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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung einer la-hydroxylierten Vitamin-D-Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass man eine 5,6-trans-Vitamin-D-Verbindung, die der la-hydroxylierten Vitamin-D-Verbindung, die hergestellt werden soll, entspricht, allylisch oxidiert, die Oxidationsprodukte mit aktinischer Strahlung in Anwesenheit eines photosensibilisierenden Mittels bestrahlt und die la-hydroxylierte Vitamin-D-Verbindung gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die allylische Oxidation mit Selendioxid durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die allylische Oxidation in Anwesenheit eines Wasserstoffperoxids oder Alkylhydroperoxids durchführt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die allylische Oxidation in Anwesenheit einer stickstoffhaltigen Base, vorzugsweise Pyridin, einem alkylsubstituierten Pyridin, Chinolin, Imidazol oder einem alkylsubstituierten Pyrazol durchführt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als 5,6-trans-Vitamin-D-Verbindung eine Verbindung der Formel
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worin X Wasserstoff, Hydroxy oder geschütztes Hydroxy ist, und R eine Steroid-Seitenkette der Formel
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darstellt, worin jeder der Reste R1 und R2 unabhängig Wasserstoff, Hydroxy, geschütztes Hydroxy oder Fluor darstellt, oder R1 und R2 zusammen eine Doppelbindung oder eine Epoxygruppe bilden, jeder der Reste R3, R4 und R5 unabhängig Wasserstoff, Hydroxy, geschütztes Hydroxy, niedrig Alkyl oder Fluor ist, und R6 Wasserstoff oder niedrig-Alkyl ist, vorzugsweise 5,6-trans-Vitamin-D3, 5,6-trans-25-Hydroxy-Vitamin-D3, 5,6-trans-Vitamin-D2,
5,6-trans-25-Hydroxy Vitamin-D2, 5,6-trans-24,25-Dihydroxy-Vitamin-D3 oder 5,6-trans-24-Hydroxy-Vitamin-D3 allylisch oxidiert.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als photosensibilisierendes Mittel Anthrazen, Phenazin oder Acridin verwendet.
Die Erfindung betrifft die Herstellung von la-hydroxylierten Vitamin-D-Verbindungen.
Die D-Vitamine (d.h. Vitamin D3 oder Vitamin D2) sind bekannte Mittel zur Steuerung der Calcium- und Phosphor homöostase. Es ist bekannt, dass beim normalen Tier diese
Verbindungen die intestinale Calciumabsorbtion und die
Knochen-Calcium-Mobilisierung stimulieren und wirksam bei der Verbindung von Rachitis sind. Es ist auch bekannt, dass Vitamin D3 (oder Vitamin D2), um wirksam zu sein, in vivo in seine Hydroxyformen umgewandelt werden muss.
Beispielsweise wird Vitamin D3 zuerst zum 25-Hydro xy-Vitamin D3 in der Leber hydroxyliert, und dieses Zwischenprodukt wird anschliessend weiter in der Niere zu la,25 Dihydroxy-Vitamin D3 hydroxyliert. Vitamin D2 geht die gleichen metabolischen Umwandlungen ein. Die la-hydroxylierte Form des Vitamins wird im allgemeinen als die physio logisch aktive oder hormonelle Form des Vitamins und als verantwortlich für die verschiedenen vorstehend erwähnten physiologischen Reaktionen angesehen. Es wurde auch ge zeigt, dass bestimmte unnatürliche synthetische la-Hydroxy
Vitamin-D-Analoge eine hohe biologische Wirksamkeit auf weisen, diesich in einigen Fällen der der in vivo erzeugten na türlichen Formen nähert. Bekannte Beispiele sind la-Hydro xy-vitamin Dz, 1 a-Hydroxy-vitamin D2 und 3-Desoxy-la hydroxy-vitamin D3.
Wegen der hohen biologischen Wirksamkeit derartiger l-hydroxylierter Vitamin-D-Verbindungen und ihrer potentiellen Brauchbarkeit zur Behandlung zahlreicher Erkrankun gen, die mit der Störung des Calciummetabolismus einherge hen, wurde chemischen Verfahrens zu deren Herstellung ein grosses Interesse entgegengebracht. Fast alle beschriebenen
Synthesen beziehen die la-Hydroxylierung geeigneter Steroide (wie Cholesterin) ein, die anschliessend in die gewünschten la-Hydroxy-Vitamin-D-Verbindungen umgewandelt werden (vgl. Schnoes und DeLuca, in Bioorganic Chemistry, Band 2, Kapitel 12, Seiten 299-335, herausgegeben von E.E. van Tamalen, Academic Press, Inc., New York, 1978).
Ein interessantes alternatives Verfahren wurde kürzlich beschrieben, das die direkte C1-Hydroxylierung von vorgebildeten D-Vitaminen betrifft (vgl. Pelc, Steroids 30, 193 (1977) und Paaren et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75,2080(1978).
