DE3045287C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft isotopisch markierte Vitamin-D- Derivate und insbesondere bestimmte radiomarkierte Vitamin-D-Derivate (Radiotracer).

Solche Verbindungen finden Anwendung bei der Bestimmung von Vitamin-D-Metabolitgehalten im Blut und Gewebe von Menschen und Tieren. Auf diese Weise kann das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Erkrankungszuständen, wie Osteomalacie, Osteodystrophie und Hyperparathyroidismus festgestellt werden.

Die markierten Vitamin-D-Derivate finden beispielsweise Anwendung bei Untersuchungen auf 25-OH-D₃ (Bayard et al., Europ. J. Clin. Invest., 2, 195 (1972), Belsey et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 33, 554 (1971), Bouilon et al., Clin. Chem., 22, 364 (1976), Edelstein et al., Clin. Sci. Mol. Med., 46, 231 (1974), Eisman et al., Anal. Biochem., 80, 298 (1977), Garcia-Pascual et al., Clin. Chim. Acta, 68, 99 (1976), Haddad und Chyu, J. Clin. Endocrinol, Metab., 33, 992 (1971), Haddad et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 43, 86 (1976), Jones, Clin. Chem. 24, 287 (1978) and Preece et al., Clin. Chem. Acta, 54, 235 (1974) oder auf 1a,25-(OH)₂D₃ (Brumbaugh et al., Science, 183, 1089 (1974), Eisman et al., Arch. Biochem. Biophys., 176, 235 (1976) und Clemens et al., Clin. Science Mol. Med., 54, 329 (1978) oder bei multiplen Untersuchungen sowohl auf 25-OH-D₃ als auch auf 1,25-(OH)₂D₃ sowie auch auf andere Metabolite (Caldas et al., J. Lab. Clin. Med., 91, 840 (1978), Hughes et al. J. Clin. Invest., 58, 61 (1970)) oder bei fortlaufenden Untersuchungen der Vitamin-D-Funktion, bei Bindungs- Protein-Untersuchungen, Target-Gewebe-Rezeptorisolation und Charakterisierung, autoradiografischen Untersuchungen und weiteren Untersuchungen des Vitamin-D- Metabolismus.

Die Genauigkeit der vorerwähnten Untersuchungen hängt wesentlich von der spezifischen Aktivität der zum Einsatz kommenden markierten Vitamin-D-Derivate ab. Insofern wurde die spezifische Aktivität der bekannten isotopisch- bzw. radiomarkierten Vitamin-D-Derivate als unbefriedigend empfunden. Dies gilt auch für die bei der in den Berichten von Yamada et al. (Anal. Biochem., 85, 34 (1978)) und Muccino et al. (Steroids, 31, 645 (1978)) beschriebenen Radiosynthese erhaltenen Vitamin-D-Metaboliten mit vergleichbarer hoher spezifischer Aktivität (78 bzw. 90 Ci/mMol). In diesen Fällen wurde zur Einführung eines Radionuklids an einem acetylenischen Steroidzwischenprodukt eine Tritiierung mit eine hohe spezifische Aktivität aufweisendem ³H₂ durchgeführt. Unter den dabei zur Anwendung kommenden Bedingungen ergibt sich häufig eine ungleichmäßige Verteilung der Markierung, was die Genauigkeit der mit solchen Verbindungen durchgeführten Untersuchungen beeinträchtigen kann. Im übrigen sind die in den genannten Berichten beschriebenen Synthesen verhältnismäßig aufwendig. Sie verlaufen über 7 Stufen nach Einführung der Markierung, einschließlich der Umwandlung des Steroids in das seco-Steroid.

Eine demgegenüber einfachere Synthese eines radiomarkierten Vitamin-D-Derivats wurde von Bell und Scott (J. Label. Compounds, 9, 339 (1973)) beschrieben. Hierbei wird zur Einführung von Tritium ein Grignard-Reagens (C³H₃MgBr) angewendet. Bei dem Vitamin-D-Derivat handelt es sich um 1-Desoxy-seco-steroid mit einer geschützten 3-Hydroxylgruppe. Die erzielte spezifische Aktivität ist vergleichsweise gering (maximal 10,6 Ci/mMol).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue isotopisch markierte Vitamin-D-Derivate zur Verfügung zu stellen, die sich gegenüber den bekannten Verbindungen dieser Art durch eine deutlich höhere spezifische Aktivität auszeichnen und auf vergleichsweise einfachem Wege herstellbar sind, wobei auch eine präzise Markierung des Moleküls sichergestellt sein soll. Dabei soll auch dem Umstand Rechnung getragen werden, daß die α-hydroxilierte Form des Vitamin-D₃ im allgemeinen als die physiologisch aktive oder hormonelle Form des Vitamins und als verantwortlich dafür angesehen wird, was als die Vitamin-D-artigen Wirksamkeiten bezeichnet wird, wie die Verstärkung der intestinalen Absorption von Calcium und Phosphat, die Mobilisierung von Knochenmineral und die Retention von Calcium in den Nieren.

Die zur Lösung der Erfindungsaufgabe vorgeschlagenen Verbindungen sind im Anspruch 1 angegeben. Sie zeichnen sich durch eine unerwartet hohe spezifische Aktivität aus, die bis zu 160 Mi/mMol betragen kann. Von der Erfindung bevorzugte Verbindungen sind die radiomarkierten Derivate von 25-Hydroxycholecalciferol (25-OH-D₃) und 1, 25-Dihydroxycholecalciferol (1a,25-(OH)₂D₃) sowie die 24-Hydroxyanalogen dieser Verbindungen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können, wie nachfolgend im einzelnen beschrieben wird, in vergleichsweise einfacher Weise durch Synthesen mit metallorganischen Verbindungen erhalten werden. Dabei ergeben sich folgende Vorteile:

• 1. Das gewünschte Isotop wird in der letzten Stufe der Synthese mit Radionukliden eingeführt;
• 2. es werden die Unsicherheiten, Unzuverlässigkeiten und großen praktischen Schwierigkeiten sowie Gefahren vermieden, die mit der Handhabung von Radionukliden über eine mehrstufige chemische Synthese verbunden sind;
• 3. es können radiomarkierte Verbindungen mit sehr hoher spezifischer Aktivität hergestellt werden;
• 4. neben der Einführung von ³H können auch noch andere Isotope von Kohlenstoff oder Wasserstoff auf einfache Weise eingeführt werden.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann ein Ester von 24-X-26,27-Dinor-Vitamin-D-25-carbonsäure (worin X ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeuten) oder ein Ester der 1α-Hydroxy-24-X-26,27-Dinor- Vitamin-D-25-carbonsäure mit einem Grignard-Reagens wie C³H₃MgBr oder anderen Alkylmetallen, wie C³H₃Li oder den analogen ¹³C- oder ¹⁴C-markierten Grignard- oder Methyl- lithium-Reagentien erhalten werden. Die Verbindungen gemäß den nachfolgenden Formeln, V, VI, VII und VIII, in denen R eine Alkylgruppe mit etwa 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, stellen Beispiele für die vorerwähnte Behandlung mit den metallorganischen Verbindungen dar.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt somit grundsätzlich in zwei Stufen: Die Synthese von geeigneten nicht markierten Ausgangsverbindungen, z. B. den Vitamin-D-Derivaten von Typ V bis VIII und die anschließende Einführung der gewünschten isotopischen Markierung in den 26- und 27-Stellungen. Die Ausgangsverbindungen können ihrerseits nach dem nachstehend angegebenen Verfahrensschema 1 aus den Estern von der Homocholensäure oder hydroxysubstituierten Homocholensäureestern erhalten werden.

Verfahrensschema 1

Wenn nachfolgend von dem Substituenten X die Rede ist, dann ist damit der Substituent in Stellung 24 gemeint.

In den in dem vorstehenden Schema gezeigten Formeln stellt R einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffen dar, R¹ ist eine Alkoholschutzgruppe, wie eine Acylgruppe (z. B. Acetyl oder Benzoyl), X und Y können jeweils Wasserstoff oder Hydroxyl sein, und X¹ und Y¹ können jeweils Wasserstoff oder O-Acyl sein. Die Herstellung der Verbindungen V-VIII umfaßt dann die Umwandlung der Acyl-geschützten Homocholensäureester (I) (selbst hergestellt durch Acylieren von freien Hydroxygruppen, nach wohlbekannten Acylierungsverfahren, z. B. Behandlung mit Essigsäureanhydrid/Pyridin, oder Benzoylchlorid/Pyridin) in das entsprechende 5,7-Dien (2), unter Anwendung von beispielsweise der Dehydrogenierungsverfahrensweise von Hunzicker und Müllner (Helv. Chim. Acta, 61, 70, (1958)). Die anschließende Entfernung der Acylschutzgruppen durch Hydrolyse unter milden, alkalischen Bedingungen, ergibt den Hydroxyester 3. Dieses Dien wird in das gewünschte Vitamin-D-Produkt nach der wohlbekannten Verfahrensweise umgewandelt durch Bestrahlen mit Ultraviolettlicht, unter Bildung des Prävitamin-D-Zwischenprodukts, das dann thermisch zu dem Vitamin-D-Ester (V bis VIII) isomerisiert wird. Diese Umwandlungen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt (vergleiche beispielsweise US-Patentschriften 39 07 843, 37 41 996 und 37 72 361). Alternativ kann das Acyl-geschützte 5,7-Dien-Zwischenprodukt der Struktur 2 selbstverständlich direkt bestrahlt werden unter Bildung des acylierten Prävitamin-D-Ester-Zwischenprodukts, das dann thermisch isomerisiert wird (d. h. Erwärmen auf 80-90°C in Anwesenheit einer milden Base (z. B. 10% KOH/Methanol)), unter Bewirkung sowohl der Umwandlung in die Vitamin 5,6-cis-Trien-Struktur als auch der Entfernung der Acylgruppen unter Bildung der Endprodukte der Struktur V-VIII.

