, 0,6 χ 25 cm; 3,5 % 2-Propanol/ Hex,an) getrennt, das 5>6-cis-Isomere (Verbindung 7> R = Et, R=X= Acetyl) wird in verdünntem Alkali, genau wie in Beispiel 4- f) beschrieben, hydrolysiert unter Bildung des gewünschten Produkts 1α,24-Dihydroxy-26,27-dinorvitamin-D_:r-25-carbonsäureäthylester (VIII, ß = Äthyl) in reiner Form, (geringere Verunreinigungen, falls vorhanden, werden durch HPLC-Chromatografie an Siliziumdioxidgel (0,6 χ 25 cm Säule) unter Verwendung von 10 % 2-Propanol/Hexan als Lösungsmittel, entfernt.) Die Hydrolyse der 5>6-trans-1a-Acetoxyverbindung unter identischen Bedingungen ergibt Ία,24— Dihydroxy-5,6-trans-26,2?-dinorvitamin-D,-25-carbonsäuremethylester.

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Claims (29)

1. PATENTANWÄLTE Dr. rer. nat. DIETER LOUIS Dfpl.-Phys. CLAUS PÖHLAU Dlpl.-lng. F ANZ LOHRENTZ Dlpl.-Phys.WOLFGANG SEGETH KESSLEKPLATZ 1 NÜRNBERG 20

   30A5287

   WISCONSIN ALUMNI IESEAECH .FOUNDATION 20

   614- North Walnut Street

   Madison, Wisconsin 53707 / V.St.A.

   Patentansprüche

   Verfahren zur Herstellung von 26,27-isotopisch markierten Vitamin-D-Verbindungen der allgemeinen Struktur

   Ho

   worin jedes von R^ und IL^ ausgewählt ist aus der Gruppe von Wasserstoff und Hydroxy und worin X ausgewählt ist aus der

   14 13 3 Gruppe von CH,, CH;,, C^H, und C H,, das darin besteht,

   Vitamin-D-Ester der Struktur

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   COOK;

   HO »*

   worin jedes von R^ und R~ ausgewählt ist aus der Gruppe von Wasserstoff oder Hydroxy, und worin IU eine Alkylgruppe mit 1 bis etwa Λ Kohlenstoffatomen ist, mit isotopisch markiertem Methyl-Grignard-Reagens oder dem entsprechenden isotopisch markierten Methyllithiumreagens zu behandeln und die 26,27-isotopisch markierte Vitamin-D-Verbindung zu gewinnen.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Methyl-Grignard-

   14·
   Methyllithium-Reagens C markiert ist.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Methyl-Grignard-Methyllithium-Reagens Tritium-markiert ist.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Methyl-Grignard-Methyllithium-Reagens Deuterium-markiert ist.
5. 5. Verbindungen mit der allgemeinen Struktur

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   worin jedes von R,, und Rp ausgewählt ist aus der Gruppe von Wasserstoff und Hydroxy, gekennzeichnet durch eine spezifische Aktivität von über 120 Ci/mMol.
6. 6. Verbindungen nach Anspruch 5 mit einer spezifischen Aktivität von 160 Ci/mMol.
7. 7. Verbindungen mit der Struktur

   worin jedes von E^, und Rp ausgewählt ist aus der Gruppe von Wasserstoff oder Hydroxy und worin R^ eine Alkylgruppe mit 1 bis etwa 4- Kohlenstoffen ist, und die Acylate davon.
8. 8. Verbindungen nach Anspruch 7» worin sowohl R* als auch Rp Wasserstoff sind und R, ausgewählt ist aus der Gruppe von Methyl oder Äthyl, und die Acylate davon.
9. 9. Verbindungen nach Anspruch 7> worin R^. Hydroxy ist, R^ Wasserstoff ist und R-z ausgewählt ist aus der Gruppe von Methyl oder Äthyl, und die Acylate davon.
10. 10. Verbindungen nach Anspruch 7> worin R. Wasserstoff ist und R2 Hydroxy ist und R^ ausgewählt ist aus Methyl oder Äthyl, und die Acylate davon.