Jedoch sind bei diesem direkten Oxidationsverfahren die Ausbeuten an den gewünschten la-Hydroxy-D-Vitaminen gering, und der Hauptanteil der erhaltenen Materialien besteht aus unerwünschten Produkten, die sorgfältig entfernt und gründlich chromatographiert werden müssen.
Es wurde nunmehr ein Verfahren gemäss der Erfindung bereitgestellt, das die wirksame Herstellung von la-hydroxylierten Vitamin-D-Verbindungen (d.h. mit der 5,6-cis-Doppelbindung-Geometrie) aus 5,6-trans-Vitamin-D-Verbindungen ermöglicht. Dieses Verfahren umfasst zwei Stufen, nämlich die allylische Oxidation eines 5,6-trans-Vitamin-D-Ausgangsmaterials, wobei SeO2 das bevorzugte Oxidationsmittel ist, gefolgt von der Bestrahlung des resultierenden l-hydroxy lierten Produkts in Anwesenheit eines Photosensibilisators.
Die Umwandlung der gewünschten la-Hydroxy-Vitamin-D
Verbindungen kann in etwa 230% Ausbeute nach diesem
Verfahren aus den 5,6-trans-Vitamin-D-Ausgangsmaterialien erzielt werden.
Geeignete Ausgangsmaterialien für dieses Verfahren sind 5,6-trans-Vitamin-D-Verbindungen mit der nachstehenden allgemeinen Struktur
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worin X Wasserstoff, Hydroxy oder geschütztes Hydroxy (beispielsweise die O-Acylgruppe) ist. R in der obigen Struktur kann Wasserstoff oder niedrig-Alkyl sein, und es kann jegliche der üblichen gesättigten oder ungesättigten Steroidseitenketten sein. Diese Seitenketten können auch funktionelle Gruppen tragen, wie Hydroxy-, Keton-, Säure- oder Estergruppen, wie beispielsweise in der Seitenkette von Cholensäure oder ihren Estern, Homocholensäure oder ihren Estern oder 25-Keto- oder 24-Ketocholesterin.
In der bevorzugten Ausführungsform stellt R in der vorstehenden Struktur eine Steroidseitenkette mit der Struktur
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dar, worin jeder der Reste R1 und R2 unabhängig Wasserstoff, Hydroxy, geschütztes Hydroxy oder Fluor ist, oder R1 und R2 zusammen eine Doppelbindung oder eine Epoxidgruppe bilden, jeder der Reste R3, R4 und R5 unabhängig Wasserstoff, Hydroxygeschütztes Hydroxy, niedrig-Alkyl oder Fluor darstellt, und R6 Wasserstoff oder niedrig-Alkyl ist. Hydroxyfunktionen, die gegebenenfalls in dem Ausgangsmaterial vorhanden sind (z.B. an C-3 und/oder in der Seitenkette), können ebenfalls acyliert sein (z.B. vorhanden als Acetate, Propionate, Butyrate, Benzoate, Nitro- oder Halogenbenzoate), alkyliert (z.B.
O-Methyl-, O-Äthyl oder O-Isopropyl), oder können auf andere Weise daran gehindert werden, mit den Reagentien, im Verlaufe des Verfahrens zu reagieren d.h. geschützt, wie dem Fachmann bekannt, durch übliche Hydroxy-Schutzgruppen. Jedoch ist ein derartiger Schutz für das erfindungsgemässe Verfahren nicht wesentlich.
Der hier verwendete Ausdruck niedrig-Alkyl bezeichnet einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, mit geradkettiger oder verzweigtkettiger Konfiguration, z.B.
Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl oder Butyl, und das Wort Acyl bezeichnet eine aliphatische Acylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffen, z.B. Acetyl, Propionyl oder Butyryl, oder eine aromatische Acylgruppe, wie Benzoyl, Nitrobenzoyl oder Chlorbenzoyl.
Ein bevorzugtes Reagens zur allylischen Oxidation dieser 5,6-trans-Vitamin-D-Ausgangsmaterialien ist eine Selenverbindung, insbesondere Selendioxid. Die Anwesenheit eines Hydroperoxids (z.B. Wasserstoffperoxid, oder eines Alkylhydroperoxids, wie t-Butylhydroperoxid) und einer organischen stickstoffhaltigen Base während der Oxidation ist günstig. Geeignete Basen umfassen Pyridin oder substituierte Pyridine (z.B. die isomeren Picoline, Collidin, Octahydroacridin oder Chinolin) oder Imidazol oder ein substituiertes Pyrazol (z.B. 3,5-Dimethyl-pyrazol). Eine vorteilhafte Kombination von Reagentien sind insbesondere Selendioxid, t-Butylhydroperoxid und Octahydroacridin.