Die Herstellung der Vitamin-D-Ester, V, kann durch direkte Anwendung des vorstehenden Schemas auf Homocholensäureester oder 3-O-Acylderivate davon (z. B. vorstehende Struktur 1, worin R Methyl ist, R¹ Benzoyl ist, X¹ Wasserstoff ist) erzielt werden, die bekannte Verbindungen sind (vergleiche beispielsweise Campbell et al, Steroids, 13, 567-577 (1969)).

Die Vitamin-D-Ester der Strukturen VI-VIII können in gleicher Weise hergestellt werden durch Anwendung bekannter Verfahren, wie nachstehend beschrieben.

Ein zweckmäßiges Verfahren zur Herstellung der 1α-Hydroxyvitamin- D-Ester der allgemeinen Struktur VI und VIII umfaßt die direkte C-1-Hydroxylierung von Verbindungen V oder VII unter Anwendung der allgemeinen Verfahren von Paaren et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., 75, 2080 (1978)). Dieses Verfahren wird in dem Verfahrensschema 2 umrissen:

Verfahrensschema 2

In den Strukturen des vorstehenden Verfahrensschemas, stellt R einen Alkylrest mit etwa 1 bis 4 Kohlenstoffen dar, R¹ bezeichnet eine Acyleinheit, wie Acetyl oder Benzoyl, X kann Wasserstoff oder Hydroxy sein, X¹ kann Wasserstoff oder ein O-Acylsubstituent sein, und Z stellt typischerweise einen Alkylrest dar, wie Methyl oder Äthyl, Propyl, usw., obwohl Zwischenprodukte, worin Z Wasserstoff oder eine Acylgruppe (Acetyl, Benzoyl) ist, ebenfalls für die anschließende Umwandlung geeignet sind, wie in dem Schema gezeigt wird.

Das Verfahren umfaßt die Tosylierung des Hydroxyesters V (oder VII) zu der 3-O-Tosylverbindung, gefolgt von der direkten Solvolyse dieses Tosylats in einem alkoholischen Lösungsmittel (z. B. Methanol, Äthanol, usw. enthaltend einen geeigneten Puffer, wie Natriumacetat oder Natriumbicarbonat, unter Bildung des Cyclovitamin-Zwischenprodukts 4 (worin Z eine Alkylgruppe entsprechend dem Alkylrest des in der Solvolysereaktion verwendeten Lösungsmittels, z. B. wenn Methanol verwendet wird, Z = Methyl, wenn ein wäßriges Lösungsmittel verwendet wird, Z = H, usw. darstellt). Die Behandlung des Zwischenprodukts 4 mit Selendioxid und Hydroperoxid oder Alkylhydroperoxid (z. B. t-Butylhydroperoxid) führt dann zu dem 1α-Hydroxycyclovitamin-D- Zwischenprodukt 5, das nach Standardmethoden zu 6 acyliert wird. Die Solvolyse der Verbindung 6 in Ameisensäure führt zu einem Gemisch von 1-O-Acyl-Vitamin-D-carbonsäureester-3-formiat und dem entsprechenden 5,6-trans-Isomeren. Die Formylgruppe wird durch Hydrolyse unter sehr milden Bedingungen entfernt, die die Estergruppen am C-1 oder C-25 nicht hydrolysieren, und das Gemisch wird anschließend durch Chromatografie (Dünnschicht- oder Hochdruckflüssigkeits-Chromatografie) fraktioniert unter Bildung des reinen 1α-O-Acyl-Zwischenprodukts der allgemeinen Struktur 7. Die anschließende basische Hydrolyse in alkoholischer Base entfernt die Acylgruppe und ergibt den gewünschten 1α-Hydroxy-Vitamin-D-Ester der Strukturen VI oder VIII. Ester der allgemeinen Struktur VI oder VIII sind neue Verbindungen.

Eine alternative Herstellung für 1α-Hydroxyverbindungen VI oder VIII aus Homocholensäureestern wird in dem Verfahrensschema 3 umrissen, worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt, X Wasserstoff oder Hydroxy sein kann, R¹ eine Acylgruppe, wie Acetyl oder Benzoyl ist, und X¹ Wasserstoff oder O-Acyl ist. Dieses Verfahren umfaßt die Einführung einer 1α-Hydroxyfunktion über ein Zwischenprodukt 1α, 2α-Epoxy-4,6- dien-3-on-steroid (z. B. Produkt 9), unter Verfolgung der allgemeinen Verfahren von Barton et al., (J. Am. Chem. Soc, 95, 2748 (1973)). Die Umwandlung der resultierenden 1α-Hydroxy- 5-en-verbindung (Verbindungen 10 und 11) in das 5,7-Dien (z. B. 12) und die anschließende Bestrahlung und thermische Isomerisierung folgen üblichen Verfahrensweisen, die bereits in Verbindung mit dem Verfahrensschema 1 diskutiert wurden, unter Bildung der gewünschten 1α-Hydroxyverbindungen VI oder VIII.

Verfahrensschema 3

Zur Herstellung von 24-Hydroxyvitamin-D-Estern der allgemeinen Strukturen VII und VIII nach den in den vorstehenden Schemata 1, 2 oder 3 umrissenen Verfahren wird als Grund-Vorläufer ein 24-hydroxylierter Homocholensäureester benötigt. Derartige Verbindungen können nach verschiedenen Methoden hergestellt werden. Ein zweckmäßiger Weg zu 24-Hydroxycholensäureestern wird im Verfahrensschema 4 veranschaulicht.

Verfahrensschema 4

Der 22-Aldehyd 13, der leicht aus Stigmasterin nach dem Verfahren von Partridge et al. (Helv. Chim. Acta, 57, 764 (1974)) erhältlich ist, wird kondensiert (Aldolreaktion) mit Brenztraubensäure unter Bildung, nach Verestern, des ungesättigten Ketoesters 14, worin R ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, unter Anwendung von beispielsweise den allgemeinen Verfahren von Eyley und Williams (J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. Seite 727 und 731 (1976)). Die Behandlung des Esters 14 mit NaBH₄ in Pyridin bewirkt die Reduktion von sowohl der Doppelbindung als auch der Ketogrupe und ergibt den Hydroxyester 15 (vergleiche Eyley und Williams, vorstehend). Die Solvolyse der Verbindung 15 unter Anwendung üblicher Bedingungen (vergleiche beispielsweise Partridge et al., vorstehend) führt zu dem 24-Hydroxy-homocholensäureester 16, worin R ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist und R¹ Wasserstoff oder eine Acylgruppe (z. B. Acetyl) sein kann, in Abhängigkeit von den gewählten Solvolysebedingungen.

Die Verbindug 16 kann leicht in den 24-Hydroxyvitamin-D-Ester VII nach dem in Verfahrensschema 1 gezeigten Verfahren umgewandelt werden.

Der Ester VII kann seinerseits als Ausgangsmaterial für die Herstellung des 1α-24-Dihydroxyvitamin-D-Esters VIII gemäß dem Verfahren des Verfahrensschemas 2 dienen. Alternativ kann die Verbindung 16 (mit R¹ = H) umgewandelt werden in den 1α,24- Dihydroxyester VIII, nach dem im Verfahrensschema 3 gezeigten Verfahren.

C-24-hydroxylierte Homocholensäureester-Analoge können auch zweckmäßig hergestellt werden aus 24,25-Dihydroxycholesterin oder aus 1α-Trihydroxycholesterin, die beide bekannte Verbindungen sind (Lam et al., Biochemistry, 12, 4851 (1973); Seki et al., Chem. Pharm. Bull. (Japan), 21, 2783-2785 (1973); Ikekawa et al., Chem. Pharm. Bull. (Japan), 23, 695-697 (1975)). Die Umwandlung dieser Cholesterinderivate in 24-Hydroxy-homocholensäureester oder 1α,24-Dihydroxyhomocholensäureester wird im Verfahrensschema 5 gezeigt.

Verfahrensschema 5

Die Behandlung einer Methanollösung des 24,25-Dihydroxycholesterin- Ausgangsmaterials (17, worin Y=Wasserstoff oder Hydroxy ist) mit einem Überschuß einer gesättigten Methanollösung von Natriummetaperjodat bei Raumtemperatur während 2 Stunden führt zu dem erwarteten Spaltungsprodukt, dem 24-Aldehyd 18. Dieses Zwischenprodukt kann (nach Schutz der Hydroxyfunktionen als Silyläthern) direkt mit 2-Lithio-2-methylmercapto-1,3-dithian (Methode A, Verfahrensschema 5) alkyliert werden, und das resultierende 24-Hydroxy-25-orthotrithioester-Addukt kann direkt in den 24-Hydroxy-homocholensäureester 19 umgewandelt werden durch oxidative Alkoholyse des Orthothioesters. (Seebach, Angew. Chem., 79, 469-470 (1969); Seebach, Synthesis, Seite 17-36 (1969); Ellison et al.; J. Org. Chem., 37, 2757 (1972)).