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11. 11. Verbindungen nach Anspruch 7» worin sowohl E^ als auch Hydroxy sind und E, ausgewählt ist aus Methyl oder Äthyl, und die Acylate davon.
12. 12. Verbindungen mit der Struktur

    worin jedes von B^ und R₂ ausgewählt ist aus der Gruppe von Wasserstoff, Hydroxy oder O-Acyl und worin B^ eine AUcylgruppe mit 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen ist und worin Z Wasserstoff oder Niedrigalkyl ist.
13. 13. Verbindungen nach Anspruch 12, worin sowohl S^ als auch £~ Wasserstoff sind, E, ausgewählt ist aus Äthyl oder Methyl und Z Methyl ist.
14. 14. Verbindungen nach Anspruch 12, worin B^ ausgewählt ist aus Hydroxy oder O-Acyl, Ep Wasserstoff ist, E, ausgewählt ist aus Methyl oder Äthyl, Z Methyl ist.
15. 15. Verbindungen nach Anspruch 12, worin B^ Wasserstoff ist, Rp ausgewählt ist aus Hydroxy oder O-Acyl, E, ausgewählt ist aus Methyl oder Äthyl, Z Methyl ist.
16. 16. Verbindungen nach Anspruch 12, worin sowohl R^, als auch E2 Hydroxy oder O-Acyl sind, E, ausgewählt ist aus Methyl oder Äthyl, und Z Methyl ist.

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17. 17· Verbindungen mit der Struktur

    worin jedes von IL und R^ ausgewählt ist aus der Gruppe von Wasserstoff, Hydroxy und O-Acyl, mit der Maßgabe, daß R^ und Rq nicht "beide Wasserstoff sein können, und E, eine Alkylgruppe mit 1 bis etwa 4- Kohlenstoffatomen ist und R. Wasserstoff oder Acyl ist.
18. 18. Verbindungen nach Anspruch 17» worin R^ Hydroxy ist, Rp und R^, beide Wasserstoff sind, und R^ ausgewählt ist aus Methyl oder Äthyl, und Acylate davon.
19. 19. Verbindungen nach Anspruch 17 > worin sowohl R^, als auch R. Wasserstoff sind, R₂ Hydroxy ist und R₃. ausgewählt ist aus Methyl oder Äthyl, und die Acylate davon.
20. 20. Verbindungen nach Anspruch 17, worin sowohl R^ als auch Rp Hydroxy sind, R, Methyl oder Äthyl ist, R^ Wasserstoff ist, und die Acylate davon.
21. 21. Verbindungen mit der Struktur

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    5V 304528?

    worin jedes von Κ,, und Sp ausgewählt ist aus der Gruppe von Wasserstoff, Hydroxy, O-Acyl, mit der Ausnahme, daß S. und R~ nicht "beide Wasserstoff sein können, und worin iU eine Alkylgruppe mit 1 "bis 4· Kohlenstoffatomen ist und worin R^ ausgewählt ist aus Wasserstoff oder Acyl.
22. 22. Verbindungen nach Anspruch 21, worin R^ Hydroxy ist, Ro und R. beide Wasserstoff sind, und R-, Methyl oder Äthyl ist, und die Acylate davon.
23. 23. Verbindungen nach Anspruch 21, worin R^ und R^ beide Wasserstoff sind, R2 Hydroxy ist und R, Methyl oder Äthyl ist, und die Acylate davon.
24. 24. Verbindungen nach Anspruch 21, worin R^ und Rp beide Hydroxy sind, R^ Methyl oder Äthyl ist, und R^ Wasserstoff ist, und die Acylate davon.
25. 25· Verbindungen mit der allgemeinen Struktur

    worin jedes von R^ und Rp ausgewählt ist aus der Gruppe von Wasserstoff, Hydroxy und O-Acyl, und H, eine Alkylgruppe mit 1 bis etwa 4- Kohlenstoffatomen ist, und R^ Wasserstoff oder Acyl ist.
26. 26. Verbindungen nach Anspruch 25» worin jedes von R,,, Rp und R^. Wasserstoff ist und R, ausgewählt ist aus Methyl oder Äthyl, und die Acylate davon.

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27. 27· Verbindungen nach. Anspruch 25, worin R,, Hydroxy ist und jedes von Eo ^un(i ^4 Wasserstoff ist, und R^ ausgewählt ist aus Methyl oder Äthyl, und die Acylate davon.
28. 28. Verbindungen nach Anspruch 25, worin sowohl R^ als auch Wasserstoff sind, R₂ Hydroxy ist und R^ ausgewählt ist aus Methyl oder Äthyl, und die Acylate davon.
29. 29. Verbindungen nach Anspruch 25, worin sowohl R^ als auch Hydroxy sind, R^ ausgewählt ist aus Methyl oder Äthyl, R^, Wasserstoff ist, und die Acylate davon.

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