Die Reaktion wird vorzugsweise in einem Lösungsmittel, z.B. einem Halogen-kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Dichloräthan oder 1,3-Dichlorpropan, bei Raumtemperatur durchgeführt. Bei Raumtemperatur erfolgt die Reaktion rasch und ist normalerweise innerhalb von 10 bis 20 Minuten beendet, obwohl im allgemeinen ein Temperaturbereich von etwa - 15 bis 30 C verwendet werden kann.
Das resultierende Produkt, das gegebenenfalls durch Chromatographie gereinigt werden kann, wird anschliessend einer photochemischen Umwandlung unterzogen.
Die photochemische Umwandlungsstufe kann wirksam durchgeführt werden, wenn man eine Lösung des Oxidationsprodukts aktinischer Strahlung in Anwesenheit eines Photosensibilisators aussetzt. Eine Lichtquelle, die eine für die Anregung des Photosensibilisators geeignete Strahlung emittiert, ist wirksam, vorausgesetzt, dass Licht mit einer Wellenlänge von weniger als etwa 310 nm ausgeschlossen wird, entweder durch geeignete Filter oder durch Wahl einer Lichtquelle, die keine Strahlung unter dieser Wellenlänge aussendet.
In der Praxis ist es zweckmässig, handelsübliche Standard-Fluoreszenzlampen zur Bestrahlung zu verwenden, wie die handels üblichen Kalt-Weiss-Modelle FC12T10/CW, FC8T9/CW, F6T5/CW oder F15T8D (jeweils Handelsprodukte der Westinghouse Electric Corporation), mit geeigneten Filtern zur wirksamen Eliminierung der niedrigen Ultraviolettstrahlungskomponente. Ein geeignetes Filter ist Pyrexglas, und die Bestrahlung der Lösung, die in einem Reaktionsgefäss enthalten ist, das aus Standard-Pyrexglas hergestellt wurde, ist daher praktizierbar, und eine vorteilhafte Verfahrensweise zur Durchführung dieser Reaktion. Geeignete Lösungsmittel für das Oxidationsprodukt sind beispielsweise Benzol und Toluol, und wirksame photochemische Sensibilisatoren sind beispielsweise Anthrazen, Acridin und Phenazin.
Es ist günstig, die Lösung unter einer inerten Atmosphäre zu halten (z.B. Stickstoff oder Argon). Die Bestrahlung führt man vorzugsweise bei einer Temperatur unter 10 C durch, wobei der Reaktionsprozess (d.h. die Bildung der l-Hydroxy- Vitamin-D-Verbindungen) periodisch durch geeignete chromatographische Methoden, z.B. durch Dünnschichtchromatographie, überwacht wird. Normalerweise benötigt man etwa 5 bis 10 h zur Beendigung der Reaktion.
Beispielsweise kann die photo chemische Umwandlung wirksam erzielt werden durch Bestrahlen einer Toluollösung des Oxidationsprodukt-Reaktionsgemischs, die Anthrazen als einen Photosensibilisator aufweist (in etwa 40fach molarem Überschuss über die Vitaminverbindung) unter einer Stickstoffatmosphäre in einem kaltem Raum bei 4 C mit zwei handelsüblichen zirkularen, fluoreszierenden Lampen (etwa insgesamt 50 Watt), die in geeigneter Weise um ein Standard-Rundkolben-Reaktions gefäss angeordnet sind, während 8 bis 10 h. Ein hohes Verhältnis von Sensibilisator zur Vitaminverbindung (z.B. 30- bis 50fach molarer Überschuss) und niedrige Temperaturen erleichtern die Reaktion.
Verwendet man Benzol als ein Lösungsmittel, so wird eine Temperatur von über 5 C empfohlen, um ein Frieren des Lösungsmittels zu vermeiden. Toluol das unter 5 C verwendet werden kann, ist als Lösungsmittel bevorzugt.
Das durch die Bestrahlung gewünschte Produkt kann leicht durch Verdampfen des Lösungsmittels und Durchführung einer Chromatographie isoliert werden. Es ist häufig vorteilhaft die Masse des Photosensibilisators vor der Chromatographie zu entfernen, z.B. durch erneutes Auflösen des Produkts in einem Lösungsmittel, in dem der Photosensibili sator schlecht löslich ist (z.B. ein Alkohol, wie Äthanol oder Methanol, im Falle von Anthrazen) und Entfernen des Photosensibilisators durch Filtrieren. Das resultierende Filtrat enthält ein Gemisch von la-hydroxylierten Vitamin-D-Verbindungen und einigem 1 ss-Hydroxyvitamin-D-Epimer.