Alternativ (Methode B, Verfahrensschema 5) kann das 24-Aldehyd- Zwischenprodukt 18 in das 24-Thioacetal 20 umgewandelt werden durch Behandeln mit 1,3-Propandithiol in Chloroformlösung, die BF₃-Ätherat als Katalysator enthält. Die Reaktion der Verbindung 20 (nach zeitweiligem Blockieren der Hydroxylgruppen als Ätherfunktionen, z. B. Trimethylsilyläther) mit n-Butyllithium in Tetrahydrofuranlösung bei niedriger Temperatur (-20° bis -70°C) unter Stickstoff- oder Argon-Atmosphäre führt zur Erzeugung des 24-Lithioderivats, das direkt carboäthoxyliert werden kann durch Zusatz eines Überschusses von Alkylchlorformiat (z. B. Äthylchlorformiat) gemäß den allgemeinen Verfahren von Corey und Seebach (Angewandte Chemie, 77, 1135-1136 (1965)), unter Bildung des 24-Thioketal-25-carbonsäureester-Zwischenprodukts. Die Behandlung dieses Esters mit HgO/HgCl₂ in wäßrigem Aceton führt zur Hydrolyse des Thioketals unter Bildung des α-Ketoesters 21, der direkt mit NaBH₄ in Methanol zu dem gewünschten 24-Hydroxy-25-homocholensäureester der Struktur 19 (worin R ein Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffen ist und Y Wasserstoff oder Hydroxy ist) reduziert werden kann. Der Ester 19 (mit Y=Wasserstoff) kann nach geeigneter Acylierung der Hydroxygruppen (z. B. Acetylierung oder Benzoylierung) dann umgewandelt werden, in den 24-Hydroxyvitamin-D-Ester VII nach der Methode des Verfahrensschemas 1, wohingegen der Ester 19 (mit Y=Hydroxy) den entsprechenden 1α-25-Dihydroxyvitamin-D₃-Ester VIII nach dem gleichen Verfahren ergibt.

Aus den Vitamin-D-Estern der Struktur V bis VIII können die gewünschten 26,27-radiomarkierten Vitamin-D-Metabolite gemäß der Erfindung in einer einzigen Endstufe hergestellt werden, die darin besteht, die Verbindungen V, VI, VII oder VIII mit einem radiomarkierten Methyl-Grignard-Reagens (z. B. C³H₃- Methylmagnesiumbromid oder Methylmagnesiumjodid) oder einem radiomarkierten Methyllithiumreagens C³H₃Li, zu behandeln.

Die Radiomarkierungsreaktionen können zweckmäßig durchgeführt werden durch Reaktion einer Ätherlösung des entsprechenden Vitamin-D-Esters (z. B. Verbindungen V-VIII) mit einer Ätherlösung des gewünschten radiomarkierten Grignard-Reagens oder Methyllithiumreagens unter Eisbadkühlung, sollte während des Vermischens der Reaktionskomponenten die Reaktion zu heftig verlaufen. Die Reaktion wird anschließend bei Raumtemperatur während eines Zeitraums von etwa 1 Stunde durchgeführt, und das radiomarkierte Produkt wird anschließend nach den Standardaufarbeitungsverfahren, die geeignet für Reaktionen vom Grignardtyp sind, isoliert (z. B. Zusatz von H₂O oder verdünntem, wäßrigem NH₄Cl und Äther, Abtrennen, Waschen und Trocknen der Ätherphase, gefolgt vom Verdampfen des Lösungsmittels). Die Reinigung des Produkts unter Anwendung beispielsweise der Hochdruck­ flüssigkeitschromatografie (HPLC) an mikroteilchenförmigen Siliziumdioxidgel-Säulen vervollständige die Synthese. Selbstverständlich ist es wesentlich, daß diese Arbeitsgänge in Laboratorien durchgeführt werden, die für eine sichere Handhabung der Radionuklide mit hoher spezifischer Aktivität ausgerüstet sind.

Die erforderlichen radiomarkierten Reagentien sind erhältlich von Lieferanten für Radiochemikalien (z. B. New England Nuclear, Boston, Mass.). Reagentien mit sehr hoher spezifischer Aktivität sind verfügbar (z. B.C³H₃MgBr 80 Ci/mMol). Die Anwendung derartiger Reagentien in dem vorstehend beschriebenen Verfahren führt beispielsweise zu 26,27-tritiierten Vitamin-D-Metaboliten mit einer spezifischen Aktivität von 160 Ci/mMol. Derartige Radioaktivitätsgrade wurden bisher auf dem Vitamin-D-Gebiet nicht erzielt, und es wäre tatsächlich unmöglich, Verbindungen mit einer derart hohen spezifischen Aktivität nach bisher bekannten und auf diesem Gebiet verwendeten radiochemischen Synthesen herzustellen. Durch die vorstehend beschriebene Radiosynthesemethode werden derartige Herstellungen zur Routine.

Die erfolgreiche direkte Behandlung von seco-Steroiden, wie Verbindungen V bis VIII mit radiomarkierten Grignard-Reagentien und Alkylmetallen hochspezifischer Aktivität unter Bildung radiomarkierter Vitamin-D-Derivate und Analoger ist besonders erwähnenswert und überraschend. Die bekannte Chemie des Vitamin- D-cis-Trien-Chromophors und ihrer 3,5-Cyclovitaminderivate demonstriert, daß diese Verbindungen äußerst empfindlich gegen Licht, Sauerstoff, Metallkomplexbildung, protische und Lewis- Säuren und freie Radikale sind. Sie neigen sehr stark zur Umlagerung, und die verfügbaren, angesammelten Anzeichen lassen vermuten, daß die Behandlung von V-VIII mit radiomarkierten Grignard-Reagentien oder Alkylmetallen mit hoher spezifischer Aktivität voraussichtlich eine ungünstige und irreversible Änderung des cis-Triensystems ergeben würde als Ergebnis der chemischen Natur der verwendeten Reagentien oder der Reaktionsbedingungen. Auch ergab die starke zu erwartende Strahlung, die von Reagentien mit einer hohen spezifischen Aktivität herrührt (beispielsweise 80 Ci/mMol für C³H₃MgBr), Anlaß für die große Wahrscheinlichkeit, daß eine Radiolyse durch Reagentien und eine Autoradiolyse der Produkte auftreten könnte. Es lagen daher unbekannte Faktoren vor, die zu Komplikationen bei der Synthese von radiomarkierten Vitamin-D-Verbindungen nach den hier beschriebenen Methoden führen könnten.

Die Einführung der Isotopenmarkierung als letzte Stufe bringt bestimmte weitere wichtige praktische Vorteile, da sie einen verschwenderischen Verlust an Materialien aufgrund geringer Umwandlungsausbeute vermeidet. Bei der Herstellung von Vitamin-D- Verbindungen aus dem Steroid sind die letzten Stufen, d. h. die Bildung des 5,7-Diens und die anschließende Bildung des seco-Steroids durch Bestrahlung jeweils Umwandlungen mit geringer Ausbeute (z. B. 20-40%). Wird folglich die Markierung in der Steroidstufe eingeführt, so geht wertvolles Isotopenmaterial verloren, und das kostspielige Reagens wird aufgrund dieser Stufen mit niedriger Ausbeute verschwendet. Diese Verluste machen es ihrerseits notwendig, daß das Markierungsverfahren in einem relativ hohen Maßstab durchgeführt wird (was die Verwendung großer Mengen an kostspieligem Isotopenreagens erfordert, was besonders unzweckmäßig im Falle großer Mengen an gefährlichem Radioisotop ist), um brauchbare Mengen des gewünschten radiomarkierten Produkts zu gewinnen. Darüber hinaus erfordert die Isolierung des Produkts aus den Reaktionsstufen mit niedriger Ausbeute, die vorstehend erwähnt wurden, eine sorgfältige und schwierige Chromatografie, die um so mühsamer und unpraktizierbar wird, wenn sie auf stark radioaktive Verbindungen angewendet wird. Das hier beschriebene neue Verfahren schaltet alle diese Probleme aus. Eine Reaktion vom Grignardtyp für die Einführung der Markierung läßt sich leicht durchführen (selbst mit hochradioaktiven Reagentien), und wenn die Markierung als letzte Stufe eingeführt wird, werden keine weiteren chemischen Handhabungen benötigt, und die Isolierung des Produkts erfordert gewöhnlich nicht mehr als eine einzige chromatografische Reinigungsstufe.

Jedes Verfahrensschema, bei dem die Radiomarkierung in einer frühen Stufe eingeführt wird, erfordert die Herstellung des gewünschten radiomarkierten Produkts in Mengen, die derart berechnet sind, daß sie dem erwarteten Bedürfnis nach dem Produkt während eines langen Zeitraums entsprechen, einfach, um die Notwendigkeit zu vermeiden, ein schwieriges und gefährliches Verfahren häufig zu wiederholen. Abgesehen von den zahlreichen praktischen Problemen des mehrstufigen Verarbeitens großer Mengen an Radionukliden stellt darüber hinaus die Lagerung der gewünschten Produkte während längerer Zeiträume selbstverständlich einen weiteren großen Nachteil dar, da alle radiomarkierten Materialien zersetzt werden, entweder durch den natürlichen Zerfall des Isotops, der zu einem Velust an spezifischer Aktivität führt, und/oder durch Radiolyse (insbesondere bei markierten Präparaten mit hoher spezifischer Wirksamkeit), die zu sehr komplizierten Produktgemischen führen kann. Bei dem beschriebenen Verfahren werden diese Schwierigkeiten wirksam überwunden, da die Bildung des radiomarkierten Produkts aus einem stabilen, zweckmäßig hergestellten Vorläufer (d. h. Verbindungen V, VI, VII oder VIII, die unbegrenzt als Kristalle oder in sauerstofffreien Lösungen in der Kälte gelagert werden können) in einer einzigen, leicht wiederholbaren Stufe, die Möglichkeit bietet, die Menge des radiomarkierten Produkts - sowie die Natur des spezifischen, eingeführten Isotops - den jeweiligen unmittelbaren Erfordernissen anzupassen.