Diese Verbindung können zweckmässig durch Chromatographie getrennt werden (z.B. Säulenchromatographie, Dünnschichtchromatographie oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie), die auch jeglichen verbleibenden Sensibilisator entfernt, unter Erzielung der 1 a-hydroxylierten Vitamin-D Verbindung der nachstehenden allgemeinen Formel, worin R und X Substituenten, wie vorstehend definiert, darstellen, in reiner Form:
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Jegliche Hydroxy-Schutzgruppen (z.B. Acylgruppen), die vorhanden sein können, können gegebenenfalls in einer abschliessenden Hydrolyse- oder Reduktionsstufe entfernt werden, unter Anwendung von Standard-Bedingungen und üblichen Bedingungen, z.B. Hydrolyse mit 0,1 m KOH/MeOH bei 25 bis 60 während 1 bis 4 h, oder Reduktion mit Lithiumaluminium-hydrid bei Raumtemperatur während 0,5 bis 1 h.
Alternativ kann die Entfernung derartiger Hydroxyschutzgruppen auch erzielt werden in einer Zwischenstufe, z.B. vor der photochemischen Reaktionsstufe.
Das Produktgemisch, das durch die von Pelc und Paaren et al. loc. cit. beschriebenen Methoden erhalten wird, umfasst beispielsweise la- und 1 ss-Hydroxy-5,6-cis- und 5,6-trans-Vitamin-D, sowie eine Anzahl anderer Oxidationsprodukte, die fast die Gesamtmenge des gebildeten Produkts einnehmen.
Ein besonders vorteilhaftes Merkmal des erfindungsgemässen Zweistufenverfahrens, d.h. Oxidation gefolgt von photochemischer Umwandlung, liegt darin, dass im wesentlichen nur l-hydroxylierte Vitamin-D-Verbindungen erhalten werden und dass die gewünschte la-Hydroxy-Vitamin-D Verbindung das Hauptprodukt darstellt. Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht somit eine wirksame und einfache Umwandlung von 5,6-trans-Vitamin-D-Verbindungen in 1 a-hydroxylierte Vitamin-D-Verbindungen (5,6-cis-Doppelbindungs-Konfiguration). Ein weiterer vorteilhafter Aspekt des Verfahrens liegt in seiner allgemeinen Durchführbarkeit; es ist anwendbar auf 5,6-trans-Vitamin-D-Ausgangsmaterialien, die jegliche der üblichen Steroidseitenketten enthalten.
Beispielsweise führt die allylische Oxidation und anschliessende Bestrahlung von 5,6-trans-Vitamin-D3 und 5, 6-trans- Vitamin-D2 zu den entsprechenden la-Hydroxy-Vitamin-D3bzw. la-Hydroxy-Vitamin-D2 -Verbindungen. Das gleiche Verfahren, angewendet auf 5,6-trans-25-Hydroxyvitamin-D3 oder 5,6-trans-25-Hydroxyvitamin-D2 ergibt la,25-Dihydroxyvitamin D3 bzw. la,25-Dihydroxyvitamin-D2, und die Oxidation und anschliessende Bestrahlung von 5,6-Trans-24,25 Dihydroxyvitamin D3 oder 5,6-trans-25,26-Dihydroxyvitamin D3 ergibt la,24,25-Trihydroxyvitamin D3 bzw.
la,25,26-Trihydroxyvitamin D3 in guter Ausbeute.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
Beispiels Synthese von la-Hydroxyvitamin D3 aus 5,6-trans- Vitamin D3
In einen 10 ml-Rundkolben werden 152 mg (1,37 mMol) Selendioxid gefolgt von 5 ml Methylenchlorid gefügt. Eine Beschickung von 750 mg (4,01 mMol) Octahydroacridin wird zu der vorstehenden Suspension, gefolgt von 300 1ll trockenem t-Butylhydroperoxid, gefügt. Die resultierende Lösung wird bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt, und anschliessend werden 100 mg (0,26 mMol) festes 5,64rans- Vitamin-D3 zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre während 16 Minuten gerührt und anschliessend aufgearbeitet durch Giessen in ein Gemisch von 70 ml Äther und 15 ml 10% wässrigem Natriumhydroxid.
Nach der Phasentrennung wird die ätherische Schicht mit 10% Natriumhydroxid (5 ml, 1 x), Wasser (5 ml, 2 x), 1% wässriger Essigsäure (5 ml, 2 x ), Wasser (5 ml, 3 x 10% wässrigem Natriumhydroxid (5 ml, 1 x ) und Wasser (5 ml, 3 x ) gewaschen. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels gewinnt man 108,1 mg Rohprodukt.
Das Rohprodukt wird an einer 1 x 50 cm Siliciumdioxidgel (Silicar CC-7) säule mit Äther als Eluierlösungsmittel chromatographiert. Die Säulenfraktionen werden durch Dünnschichtchromatographie bewertet, und solche Fraktionen, die ein Material gleicher Polarität mit l-hydroxylierten Vitamin D3-Verbindungen aufweisen, werden gepoolt, unter Bildung einer Rohfraktion, die 54,5 mg wiegt nach Verdampfen des Lösungsmittels. Ein Hauptanteil (47,0 mg, 86%) dieser Rohfraktion wird in ein doppelwandiges wassergekühltes Quarzemissionsgefäss überführt. Der Quarzbestrahlungsvorrich tungwerden 610 mg (3,42 mMol) Anthrazen und 150 ml Benzol zugesetzt.