Das beschriebene Verfahren stellt die einzige bisher vorgeschlagene Methode dar, die geeignet ist für die Synthese von tritiiertem 25-Hydroxyvitamin-D-3 mit einer spezifischen Aktivität von größer als 100 Ci/mMol und ist die erste strikt chemische Methode für die Synthese des Schlüsselhormons 1,25-Dihydroxyvitamin-D₃ in radioaktiver Form.

Acylierte Derivate oder andere O-geschützte Derivate (z. B. O-Silylester) von Vitamin-D-Estern der Struktur V bis VIII sind selbstverständlich geeignete, alternative Ausgangsmaterialien zur Einführung des isotopischen Markierung am Kohlenstoff-26 und 27. Derartige O- geschützte Derivate sind als Zwischenprodukte für die Herstellung von Estern V-VIII verfügbar oder werden leicht hergestellt aus Estern V-VIII durch Acylieren oder Silylieren.

Es sei erwähnt, daß bestimmte Zwischenprodukte der Synthesen von Vitamin-D-Estern V bis VIII ebenfalls geeignete Substrate für die Einführung isotopischer Markierungen sind, und derartige markierte Zwischenprodukte können anschließend in die markierten Vitamin-D-Substanzen gemäß der Erfindung umgewandelt werden. Beispielsweise ergeben die Cyclovitamin-D-Zwischenprodukte der Struktur 5 und 6 im Verfahrensschema 2 bei der Behandlung mit dem entsprechend radiomarkierten Reagens vom Grignard-Typ die entsprechende 26,27- markierte 1α,25-Dihydroxy-24-X-cyclovitamin-D-verbindung, die nach den vorstehend zitierten Verfahren von Paaren et al. leicht umgewandelt werden kann in das 26,27-markierte 1α,25-Dihydroxy- 24-X-vitamin-D₃. Das Zwischenprodukt 4 des Verfahrensschemas 2, behandelt in analoger Weise, führt zu 26,27-markiertem 25-Hydroxy-24-X-vitamin-D₃. In gleicher Weise können die 5,7-Dien-Zwischenprodukte der Strukturen 2 oder 3 des Verfahrensschemas 1 umgewandelt werden in 26,27-markierte 5,7-Dien-Steroide, die nach der üblichen Bestrahlungs/thermischen Isomerisierungs-Folge jegliche Verbindungen gemäß der Erfindung ergeben. Da mit derartigen Zwischenprodukten die Einführung der Markierung in einer Stufe erfolgt, die von dem Endprodukt weiter entfernt ist, sind derartige Modifikationen des allgemeinen Verfahrens im allgemeinen nicht bevorzugt. Die stellen jedoch eine attraktive Alternative unter bestimmten Umständen dar. Beispielsweise kann die Herstellung von 26,27-markierter 1α,25-Dihydroxy-cyclovitamin-D- verbindung aus den Zwischenprodukten 5 oder 6 (Verfahrensschema 2) vorteilhaft sein, wenn sowohl das 5,6-cis- als auch das entsprechende 5,6-trans-26,27-markierte-1α,25-Dihydroxy-24-X- vitamin-D-produkt gewünscht werden, da beide bei der Solvolyse des Cyclovitamins nach den Verfahren von Paaren et al. gebildet werden. In gleicher Weise kann die Einführung der Radiomarkierung in 5,7-Dien-Zwischenprodukte (z. B. Verbindungen 3 oder 12) angezeigt sein, wenn die 26,27-markierten Prävitamin-D- Verbindungen (oder 26,27-markierten Tachysterinverbindungen) gewünscht werden, da letztere Zwischenprodukte der Bestrahlung der 5,7-Diene sind.

In den folgenden Beispielen wurden Ultraviolettabsorptions-(UV)- Spektren in Äthanol mit einem Beckmann Aufzeichnungs-Spektrofotometer, Modell 24 (Beckman Instruments, Fullerton, Cal.) aufgenommen; kernmagnetische Resonanz-(NMR)-Spektren wurden in CDCl₃ mit einem Bruker WH-270-Spektrometer (Bruker Instruments, Inc., Wheaton, Ill.) erhalten; Massenspektren wurden bei 100°C über Umgebung mit einem AEI (Associated Electrical Industries) MS-9, gekoppelt an ein DS50-Datensystem, erhalten; Hochdruck­ flüssigkeitschromatografie (HPLC) wurde mit einem Waters Associates Modell ALC/GPC-204 Flüssigkeitschromatografen (Waters Associates, Milford, Mass.) durchgeführt; Bestrahlungen wurden in einem Quarzreaktionsgefäß mit einer 125 W Hanovia 8A36 Lampe, ausgerüstet mit einem Corex-Filter, durchgeführt; Radioaktivität wurde mit einem Flüssig-Szintillationszähler Packard Modell 3255 (Packard Instrument Company, Inc., Downers Grove, Ill.) gemessen. Sephadex LH-20 ist ein Hydroxypropylätherderivat eines Polydextrans, Handelsprodukt der Pharmacia Chemicals, Piscataway, New Jersey; Lipidex 5000 ist ein 50% gesättigtes Hydroxyalkoxypropylierungsprodukt von Sephadex LH-20, mit einer durchschnittlichen Alkoxygruppenkettenlänge von 15 Kohlenstoffen, erhältlich von Packard Instruments, Inc., Downers Grove, Ill.; die halbpräparative HPLC-Säule war 0,6 × 25 cm und war gepackt mit mikroteilchenförmigen Siliziumdioxidgel (5 Mikron Teilchen), präparative Schichtchromatografie wurde an 20 × 20 cm Siliziumdioxidgelplatten mit einer Bettdicke von 0,75 oder 0,25 cm durchgeführt.

Die Strukturbezeichnungen in den folgenden Beispielen mit römischen oder arabischen Ziffern beziehen sich auf die in der vorstehenden Beschreibung und den Verfahrensschemata derart identifizierten Strukturen.

Beispiel 1 Herstellung von 25-Hydroxy(26,27-³H)-vitamin D₃

Eine Lösung von 1 mg (2,5 µMol) 26,27-Dinorvitamin-D₃-25-carbon- säuremethylester (Verbindung V, R=Methyl) in trockenem Äther wird mit einem Überschuß von D³H₃MgBr (80 Ci/mMol in Äther) während 1 Stunde bei Raumtemperatur (unter Argonatmosphäre) behandelt. Anschließend wird zu dem Reaktionsgemisch Wasser gefügt, die Ätherschicht wird abgetrennt, und die wäßrige Schicht wird zwei weitere Male mit Äther extrahiert. Die vereinten Ätherfraktionen werden mit Wasser und Salzlösung gewaschen, Lösungsmittel wird verdampft, und der Rückstand wird gereinigt durch Chromatographie durch Säulen von Sephadex LH-20 (2 × 50 cm), entwickelt mit CHCl₃/Hexan (1 : 1) und Lipidex 5000 (1 × 50 cm) unter Verwendung von CHCl₃/Hexan (1 : 10) unter Bildung von 32 mCi von 25-Hydroxy-(26,27-³H)-Vitamin-D₃ (I, X=H). Das so gereinigte Produkt (160 Ci/mMol) ist mindestens 96% rein, bestimmt durch HPLC (0,45 × 25 cm, Säule mit mikroteilchenförmigem Siliziumdioxidgel, 4% Propanol in Hexan als Eluierlösungsmittel).

Beispiel 2 Herstellung von 1α,25-Dihydroxy-(26,27-³H)-Vitamin-D₃

Ein großer Überschuß von (³H)-Methylmagnesiumjodid wird frisch hergestellt aus (³H)-Methyljodid (80 Ci/mMol) und Magnesiumpulver in trockenem peroxidfreiem Äther und wird tropfenweise zu einer gerührten Lösung der Verbindung VI (R=Methyl) in Äther unter Argon gefügt. Nach beendeter Zugabe wird das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Wasser wird vorsichtig zugesetzt, und die wäßrige Phase wird mehrfach mit Äther extrahiert. Die vereinten Ätherphasen werden mit Wasser und Salzlösung gewaschen. Das Lösungsmittel wird entfernt, und der Rückstand wird durch azeotrope Destillation von Wasser mit Benzol getrocknet. Der Rückstand wird in 10 ml Säulenlösungsmittel auf eine Sephadex-LH-20-Säule (2 × 65 cm) aufgetragen und mit Chloroform/Hexan (13 : 7) eluiert. Das gewünschte Produkt eluiert von 900 bis 1100 ml. Im HPLC (0,62 × 25 cm mikroteilchenförmige Siliziumdioxidgelsäule) entwickelt mit 12% 2-Propanol/Hexan, eluiert 1α,25-Dihydroxy- (26,27-³H)-Vitamin-D₃ (160 Ci/mMol) bei etwa 52 ml und ist homogen. Das Produkt zeigt ein Ultraviolettabsorptionsmaximum bei 263 nm, und zeigt ein Molekularion bei m/e 428 in seinem Massenspektrum, was die Einführung von sechs Tritiumatomen anzeigt.