Nach dem Entgasen beginnt man mit dem Bestrahlen (unter Stickstoffatmosphäre bei 5 C) unter Verwendung einer 15 Watt, kaltweissen, rohrförmigen, fluoreszierenden Lichtbirne. Nach 13 h bei 6 bis 7 C wird das Licht abgeschaltet und das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wird in Äthanol suspendiert und filtriert. Das Filtrat wird verdampft, und der rohe Rückstand des Filtrats wird auf eine 1 x 50 cm Siliciumdioxidgelsäule (Silicar CC-7) aufgebracht.
Eluieren der Säule mit 1% Methanol in Chloroform, gefolgt vom Poolen und Verdampfen solcher Fraktionen, die Material enthalten, das chromatographisch gleich mit einer bekannten Probe von la-Hydroxyvitamin D3 ist, führt zu 24,0 mg (27% Ausbeute) eines farblosen Öls, von dem es sich durch Vergleich der NMR-, UV- und Massenspektren der Probe mit denen einer authentischen Probe zeigt, dass es identisch mit lu-Hydroxyvitamin D3 ist. Die Probe ist cochromatographisch mit einer bekannten Probe von la-Hydroxyvitamin D3 (hergestellt aus la-Hydroxycholesterin) bei Siliciumdioxidgel-Dünnschichtchromatographie (2,5% Methanol in Chloroform oder alternativ Äther als Eluierlösungsmittel).
Beispiel 2 Syndiese von la-HSdroxyvitamin D2 aus 5,6-trans- VÜamz D2
Eine Lösung von 100 mg 5,6-trans-Vitamin D2 in Methylen-chlorid wird allylisch oxidiert, genau wie im Beispiel 1 beschrieben. Das resultierende l-hydroxylierte Produktgemisch wird wie im vorstehenden Beispiel beschrieben, gewonnen und direkt unter folgenden Bedingungen bestrahlt.
Zu einer Toluollösung (150 ml) des Produkts, die in einem 250 ml-Standard-Rundkolben enthalten ist, wird ein 20facher Uberschuss von Anthrazen als Photosensibilisator gefügt.
Die Lösung wird entgast und unter einer Stickstoffatmosphäre gehalten. Sie wird anschliessend mit zwei üblichen zir klaren, fluoreszierenden Lampen (Westinghouse-Modelle FC12T10/CW (32 Watt) und FC8T9/CW (22 Watt), die um den Kolben plaziert sind, während 9 h bestrahlt; die Lösung wird während der Bestrahlung bei 4 "C gehalten. Das Produkt wird isoliert durch Zusatz von Isopropanol und azeotrope Verdampfung des Lösungsmittels, Zusatz von Äthanol zu dem Rückstand und Filtrieren des Anthrazens. Durch Chromatographie des nach dem Verdampfen des Äthanollösungsmittels verbleibenden Rückstands an einer Siliciumdioxidgelsäule (1 x 50 cm), eluiert mit 1% Methanol in CHCl3, erhält man das gewünschte la-Hydroxyvitamin D2 in 25% Gesamtausbeute.
Das Produkt ist identisch mit dem einer authentischen Probe in seinen chromatographischen und spektroskopischen Eigenschaften.
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PATENT CLAIMS
1. A process for the preparation of a la-hydroxylated vitamin D compound, characterized in that a 5,6-trans-vitamin D compound which corresponds to the la-hydroxylated vitamin D compound which is to be produced , oxidized allylic, the oxidation products are irradiated with actinic radiation in the presence of a photosensitizing agent and the la-hydroxylated vitamin D compound is obtained.
2. The method according to claim 1, characterized in that one carries out the allylic oxidation with selenium dioxide.
3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that one carries out the allylic oxidation in the presence of a hydrogen peroxide or alkyl hydroperoxide.
4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that one carries out the allylic oxidation in the presence of a nitrogen-containing base, preferably pyridine, an alkyl-substituted pyridine, quinoline, imidazole or an alkyl-substituted pyrazole.
5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that a 5,6-trans vitamin D compound is a compound of the formula
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wherein X is hydrogen, hydroxy or protected hydroxy, and R is a steroid side chain of the formula
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wherein each of R1 and R2 independently represents hydrogen, hydroxy, protected hydroxy or fluorine, or R1 and R2 together form a double bond or an epoxy group, each of R3, R4 and R5 independently represent hydrogen, hydroxy, protected hydroxy, lower alkyl or is fluorine and R6 is hydrogen or lower alkyl, preferably 5,6-trans-vitamin-D3, 5,6-trans-25-hydroxy-vitamin-D3, 5,6-trans-vitamin-D2,
5,6-trans-25-hydroxy vitamin D2, 5,6-trans-24,25-dihydroxy vitamin D3 or 5,6-trans-24-hydroxy vitamin D3 allylic oxidized.
6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that anthracene, phenazine or acridine is used as the photosensitizing agent.
The invention relates to the production of la-hydroxylated vitamin D compounds.
The D vitamins (i.e. vitamin D3 or vitamin D2) are known agents for controlling calcium and phosphorus homeostasis. It is known that in normal animals this
Compounds intestinal calcium absorption and
Bone calcium mobilization stimulate and are effective in connecting rickets. It is also known that vitamin D3 (or vitamin D2) must be converted to its hydroxy forms in vivo to be effective.
For example, vitamin D3 is first hydroxylated to 25-hydroxy xy-vitamin D3 in the liver, and this intermediate is then further hydroxylated in the kidney to la, 25 dihydroxy-vitamin D3. Vitamin D2 goes through the same metabolic transformations. The la-hydroxylated form of the vitamin is generally considered to be the physiologically active or hormonal form of the vitamin and responsible for the various physiological reactions mentioned above. It has also been shown that certain unnatural synthetic la-hydroxy
Vitamin D analogs have high biological efficacy, which in some cases approximates the natural forms generated in vivo. Well-known examples are la-Hydro xy-vitamin Dz, 1 a-hydroxy-vitamin D2 and 3-deoxy-la hydroxy-vitamin D3.
Because of the high biological effectiveness of such l-hydroxylated vitamin D compounds and their potential usefulness for the treatment of numerous diseases which are associated with the disturbance of calcium metabolism, chemical processes for their production have been of great interest. Almost all of them described
Syntheses involve the la-hydroxylation of suitable steroids (such as cholesterol), which are subsequently converted into the desired la-hydroxy-vitamin D compounds (cf. Schnoes and DeLuca, in Bioorganic Chemistry, Volume 2, Chapter 12, pages 299- 335, edited by EE van Tamalen, Academic Press, Inc., New York, 1978).
An interesting alternative method has recently been described that relates to the direct C1 hydroxylation of preformed D vitamins (see Pelc, Steroids 30, 193 (1977) and Paaren et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75,2080 (1978).
However, with this direct oxidation process, the yields of the desired la-hydroxy-D vitamins are low, and the majority of the materials obtained consist of undesirable products that must be carefully removed and thoroughly chromatographed.
A method according to the invention has now been provided which enables the effective production of la-hydroxylated vitamin D compounds (ie with the 5,6-cis double bond geometry) from 5,6-trans-vitamin D compounds . This process involves two stages, namely the allylic oxidation of a 5,6-trans-vitamin D starting material, with SeO2 being the preferred oxidant, followed by irradiation of the resulting l-hydroxylated product in the presence of a photosensitizer.
The conversion of the desired la-hydroxy-vitamin-D
Compounds can yield about 230% after this
Process can be achieved from the 5,6-trans-vitamin D starting materials.
Suitable starting materials for this process are 5,6-trans-vitamin D compounds with the general structure below
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where X is hydrogen, hydroxy or protected hydroxy (e.g. the O-acyl group). R in the above structure can be hydrogen or lower alkyl, and can be any of the usual saturated or unsaturated steroid side chains. These side chains can also carry functional groups, such as hydroxyl, ketone, acid or ester groups, for example in the side chain of cholenic acid or its esters, homocholenic acid or its esters or 25-keto or 24-ketocholesterol.
In the preferred embodiment, R in the above structure represents a steroid side chain with the structure
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wherein each of R1 and R2 is independently hydrogen, hydroxy, protected hydroxy or fluorine, or R1 and R2 together form a double bond or an epoxy group, each of R3, R4 and R5 are independently hydrogen, hydroxy-protected hydroxy, lower alkyl or Represents fluorine and R6 is hydrogen or lower alkyl. Hydroxy functions that may be present in the starting material (e.g. at C-3 and / or in the side chain) can also be acylated (e.g. present as acetates, propionates, butyrates, benzoates, nitro or halobenzoates), alkylated (e.g.
O-methyl, O-ethyl or O-isopropyl), or can otherwise be prevented from reacting with the reagents during the process i.e. protected, as known to the person skilled in the art, by customary hydroxyl protective groups. However, such protection is not essential for the method according to the invention.
The term low alkyl as used herein refers to a hydrocarbon radical having 1 to 5 carbon atoms, with a straight-chain or branched-chain configuration, e.g.
Methyl, ethyl, propyl, isopropyl or butyl, and the word acyl denotes an aliphatic acyl group with 1 to 5 carbons, e.g. Acetyl, propionyl or butyryl, or an aromatic acyl group such as benzoyl, nitrobenzoyl or chlorobenzoyl.