Herstellung der Ausgangsverbindungen Beispiel 3 Herstellung von 26,27-Dinorvitamin-D₃-25-carbonsäuremethylester (Verbindung V, R=Methyl) a) Methyl-3β-hydroxy-25-homo-5,7-choladien-25-oat (3, worin X=Y=H und R=Methyl)

Methyl-3β-hydroxy-25-homo-5-cholen-25-oat-3-benzoat, 1(X¹= Y¹=H, R=Methyl, R¹=Benzoyl) (0,5 g, 0,99 mMol), Natriumbicarbonat (0,55 g, 6,5 mMol) und 1,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin (0,16 g, 0,56 mMol) in Hexan (10 ml) werden unter Stickstoff 20 Minuten bei 80°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend gekühlt und filtriert. Der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels aus dem Filtrat erhaltene Rückstand wird in einer Lösung von 2,4,6-Trimethylpyridin (1 ml) in Xylol (10 ml) gelöst und unter Rückfluß unter Stickstoff 1,5 Stunden erwärmt. Das Reaktionsgemisch wird gekühlt, mit Benzol verdünnt und nacheinander mit 1 n HCl, verdünntem NaHCO₃ und Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand wird in einer Lösung von p-Toluolsulfonsäure (0,06 g) in Dioxan (12 ml) gelöst und 40 Minuten bei 70°C erwärmt. Nach dem Kühlen des Reaktionsgemischs werden Wasser und Äther zugesetzt. Die Phasen werden getrennt, und die organische Phase wird mit verdünntem Natriumcarbonat, Wasser und Salzlösung gewaschen. Das Lösungsmittel wird entfernt, und der Rückstand (Verbindung 2, worin X¹ =Y¹=H, R=Methyl und R¹ ist Benzoyl) wird gelöst in einem Gemisch von Äther (3,0 ml) und 0,4 m methanolischem Kaliumhydroxid (5 ml). Nach 2,5 Stunden bei Raumtemperatur werden Wasser und Äther zugesetzt, und die organische Phase wird abgetrennt und wiederholt mit Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wird verdampft, und der Rückstand wird an einer Siliziumdioxidgelsäule (1 × 15 cm), eluiert mit 25% Äthylacetat/Hexan, chromatografiert unter Bildung des Produkts Methyl-3β-hydroxy- 25-homo-5,7-choladien-25-oat (3, X=Y=H, R=Me) (0,08 g, 0,2 mMol): UV 294, 282, 272, 264 (Schulter) nm; NMR 0,67 (s, 18-CH₃), 1,01 (d, J=6,5 Hz, 21-CH₃), 1,04 (s, 19-CH₃), 3,72 (s,-CO₂CH₃), 5,43, 5,64 (2m, 6H, 7H).

b) Methyl-3β-hydroxy-25-homo-9,10-secochola-5,7,10(19)-trien- 25-oat. (26,27-Dinorvitamin-D₃-25-carbonsäuremethylester, Verbindung V, R=CH₃).

Eine Lösung von Methyl-3b-hydroxy-25-homo-5,7-choladien-25-oat (28 mg) in 20% Äthanol/Benzol (150 ml) unter Stickstoff, gekühlt in einem Eisbad, wird mit UV-Licht 7,5 Minuten bestrahlt. Die Lösungsmittel werden verdampft, und der Rückstand wird durch HPLC (10,6 × 25 cm mikroteilchenförmiges Siliziumdioxidgel- Säule, entwickelt mit 1,5% 2-Propanol/Hexan) gereinigt, unter Bildung des Ausgangsmaterials (23 mg) und des gewünschten Prävitaminesters (5 mg): UVg _max 260, λ _min 233 nm, λ _max /λ _min 1,5.

Der Prävitaminester wird unter Rückfluß unter Stickstoff in Äthanol während 4,5 Stunden erwärmt unter Bewirkung einer Doppelbindung- Isomerisierung und Bildung des entsprechenden Vitaminesters V (R=CH₃): UV λ _max 264, λ _min 228, λ _max /λ _min 1,8; NMR 0,54 (s, 18-CH₃), 0,94 (d, J=6,2 Hz, 21-CH₃), 3,67 (s, -CO₂CH₃), 3,94 (m, 3α-H), 4,82, 5,05 (2m, 19-H's), 6,03, 6,23 (ABq, J=Hz, 6H, 7H); Massenspektrum m/e (relative Intensität) 400 (0,85, M⁺), 382 (0,07 M⁺-H₂O), 369 (0,09, M⁺-OCH₃), 367 (0,35, M⁺-H₂O-CH₃), 341 (0,10, M⁺-CO₂CH₃), 271 (0,16, M⁺-Seitenkette), 253 (0,21, M⁺-H₂O-Seitenkette), 166 (0,31), 158 (0,76), 136 (1,00), 118 (0,91). Die Verbindung ist homogen durch HPLC.

Beispiel 4 Herstellung von 1α-Hydroxyvitamin-D-ester VI (R=CH₃) Cyclovitaminmethode a) 6-Methoxy-3,5-cyclo-26,27-dinorvitamin-D₃-25-carbonsäure- methylester (4, X=H, R=Z=Methyl)

Methyl-26,27-dinorvitamin-D₃-25-carbonsäuremethylester (V, R=Methyl) (25 mg) in trockenem Pyridin (0,3 ml) wird mit p-Toluol- sulfonylchlorid (50 mg) 72 Stunden in der Dunkelheit bei 5°C behandelt. Das Reaktionsgemisch wird zu 10% Natriumbicarbonat auf Eis gefügt. Die wäßrige Phase wird mit Äther/Chloroform (4 : 1) mehrfach extrahiert. Die vereinten organischen Phasen werden mit Chlorwasserstoffsäure, verdünntem Natriumbicarbonat, Wasser und gesättigtem Natriumchlorid gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Durch Verdampfen des Lösungsmittels erhält man das 3-O-Tosylderivat, das einen Fleck im TLC (40% Äthylacetat/Hexan, Rf 0,62) ergibt. Die gesamte Probe des Tosylats wird bei 55°C unter Stickstoff in einem Gemisch von trockenem Methanol (0,5 ml), Natriumcarbonat und Methylenchlorid (0,1 ml) erwärmt. Weiteres Lösungsmittel wird je nach Bedarf zum Ausgleich des Verdampfens zugesetzt. Nach 11,5 Stunden werden Äther und Wasser zugesetzt. Die Phasen werden getrennt und die organische Phase wird mehrfach mit Wasser und gesättigtem Natriumchlorid gewaschen und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Das TLC zeigt einen Hauptfleck mit einem Rf von 0,42 (20% Äthylacetat/Hexan), der den Cyclovitaminester 4 (R=Z=Me, X=H) darstellt.

1α-Hydroxy-6-methoxy-3,5-cyclo-26,27-dinorvitamin-D₃-25- carbonsäuremethylester (5, R=Z=Methyl, X=Wasserstoff)

Zu Selendioxid (2,8 mg) in trockenem Methylenchlorid (1 ml) bei 0° wird t-Butylhydroperoxid (11 µl) gefügt. Das Gemisch wird 30 Minuten unter Stickstoff gerührt. Cyclovitamin 4 (R=Z=Methyl, X=H) in Methylenchlorid (1 ml) wird in einer Portion zugesetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 0° gerührt und weitere 7 Minuten bei Raumtemperatur und mit gesättigtem Natriumbicarbonat abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wird mit Methylenchlorid mehrfach extrahiert, und die vereinten organischen Phasen werden mit Wasser gewaschen, mit Natriumchlorid gesättigt und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Der Rückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatografie (50% Äthylacetat/Hexan) gereinigt unter Bildung der 1α-Hydroxyverbindung 5 (8,5 mg, Rf 0,35) und des entsprechenden 1-Ketoderivats (5,8 mg, Rf 0,58). Die Verbindung 5 (R=Z=Me, X=H) ist homogen im TLC.

c) 1a-Acetoxy-6-methoxy-3,5-cyclo-26,27-dinorvitaminisierter- D₃-25-carbonsäuremethylester (6, R=Z=Methyl, R¹=Acetyl, X=Wasserstoff)

1α-Hydroxycyclovitamin 5 (R=Z=Me, X=H) (8,5 mg) und Essigsäureanhydrid (0,1 ml) in trockenem Pyridin (0,2 ml) werden unter Stickstoff 1,5 Stunden bei 55° erwärmt. Das Reaktionsgemisch wird auf Eis gegossen, und Kaliumcarbonat wird zugesetzt, bis das Schäumen aufhört. Das Gemisch wird mit Äther extrahiert, mit Wasser gewaschen und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Durch Verdampfen des Lösungsmittels erthält man 8,7 mg des 1-Acetoxyprodukts (40% Äthylacetat/Hexan, Rf 0,55).

d) Reduktion von 1-Ketocyclovitamin

Der 1-Oxo-cyclovitamin-D-ester, erhalten wie in Beispiel 4 b) beschrieben, (5,8 mg) wird gelöst in Tetrahydrofuran (0,6 ml) und Methanol (0,1 ml), dem NaBH₄ (1 mg) zugesetzt werden. Wenn die Reaktion vollständig ist (0,5 Stunden) werden Wasser und Äther zugesetzt, und die Phasen werden getrennt. Durch Verdampfen des Lösungsmittels nach dem Aufarbeiten erhält man 1α-Hydroxy- cyclovitamin-D-ester 5(R=Z=Me, X=H), der gereinigt wird durch präparative Schichtchromatografie (50% Äthylacetat/Hexan, Rf 0,30).

e) 1α-Acetoxy-26,27-dinorvitamin-D₃-25-carbonsäuremethylester (7, R=Methyl, R¹=Acetyl, X=Wasserstoff)

Eine Lösung von 1α-Acetoxy-6-methoxy-3,5-cyclo-26,27-dinorvitamin- D₃-25-carbonsäuremethylester (hergestellt wie vorstehend unter c)) (8,7 mg) in trockenem 1,2-Dimethoxyäthanol (0,3 ml) wird mit Ameisensäure (0,1 ml) bei 55°C unter Stickstoff während 15 Minuten behandelt. Das Reaktionsgemisch wird auf Eis gegossen, und Natriumbicarbonat wird zugesetzt, bis das Schäumen aufhört. Das Produkt wird mit Äther extrahiert, mit Wasser gewaschen, bis die wäßrige Phase einen pH von 6 hat, mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Dieses Produkt (der 3-Formiatester) in Tetrahydrofuran (0,1 ml) und Methanol (0,3 ml) wird mit einigen Tropfen von gesättigtem Natriumbicarbonat während 5 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Wasser und Äther werden zugesetzt und die Phasen werden getrennt. Die Ätherphase wird mit Wasser gewaschen, mit Natriumchlorid gesättigt und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird durch präparative Schichtchromatografie gereinigt. Die Bande mit einem Rf von 0,2 enthält ein Gemisch von 7 (R=Me, R¹=Acetyl, X=H) und dem entsprechenden 5,6-trans-Isomeren. Das Gemisch wird durch HPLC (2,5% 2-Propanol, Hexan), mikroteilchenförmige Siliziumdioxidgel-Säule) getrennt, mit zwei Durchläufen durch die Säule (Recyclisierungsmodus) unter Bildung von 7 (2 mg) und dem entsprechenden 5,6-trans- Isomeren in reiner Form.

f) 1α-Hydroxy-26,27-dinorvitamin-D₃-25-carbonsäuremethylester (VI, R=CH₃)

Eine Lösung des Acetatesters 7 (R=Me, R¹=Acetyl, X=H) in Äther (0,2 ml) wird mit 0,1 m methanolischem Kaliumhydroxid (0,075 ml) bei Raumtemperatur behandelt. Nach etwa 1 Stunde ist die Reaktion vollständig. Wasser und Äther werden zugesetzt, und die Phasen werden getrennt. Die wäßrige Phase wird mit Äther extrahiert. Die vereinten Ätherextrakte werden mit Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Durch Verdampfen des Äthers erhielt man das gewünschte Produkt VI (R=Me) (1,87 mg), das einen Fleck bei der TLC-Analyse zeigt und bei der HPLC-Analyse homogen ist (7,5% 2-Propanol/Hexan): UVλ _max 265, λ _min 228 nm, λ _max /λ _min 1,72; NMR δ 0,54 (s, 18-CH₃), 0,94 (d, J=6,2 Hz, 21-CH₃), 3,63 (s, -CO₂CH₃), 4,21 (m, 3α--H), 4,40 (m, 1β-H), 4,96, 5,28 (19 E und Z H's), 5,97, 6,32 (AB Quartett, J=10,8 Hz, 6 und 7 H's); Massenspektrum m/e (Zusammensetzung, m/e berechnet, relative Intensität) 416,2930 (C₂₆H₄₀O₄, 416,2927, 0,10), 398,2812 (C₂₆H₃₈O₃, 398,2821, 0,09), 380,2694 (C₂₆H₂₆)₂, 380,2716, 0,22), 152,0840 (C₉H₁₂O₂, 152,0837, 0,29), 134,0745 (C₉H₁₀O, 134,0732, 1,00). Das entsprechende 5,6-trans-Isomere, 1α-Hydroxy-5,6-trans- 26,27-dinorvitamin-D₃-25-carbonsäuremethylester, wird erhalten durch Hydrolyse der 5,6-trans-1α-Acetoxyverbindung unter den gleichen Bedingungen.

Beispiel 5 Herstellung von1a-Hydroxyvitamin-D₃-ester VI (R=CH₃) aus Homocholensäureester a) Methyl-25-homo-1,4,6-cholatrien-3-on-25-oat (8, R=Methyl, X=Wasserstoff)

Ein Gemisch von Homocholensäuremethylester und 2,3-Dichlor-5,6- dicyano-1,4-benzochinon (3,5 molarer Überschuß) in trockenem Dioxan wird unter Rückfluß 20 bis 24 Stunden erwärmt. Das Reaktionsgemisch wird gekühlt und filtriert. Der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird durch eine neutrale Aluminiumoxidsäule, eluiert mit Methylenchlorid, filtriert. Das erhaltene Material wird durch Chromatografie über Siliziumdioxidgel, eluiert mit Aceton/Hexan, gereinigt und anschließend als solches für die nächste Stufe verwendet.

b) 1α,2α-Oxido-25-homochola-4,6-dien-3-on-25-säure (9, X=H)

Das wie im Teil a) erhaltene Trienon 8 wird in Äther/Methanol mit wäßrigem Kaliumhydroxid zur Umwandlung des Esters in die Säure hydrolysiert. Das gekühlte Gemisch wird mit H₂O verdünnt unt mit Äther zur Entfernung von organischem, löslichem Material extrahiert. Die wäßrige Phase wird anschließend mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure angesäuert und sorgfältig mit mehreren Portionen Äther extrahiert. Die vereinten organischen Phasen werden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Eine Portion des nach Verdampfen des Lösungsmittels erhaltenen Rückstands, äquivalent zu 3,6 mMol Steroid, wird in Methanol gelöst, so daß die Endkonzentration des Steorids 0,05 bis 0,1 m beträgt. Zu dieser Lösung werden 10% Natriumhydroxid (0,45 ml) und 30% H₂O₂ (2,5 ml) gefügt und das resultierende Gemisch wird bei Raumtemperatur 16 Stunden stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird mit methanolischer Chlorwasserstoffsäure angesäuert; das Lösungsmittel wird konzentriert; und die Ausfällung, die das gewünschte 1a,2α- Epoxyderivat 9 (X=H) darstellt, wird gesammelt und für die nächste Stufe verwendet.

c) Methyl-1α,3β-dihydroxy-25-homo-5-cholen-25-oat-1,3-diacetat (11, R=Me, R¹=Acetyl, X=Wasserstoff)

Epoxydienon 9 (X=H) (0,25 g), gelöst in trockenem Tetrahydrofuran bei -33°C, wird in einer Portion zu einer Lösung von Natrium (20-facher Überschuß) in flüssigem Ammoniak für eine endgültige Steroidkonzentration von 0,015 m gefügt. Nach 10 Minuten wird Ammoniumchlorid (2,5 g) in kleinen Portionen während 1 Stunde zugesetzt. Das Ammoniak läßt man verdampfen und 1n-Chlorwasserstoffsäure und Äther werden vorsichtig zu dem Reaktionsgemisch gefügt. Die Phasen werden getrennt, und die wäßrige Phase wird wiederholt mit Äther extrahiert. Die vereinten organischen Phasen werden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösung wird konzentriert und mit überschüssigem Diazomethan in Äther behandelt. Das Lösungsmittel wird verdampft, und der Rückstand wird durch Siliziumdioxidgel-Chromatografie, eluiert mit Aceton/Hexan, gereinigt unter Bildung des 1α-Hydroxyzwischenprodukts 10 (X=H, R=Methyl).

Diese 1α-hydroxylierte Verbindung wird erwärmt (60°C) mit Essigsäureanhydrid/Pyridin (1 : 1) bis die Acetylierung vollständig ist (etwa 3 Stunden, zweckmäßig überwacht durch TLC). Das Gemisch wird auf Eis gegossen. Äther wird zugesetzt, und Kaliumcarbonat wird zugefügt, bis das Schäumen aufhört. Die Phasen werden getrennt, und die organische Phase wird mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure, verdünntem Natriumcarbonat, Wasser und Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Durch Verdampfen des Lösungsmittels erhält man den Ester 11 (R=Methyl, R¹=Acetyl, X¹=H).

d) Methyl-1α,3b-dihydroxy-25-homo-5,7-choladien-25-oat-1,3- diacetat (12, R=Methyl, R¹=Acetyl, X¹=Wasserstoff)

Die Verbindung 11 (X=H) (1,2 mMol), Natriumbicarbonat (500 mg) und 1,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin (0,84 mMol) werden bei 75° unter Stickstoff während 20 Minuten erwärmt. Das Reaktionsgemisch wird gekühlt, filtriert und das Lösungsmittel wird entfernt. Der Rückstand wird in Xylol (15 ml) und Collidin (3,5 ml) gelöst und unter Rückfluß unter Stickstoff während 1,5 Stunden erwärmt. Benzol wird zugesetzt, und die organische Phase wird mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure, verdünntem Natriumbicarbonat, Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird in Dioxan (14 ml) gelöst, wozu p-Toluolsulfonsäure (65 mg) gefügt werden, und wird unter Stickstoff während 35 Minuten bei 70°C erwärmt. Äther wird zugesetzt, und die organische Phase wird mit verdünntem Natriumbicarbonat, Wasser, gesättigtem Natriumchlorid gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird durch Siliziumdioxidgel-Dünnschichtchromatografie, eluiert zweimal mit 10% Aceton/Hexan, gereinigt, unter Bildung des Produkts 12 (R=Me, R¹=Acetyl, X¹=H).

e) 1α-Hydroxy-26,27-dinorvitamin-D₃-25-carbonsäuremethylester (VI) (R=Me)

Eine Lösung von 5,7-Dien-Diacetat 12 (R¹=Acetyl, X¹=H, R=CH₃) (30 mg) in 20% Äthanol/Benzol (150 ml) unter Stickstoff bei 0°C wird während 20 Minuten in einem Quarzreaktionsgefäß mit einer 125-Watt-Hanovia-8A36-Lampe, ausgerüstet mit einem Corex-Filter, bestrahlt. Das Lösungsmittel wird verdampft, und das gewonnene Material wird in Äthanol gelöst und unter Rückfluß unter Stickstoff während 5 Stunden erwärmt. Das Lösungsmittel wird entfernt, und der Rückstand wird in Äther und 0,1 m methanolischem Kaliumhydroxid (2 : 1) gelöst und bei Raumtemperatur stehengelassen, bis die Hydrolyse vollständig ist (überwacht durch TLC). Wasser und Äther werden zugesetzt, und die Phasen werden getrennt. Die wäßrige Phase wird mit Äther extrahiert. Die vereinten Ätherextrakte werden mit Wasser und mit Salzlösung gewaschen. Durch Verdampfen des Lösungsmittels erhält man ein Produktgemisch, aus dem der gewünschte Vitamin-D-Ester (R=CH₃) abgetrennt wird durch HPLC- Chromatografie (0,6 × 25 cm mikroteilchenförmige Siliziumdioxidgel- Säule) unter Verwendung von 7% 2-Propanol in Hexan als Eluierlösungsmittel.