A preferred reagent for allylic oxidation of these 5,6-trans-vitamin D starting materials is a selenium compound, especially selenium dioxide. The presence of a hydroperoxide (e.g. hydrogen peroxide, or an alkyl hydroperoxide such as t-butyl hydroperoxide) and an organic nitrogenous base during the oxidation is beneficial. Suitable bases include pyridine or substituted pyridines (e.g. the isomeric picolines, collidine, octahydroacridine or quinoline) or imidazole or a substituted pyrazole (e.g. 3,5-dimethyl-pyrazole). An advantageous combination of reagents are in particular selenium dioxide, t-butyl hydroperoxide and octahydroacridine.
The reaction is preferably carried out in a solvent, e.g. a halogenated hydrocarbon solvent such as methylene chloride, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane or 1,3-dichloropropane, at room temperature. The reaction is rapid at room temperature and is usually completed within 10 to 20 minutes, although a temperature range of about -15 to 30 ° C can generally be used.
The resulting product, which can optionally be purified by chromatography, is then subjected to a photochemical conversion.
The photochemical conversion step can be carried out effectively by exposing a solution of the oxidation product to actinic radiation in the presence of a photosensitizer. A light source that emits radiation suitable for excitation of the photosensitizer is effective, provided that light with a wavelength of less than about 310 nm is excluded, either by suitable filters or by choosing a light source that does not emit radiation below this wavelength .
In practice, it is advisable to use commercially available standard fluorescent lamps for radiation, such as the commercially available cold white models FC12T10 / CW, FC8T9 / CW, F6T5 / CW or F15T8D (in each case commercial products from Westinghouse Electric Corporation), with suitable filters for the effective elimination of the low ultraviolet radiation component. A suitable filter is pyrex glass, and the irradiation of the solution contained in a reaction vessel made from standard pyrex glass is therefore practicable and an advantageous procedure for carrying out this reaction. Suitable solvents for the oxidation product are, for example, benzene and toluene, and effective photochemical sensitizers are, for example, anthracene, acridine and phenazine.
It is convenient to keep the solution under an inert atmosphere (e.g. nitrogen or argon). The irradiation is preferably carried out at a temperature below 10 C, the reaction process (i.e. the formation of the l-hydroxy-vitamin D compounds) being carried out periodically by suitable chromatographic methods, e.g. is monitored by thin layer chromatography. It usually takes about 5 to 10 hours to complete the reaction.
For example, the photo chemical conversion can be effectively accomplished by irradiating a toluene solution of the oxidation product reaction mixture that has anthracene as a photosensitizer (in about 40-fold molar excess over the vitamin compound) under a nitrogen atmosphere in a cold room at 4 C with two commercially available circular fluorescent ones Lamps (approximately 50 watts in total) which are suitably arranged around a standard round-flask reaction vessel for 8 to 10 hours. A high ratio of sensitizer to vitamin compound (e.g. 30- to 50-fold molar excess) and low temperatures facilitate the reaction.
If benzene is used as a solvent, a temperature above 5 C is recommended to avoid freezing of the solvent. Toluene that can be used below 5 C is preferred as the solvent.
The product desired by the irradiation can easily be isolated by evaporating the solvent and performing chromatography. It is often advantageous to remove the bulk of the photosensitizer before chromatography, e.g. by redissolving the product in a solvent in which the photosensitizer is poorly soluble (e.g. an alcohol such as ethanol or methanol in the case of anthracene) and removing the photosensitizer by filtration. The resulting filtrate contains a mixture of la-hydroxylated vitamin D compounds and some 1 ss-hydroxyvitamin D epimer.
This compound can conveniently be separated by chromatography (e.g. column chromatography, thin layer chromatography or high pressure liquid chromatography) which also removes any remaining sensitizer to give the 1 a-hydroxylated vitamin D compound of the general formula below, wherein R and X are substituents as defined above. represent in pure form:
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Any hydroxy protecting groups (e.g. acyl groups) that may be present can optionally be removed in a final hydrolysis or reduction step using standard and usual conditions, e.g. Hydrolysis with 0.1 M KOH / MeOH at 25 to 60 for 1 to 4 h, or reduction with lithium aluminum hydride at room temperature for 0.5 to 1 h.
Alternatively, the removal of such hydroxy protecting groups can also be achieved in an intermediate stage, e.g. before the photochemical reaction stage.
The product mixture, which was developed by Pelc and Paaren et al. loc. cit. described methods is obtained includes, for example, la- and 1 ss-hydroxy-5,6-cis and 5,6-trans-vitamin D, as well as a number of other oxidation products, which take up almost the total amount of the product formed.
A particularly advantageous feature of the two-step process according to the invention, i.e. Oxidation followed by photochemical conversion is that essentially only 1-hydroxylated vitamin D compounds are obtained and that the desired la-hydroxy vitamin D compound is the main product. The process according to the invention thus enables an effective and simple conversion of 5,6-trans-vitamin D compounds into 1 a-hydroxylated vitamin D compounds (5,6-cis double bond configuration). Another advantageous aspect of the method lies in its general feasibility; it is applicable to 5,6-trans-vitamin D starting materials containing any of the usual steroid side chains.