Beispiel 6 Herstellung von 24-Hydroxyvitamin-D-Ester VII (R=Methyl) a) Aldolkondensation zum Ketoester (14, R=Methyl)

Zu 20 ml Diisopropylamin in 14 ml trockenem THF, gekühlt auf 0°C, fügt man 8,9 ml n-Butyllithium (1,6 m in Hexan); 0,5 ml Brenztraubensäure in THF (1 ml) werden anschließend tropfenweise zugesetzt, und die Lösung wird 1 Stunde bei 0°C gerührt. Das Gemisch wird auf -78°C gekühlt, und 2 g des 22-Aldehyds (13), gelöst in 10 ml trockenem THF, werden zugesetzt. Nach 1 Stunde läßt man die Lösung auf 0°C erwärmen und rührt anschließend während weiterer 3 Stunden. Das Reaktionsgemisch wird 1 ml Eisessig abgeschreckt, mit Äther und H₂O verdünnt, und die Schichten werden getrennt. Die organische Phase wird mit 1 n-HCl, Wasser und gesättigtem NaCl (aq) gewaschen. Die organische Schicht wird über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird im Äther aufgenommen und mit ätherischem Diazomethan behandelt unter Umwandlung der Säure in ihren Methylester. Das resultierende Öl wird über Siliziumdioxidgel (100-200 mexh) chromatografiert mit5% Äthylacetat in Hexan als Eluiermittel unter Bildung des Ketoesters 14 (R=Methyl).

b) Reduktion der Verbindung 14 zum α-Hydroxyester 15 (R=Methyl)

Zu einer Lösung von 1 g des Enons (14) in 30 ml trockenem Pyridin werden 178 mg NaBH₄ zugesetzt, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur etwa 48 Stunden gerührt. Das Gemisch wird in H₂O gegossen und mit Äther extrahiert. Die vereinten Extrakte werden mit 1 n-HCl, 1 n-NaHCO₃, gesättigtem NaCl (aq) gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Die organische Schicht wird im Vakuum zu einem Öl konzentriert, über Siliziumdioxidgel (100-200 mesh) chromatografiert unter Verwendung von 5% Äthylacetat in Hexan als Eluiermittel und 800 mg α-Hydroxyester 15 werden erhalten.

c) Solvolyse von 15 zum 24-Hydroxyhomocholenester 16 (R=Methyl, R¹=Acetyl)

Eine Lösung von 648 mg der Verbindung 15 in 30 ml Eisessig wird 16 Stunden auf 70°C erwärmt. Die Lösung wird gekühlt und neutralisiert mit 10% NaOH (aq) (geeist). Die Lösung wird anschließend in Äther extrahiert. Die vereinten Extrakte werden mit 1 n-NCl, 1 n-NaHCO₃, gesättigtem NaCl (aq) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der rohe Feststoff wird über Siliziumdioxidgel (100-200 mesh) chromatografiert mit 5% Äthylacetat/Hexan als Eluiermittel, unter Bildung von Methyl-3β,24-dihydroxy-25-homo-5-cholen-25-oat- 3-acetat (16, worin R=Methyl, R¹=Acetyl) in etwa 80% Ausbeute.

d) Umwandlung des Esters 16 in den 24-Hydroxyvitamin-D₃-ester VII (R=Methyl)

Eine Lösung von 500 mg des Esters 16 (R¹=Acetyl, R=Methyl) in 3 ml Pyridin wird mit 1 ml Essigsäureanhydrid bei Raumtemperatur über Nacht behandelt unter Bildung des entsprechenden 3,24-Diacetats nach üblichem Aufarbeiten. Dieses Material (510 mg) wird umgewandelt in das Methyl-3β,24-dihydroxy-25-homo- 5,7-choladien-25-oat-3,24-diacetat unter Anwendung der im Beispiel 3a) beschriebenen Arbeitsweise. Die Hydrolyse des Diacetats gemäß Beispiel 3a) führt dann zum Methyl-3β,24-dihydroxy- 25-homo-5,7-choladien-25-oat (100 mg), das an einer kurzen Säule von Siliziumdioxidgel (1 × 20 cm, 100-200 mesh), eluiert mit Äthylacetat/Hexan (1 : 4) gereinigt wird, oder durch präparative Dünnschichtchromatografie (0,75 cm an Siliziumdioxidgelplatten, Äthylacetat/Hexan). Unterzieht man dieses 5,7-Dienzwischenprodukt der Bestrahlungsverfahrensweise des Beispiels 3b), erhält man den entsprechenden 24-Hydroxy- prävitamin-D-ester, der gereinigt wird durch HPLC (0,6 × 25 cm, Siliziumdioxidgelsäule, 5% 2-Propanol/Hexan-Lösungsmittel) und anschließend umgewandelt wird durch Erwärmen wie in Beispiel 3b) beschrieben in den gewünschten 24-Hydroxyvitamin- D-ester VII (worin R=Methyl). Die Reinheit wird durch HPCL bewertet und, falls notwendig, wird das Produkt durch HPLC gereinigt unter Anwendung der für die Reinigung der Prävitaminverbindung genannten Bedingungen.

Beispiel 7 Herstellung von Äthyl-3β,24-dihydroxy-25-homo-9,10-seco-5,7,10- (19)-cholatrien-25-oat (24-Hydroxy-26,27-dinorvitamin-D₃-25- carbonsäureäthylester (Verbindung VII, R=Äthyl) aus 24,25- Dihydroxycholesterin (Methode A) a) 3β-Hydroxychol-5-en-24-al (18, Y=H)

Zu einer Methanol-(10 ml)-Lösung von 1,5 g 24,25-Dihydroxy- cholesterin (17, Y=H) (hergestellt wie von Lam et al., in Biochemistry, 12, 4851 (1973) beschrieben) wird eine gesättigte Methanollösung von Natriummetaperjodat gefügt. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt und mit Chloroform extrahiert. Die organischen Extrakte werden mit Wasser und Salzlösung gewaschen, über Kaliumcarbonat getrocknet und verdampft unter Bildung von etwa 1 g des gewünschten 24-Aldehyds (18, Y=H).

Der 24-Aldehyd wird umgewandelt in sein 3-O-Silylätherderivat in üblicher Weise: Reaktion einer THF/Pyridin-(1 : 1)-Lösung des Aldehyds mit Hexamethyldisilazan (1,5 ml) und Trimethylchlorsilan (1 ml) bei Raumtemperatur während 0,5 Stunden ergibt das 3-O-Trimethylsilylprodukt, das, gelöst in THF, kräftig mit K₂CO₃ getrocknet wird und anschließend als Lösung in THF für die nächste Stufe verwendet wird.

b) Äthyl-3β,24-dihydroxy-25-homochol-5-en-25-oat (19, Y=H, R=Et)

Zu einer Tetrahydrofuranlösung des Lithiumsalzes von 2-Methylmercapto- 1,3-dithian (hergestellt wie beschrieben von Seebach, Angew. Chem., 79, 469-470 (1967); Ellison et al., J. Org. Chem. 37, 2757 (1972) beschrieben), gehalten bei -78° unter einer Atmosphäre von Argon, wird tropfenweise eine THF-Lösung des 24-Aldehyd-3-O-silyläthers (hergestellt wie vorstehend in a) beschrieben) (ca. 0,8 Mol Aldehyd pro Mol Lithiumorthothioesterreagens) gefügt. Nach dem Zusatz des Aldehyds läßt man das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmen und arbeitet dann auf durch Zusatz von Wasser und Extrahieren des Produkts in CHCl₃. Die Chloroformlösung wird mit verdünnter KOH-Lösung und anschließend mit Wasser gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Das auf diese Weise erhaltene 24-Hydroxy-25-orthothioester- zwischenprodukt wird anschließend zu einem Gemisch von HgCl₂ (3,5 äquiv.) und HgO (2 äquiv.) in 95% Äthanol gefügt zur Bewirkung einer Äthanolyse des Orthothioesters zum 25-Carbonsäureesters (Ellison et al., vorstehend). Die Temperatur wird auf 50° angehoben, und das Gemisch wird unter Argon über Nacht gerührt. Ausgefällte Feststoffe werden abfiltriert und mit CH₂Cl₂ gewaschen, und das Filtrat wird mit Wasser verdünnt, mit CH₂Cl₂ extrahiert, mit Ammoniumchlorid, Natriumbicarbonat, gefolgt von Wasser und Salzlösung, gewaschen, die Lösung wird getrocknet (Na₂SO₄) und durch Verdampfen des Lösungsmittels erhält man das gewünschte Hydrolyseprodukt Äthyl-3β,24-dihydroxy- 25-homochol-5-en-25-oat.

c) Die Umwandlung von Äthyl-3β,24-dihydroxy-25-homochol-5-en- 25-oat in den 24-Hydroxy-26,27-dinorvitamin-D₃-25-säure­ äthylester (VIII, R=Äthyl) wird erzielt durch Unterziehen des Esters 19 (Y=H, R=Äthyl) der Stufenfolge und den Bedingungen, die in Beispiel 6d) beschrieben werden.

Beispiel 8 Herstellung von Äthyl-3β,24-dihydroxy-25-homochol-5-en-25-oat (19, Y=H, R=Äthyl) aus 24,25-Dihydroxycholesterin (Methode B) a) Herstellung von 24-Thioacetal (20, Y=H)

Zu einer Chloroformlösung des 24-Aldehyds 18 (Y=H) (1 g), hergestellt wie in Beispiel 7a) beschrieben, wird ein Überschuß von 1,3-Dithiopropan (2 ml) gefügt, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird nach etwa 30 Minuten das Gemisch in einem Eisbad gekühlt, und 1 ml BF₃-Ätherat wird zugesetzt, und man läßt die resultierende Lösung über Nacht in der Kälte stehen. Die kalte Lösung wird anschließend mit 5% wäßriger KOH-Lösung gewaschen, gefolgt vom Waschen mit H₂O und Trocknen über K₂CO₃. Durch Verdampfen des Lösungsmittels erhält man dann das gewünschte 24,24-Dithioacetalderivat 20 (Y=H). Dieses Material wird in sein 3-O-Trimethylsilyl­ ätherderivat, wie in Beispiel 7a) beschrieben, umgewandelt.

b) Äthyl-3β,24-dihydroxy-25-homochol-5-en-25-oat (21, Y=H, R=Äthyl)

Eine Lösung (0,1 m) des, wie vorstehend beschrieben, erhaltenen 3-O-silylierten Thioacetalderivats in trockenem Tetrahydrofuran, gehalten bei -25°C unter einer Argonatmosphäre, wird mit 1,5 Äquivalenten n-Butyllithium in Hexan (1,5 m Lösung) behandelt, und das Gemisch wird 3,5 Stunden gerührt unter Bildung des 24-Lithioderivats. Die Temperatur wird auf -70° gesenkt, und ein großer Überschuß an Äthylchlorformiat (ClCOOEt) wird langsam als Lösung in trockenem THF zugesetzt, und die wird 7 Stunden gerührt. Anschließend läßt man auf Raumtemperatur erwärmen, Wasser wird zugesetzt, und das Gemisch wird mit CHCl₃ extrahiert. Die CHCl₃-Extrakte werden mit verdünntem KOH und H₂O gewaschen und anschließend getrocknet und verdampft unter Bildung des 25-Carboäthoxy-24,24-thioketalderivats. Das Thioketal wird direkt hydrolysiert durch Zusatz einer Acetonitrillösung des vorstehenden Produkts (1 mMol) zu einer Lösung von überschüssigem N-Chlorsuccinimid (5 mMol) und AgNO₃ (4 mMol) in Acetonitril/H₂O (5 : 1). Nach 1 Stunde bei 50° wird gesättigte NaCl-Lösung zugesetzt, die Ausfällung wird durch Filtrieren entfernt, und das Filtrat wird nach dem Verdünnen mit CHCl₂ mit Natriumbisulfit- und Natriumbicarbonatlösungen, gefolgt von Wasser und Salzlösung, gewaschen. Nach dem Trocknen und Verdampfen des Lösungsmittels erhält man das gewünschte 24-Keto-25-äthylesterprodukt (21, Y=H, R=Et).

c) Äthyl-3β,24-dihydroxy-25-homochol-5-en-25-oat (19, Y=H, R=Et)

Eine Methanollösung (10 ml) des 24-Ketoprodukts (100 mg), wie vorstehend in b) erhalten, wird mit einem Überschuß von NaBH₄ bei Raumtemperatur während 45 Minuten behandelt. Durch Zusatz von verdünnter wäßriger Essigsäure und Extrahieren mit Methylenchlorid erhält man nach der Chromatografie an einer Siliziumdioxidgelsäule, entwickelt mit Äthylacetat/Hexan, 85 mg, des gewünschten 24-Hydroxy-25-esterprodukts (19, Y=H, R=Et).

Beispiel 9 Herstellung von 1α,24-Dihydroxy-26,27-dinorvitamin-D₃-25-carbon- säureäthylester (VIII, R=Et) (Äthyl-1α,3b,24-trihydroxy-25- homo,9,10-seco--5,7,10(19)-cholatrien-25-oat) aus 1α,24,25-Tri­ hydroxycholesterin

Eine Methanollösung von 1α,24,25-Trihydroxycholesterin wird einer Perjodatspaltung, genau wie in Beispiel 7a) unterzogen, unter Bildung des 1α-Hydroxy-24-aldehydzwischenprodukts (18, Y=OH). Dieser Aldehyd wird in seinen 1,3-Ditrimethylsilyläther umgewandelt unter Anwendung der in Beispiel 7a) angegebenen Bedingungen. Das Silylätherderivat wird anschließend mit 2-Lithio-2-methylmercapto-1,3-dithian, genau wie in Beispiel 7b) beschrieben, behandelt, und der resultierende 24-Hydroxy-25-orthothioester wird einer Äthanolyse unter Anwendung der im Beispiel 7b) beschriebenen Bedingungen unterzogen, unter Bildung von Äthyl-1α,3β,24-trihydroxy-25-homochol- 5-en-25-oat (19, R=Äthyl, Y=OH). Nach dem Acetylieren dieses Triolesters mit überschüssigem Essigsäureanhydrid in Pyridin bei 80°C während 4 Stunden, wird das resultierende 1,3,24- Triacetat den Verfahrensweisen der Beispiele 5d) und 5e) unterzogen unter Bildung des gewünschten Produkts 1α,24-Dihydroxy- 26,27-dinorvitamin-D₃-25-carbonsäureäthylester (VIII, R=Äthyl), wobei der einzige Unterschied darin besteht, daß das Endprodukt durch HPLC-Chromatographie (0,6 × 25 cm Siliziumdioxidgelsäule) mit 10% 2-Propanol in Hexan als Eluiermittel, gereinigt wird.

Beispiel 10 Herstellung von 1α,24-Dihydroxy-26,27-dinorvitamin-D₃-25- carbonsäureäthylester (VIII, R=Äthyl) über Cyclovitaminzwischenprodukte

24-Hydroxy-26,27-dinorvitamin-D₃-25-carbonsäureäthylester (VII, R=Äthyl), wie nach einer der Synthesen der Beispiele 7 oder 8 erhalten, wird am C-3 tosyliert und anschließend in MeOH/NaOAc genau wie in Beispiel 4a) beschrieben solvolysiert unter Bildung von (etwa 40%) 24-Hydroxy-6-methoxy-3,5-cyclo- 26,27-dinorvitamin-D₃-24-carbonsäureäthylester (Verbindung 4, R=Et, X=OH, Z=Me). Die Oxidation dieses Materials mit SeO₂ in Anwesenheit von t-Butylhydroperoxid, wie detailiert im Beispiel 4b) angegeben, ergibt das entsprechende 1α-Hydroxyderivat (R=Et, X=OH, Z=Me) in etwa 50% Ausbeute. Durch Acetylieren dieses Produkts, wie in Beispiel 4c), erhält man das 1,24-Diacetatzwischenprodukt, das in Ameisensäure solvolysiert wird, genau wie in Beispiel 4e) beschrieben, unter Bildung eines Gemischs der 5,6-cis- und 5,6-trans- 3-O-Formylvitamin-D-Ester. Die Formylgruppen werden direkt durch kurze basische Hydrolyse, genau wie in Beispiel 4e), entfernt, und man erhält ein Gemisch von 1α,24-Diacetoxy-26,27- dinorvitamin-D₃-25-carbonsäureäthylester und dem entsprechenden 5,6-trans-Isomeren. Die 5,6-cis- und -trans-Isomeren werden an Siliziumdioxidgelplatten (Äthylacetat/Hexan) und HPLC (Siliziumdioxidgelsäule, 0,6 × 25 cm; 3,5% 2-Propanol/Hexan) getrennt, das 5,6-cis-Isomere (Verbindung 7, R=Et, R¹=X¹=Acetyl) wird in verdünntem Alkali, genau wie in Beispiel 4f) beschrieben, hydrolysiert unter Bildung des gewünschten Produkts 1α,24-Dihydroxy-26,27-dinorvitamin-D₃-25-carbonsäureäthylester (VIII, R=Äthyl) in reiner Form (geringere Verunreinigungen, falls vorhanden, werden durch HPLC-Chromatografie an Siliziumdioxidgel (0,6 × 25 cm Säule) unter Verwendung von 10% 2-Propanol/Hexan als Lösungsmittel, entfernt). Die Hydrolyse der 5,6-trans-1α-Acetoxyverbindung unter identischen Bedingungen ergibt 1α,24-Dihydroxy-5,6-trans-26,27-dinorvitamin- D₃-25-carbonsäuremethylester.

Claims (2)

1. Tritium-markierte Vitamin-D-Derivate mit einer spezifischen Aktivität von über 120 Ci/mMol gemäß der nachstehenden Formel worin R₁ und R₂ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeuten.

2. Vitamin-D-Derivate nach Anspruch 1 mit einer spezifischen Aktivität von 160 Ci/mMol.