For example, the allylic oxidation and subsequent irradiation of 5,6-trans-vitamin D3 and 5, 6-trans-vitamin D2 leads to the corresponding la-hydroxy-vitamin D3 or. la-hydroxy-vitamin D2 compounds. The same procedure applied to 5,6-trans-25-hydroxyvitamin-D3 or 5,6-trans-25-hydroxyvitamin-D2 gives la, 25-dihydroxyvitamin D3 or la, 25-dihydroxyvitamin-D2, and the oxidation and subsequent irradiation of 5,6-trans-24,25 dihydroxyvitamin D3 or 5,6-trans-25,26-dihydroxyvitamin D3 gives la, 24,25-trihydroxyvitamin D3 or
la, 25,26-trihydroxyvitamin D3 in good yield.
The following examples serve to illustrate the invention.
Example synthesis of la-hydroxyvitamin D3 from 5,6-trans-vitamin D3
152 mg (1.37 mmol) of selenium dioxide are added to a 10 ml round-bottomed flask, followed by 5 ml of methylene chloride. A feed of 750 mg (4.01 mmol) of octahydroacridine is added to the above suspension followed by 300 µl of dry t-butyl hydroperoxide. The resulting solution is stirred at room temperature for 30 minutes, and then 100 mg (0.26 mmol) of solid 5.64 rans vitamin D3 are added. The reaction mixture is stirred at room temperature under a nitrogen atmosphere for 16 minutes and then worked up by pouring into a mixture of 70 ml of ether and 15 ml of 10% aqueous sodium hydroxide.
After phase separation, the ethereal layer is washed with 10% sodium hydroxide (5 ml, 1 x), water (5 ml, 2 x), 1% aqueous acetic acid (5 ml, 2 x), water (5 ml, 3 x 10% aqueous) Sodium hydroxide (5 ml, 1 x) and water (5 ml, 3 x), and after evaporation of the solvent, 108.1 mg of crude product are obtained.
The crude product is chromatographed on a 1 x 50 cm silica gel (Silicar CC-7) column with ether as the eluting solvent. The column fractions are assessed by thin layer chromatography and those fractions which have a material of the same polarity with 1-hydroxylated vitamin D3 compounds are pooled to form a crude fraction which weighs 54.5 mg after evaporation of the solvent. A major proportion (47.0 mg, 86%) of this crude fraction is transferred to a double-walled, water-cooled quartz emission vessel. 610 mg (3.42 mmol) of anthracene and 150 ml of benzene are added to the quartz radiation device.
After degassing, start the irradiation (under nitrogen atmosphere at 5 C) using a 15 watt, cool white, tubular, fluorescent light bulb. After 13 h at 6 to 7 C, the light is switched off and the solvent is evaporated. The residue is suspended in ethanol and filtered. The filtrate is evaporated and the crude residue of the filtrate is applied to a 1 x 50 cm silica gel column (Silicar CC-7).
Elution of the column with 1% methanol in chloroform, followed by pooling and evaporating such fractions containing material that is chromatographically the same as a known sample of la-hydroxyvitamin D3 leads to 24.0 mg (27% yield) of a colorless oil , which by comparison of the NMR, UV and mass spectra of the sample with that of an authentic sample shows that it is identical to lu-hydroxyvitamin D3. The sample is cochromatographically with a known sample of la-hydroxyvitamin D3 (made from la-hydroxycholesterol) in silica gel thin layer chromatography (2.5% methanol in chloroform or alternatively ether as eluting solvent).
Example 2 Syndiese of la-HSdroxyvitamin D2 from 5,6-trans-VÜamz D2
A solution of 100 mg of 5,6-trans-vitamin D2 in methylene chloride is oxidized allylic, exactly as described in Example 1. The resulting 1-hydroxylated product mixture is obtained as described in the previous example and irradiated directly under the following conditions.
A 20-fold excess of anthracene as a photosensitizer is added to a toluene solution (150 ml) of the product which is contained in a 250 ml standard round bottom flask.
The solution is degassed and kept under a nitrogen atmosphere. It is then irradiated with two conventional zir clear, fluorescent lamps (Westinghouse models FC12T10 / CW (32 watts) and FC8T9 / CW (22 watts), which are placed around the bulb, for 9 hours; the solution becomes during the irradiation The product is isolated by adding isopropanol and azeotropically evaporating the solvent, adding ethanol to the residue and filtering the anthracene. Chromatography of the residue after evaporation of the ethanol solvent on a silica gel column (1 × 50 cm), eluted with 1% methanol in CHCl3, the desired la-hydroxyvitamin D2 is obtained in 25% overall yield.
The product is identical to that of an authentic sample in terms of its chromatographic and spectroscopic properties.