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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung einer la-hydroxylierten Vitamin-D-Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass man eine 5,6-trans-Vitamin-D-Verbindung, die der la-hydroxylierten Vitamin-D-Verbindung, die hergestellt werden soll, entspricht, allylisch oxidiert, die Oxidationsprodukte mit aktinischer Strahlung in Anwesenheit eines photosensibilisierenden Mittels bestrahlt und die la-hydroxylierte Vitamin-D-Verbindung gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die allylische Oxidation mit Selendioxid durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die allylische Oxidation in Anwesenheit eines Wasserstoffperoxids oder Alkylhydroperoxids durchführt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die allylische Oxidation in Anwesenheit einer stickstoffhaltigen Base, vorzugsweise Pyridin, einem alkylsubstituierten Pyridin, Chinolin, Imidazol oder einem alkylsubstituierten Pyrazol durchführt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als 5,6-trans-Vitamin-D-Verbindung eine Verbindung der Formel
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worin X Wasserstoff, Hydroxy oder geschütztes Hydroxy ist, und R eine Steroid-Seitenkette der Formel
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darstellt, worin jeder der Reste R1 und R2 unabhängig Wasserstoff, Hydroxy, geschütztes Hydroxy oder Fluor darstellt, oder R1 und R2 zusammen eine Doppelbindung oder eine Epoxygruppe bilden, jeder der Reste R3, R4 und R5 unabhängig Wasserstoff, Hydroxy, geschütztes Hydroxy, niedrig Alkyl oder Fluor ist, und R6 Wasserstoff oder niedrig-Alkyl ist, vorzugsweise 5,6-trans-Vitamin-D3, 5,6-trans-25-Hydroxy-Vitamin-D3, 5,6-trans-Vitamin-D2,
5,6-trans-25-Hydroxy Vitamin-D2, 5,6-trans-24,25-Dihydroxy-Vitamin-D3 oder 5,6-trans-24-Hydroxy-Vitamin-D3 allylisch oxidiert.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als photosensibilisierendes Mittel Anthrazen, Phenazin oder Acridin verwendet.
Die Erfindung betrifft die Herstellung von la-hydroxylierten Vitamin-D-Verbindungen.
Die D-Vitamine (d.h. Vitamin D3 oder Vitamin D2) sind bekannte Mittel zur Steuerung der Calcium- und Phosphor homöostase. Es ist bekannt, dass beim normalen Tier diese
Verbindungen die intestinale Calciumabsorbtion und die
Knochen-Calcium-Mobilisierung stimulieren und wirksam bei der Verbindung von Rachitis sind. Es ist auch bekannt, dass Vitamin D3 (oder Vitamin D2), um wirksam zu sein, in vivo in seine Hydroxyformen umgewandelt werden muss.
Beispielsweise wird Vitamin D3 zuerst zum 25-Hydro xy-Vitamin D3 in der Leber hydroxyliert, und dieses Zwischenprodukt wird anschliessend weiter in der Niere zu la,25 Dihydroxy-Vitamin D3 hydroxyliert. Vitamin D2 geht die gleichen metabolischen Umwandlungen ein. Die la-hydroxylierte Form des Vitamins wird im allgemeinen als die physio logisch aktive oder hormonelle Form des Vitamins und als verantwortlich für die verschiedenen vorstehend erwähnten physiologischen Reaktionen angesehen. Es wurde auch ge zeigt, dass bestimmte unnatürliche synthetische la-Hydroxy
Vitamin-D-Analoge eine hohe biologische Wirksamkeit auf weisen, diesich in einigen Fällen der der in vivo erzeugten na türlichen Formen nähert. Bekannte Beispiele sind la-Hydro xy-vitamin Dz, 1 a-Hydroxy-vitamin D2 und 3-Desoxy-la hydroxy-vitamin D3.
Wegen der hohen biologischen Wirksamkeit derartiger l-hydroxylierter Vitamin-D-Verbindungen und ihrer potentiellen Brauchbarkeit zur Behandlung zahlreicher Erkrankun gen, die mit der Störung des Calciummetabolismus einherge hen, wurde chemischen Verfahrens zu deren Herstellung ein grosses Interesse entgegengebracht. Fast alle beschriebenen
Synthesen beziehen die la-Hydroxylierung geeigneter Steroide (wie Cholesterin) ein, die anschliessend in die gewünschten la-Hydroxy-Vitamin-D-Verbindungen umgewandelt werden (vgl. Schnoes und DeLuca, in Bioorganic Chemistry, Band 2, Kapitel 12, Seiten 299-335, herausgegeben von E.E. van Tamalen, Academic Press, Inc., New York, 1978).
Ein interessantes alternatives Verfahren wurde kürzlich beschrieben, das die direkte C1-Hydroxylierung von vorgebildeten D-Vitaminen betrifft (vgl. Pelc, Steroids 30, 193 (1977) und Paaren et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75,2080(1978).
Jedoch sind bei diesem direkten Oxidationsverfahren die Ausbeuten an den gewünschten la-Hydroxy-D-Vitaminen gering, und der Hauptanteil der erhaltenen Materialien besteht aus unerwünschten Produkten, die sorgfältig entfernt und gründlich chromatographiert werden müssen.
Es wurde nunmehr ein Verfahren gemäss der Erfindung bereitgestellt, das die wirksame Herstellung von la-hydroxylierten Vitamin-D-Verbindungen (d.h. mit der 5,6-cis-Doppelbindung-Geometrie) aus 5,6-trans-Vitamin-D-Verbindungen ermöglicht. Dieses Verfahren umfasst zwei Stufen, nämlich die allylische Oxidation eines 5,6-trans-Vitamin-D-Ausgangsmaterials, wobei SeO2 das bevorzugte Oxidationsmittel ist, gefolgt von der Bestrahlung des resultierenden l-hydroxy lierten Produkts in Anwesenheit eines Photosensibilisators.
Die Umwandlung der gewünschten la-Hydroxy-Vitamin-D
Verbindungen kann in etwa 230% Ausbeute nach diesem
Verfahren aus den 5,6-trans-Vitamin-D-Ausgangsmaterialien erzielt werden.
Geeignete Ausgangsmaterialien für dieses Verfahren sind 5,6-trans-Vitamin-D-Verbindungen mit der nachstehenden allgemeinen Struktur
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worin X Wasserstoff, Hydroxy oder geschütztes Hydroxy (beispielsweise die O-Acylgruppe) ist. R in der obigen Struktur kann Wasserstoff oder niedrig-Alkyl sein, und es kann jegliche der üblichen gesättigten oder ungesättigten Steroidseitenketten sein. Diese Seitenketten können auch funktionelle Gruppen tragen, wie Hydroxy-, Keton-, Säure- oder Estergruppen, wie beispielsweise in der Seitenkette von Cholensäure oder ihren Estern, Homocholensäure oder ihren Estern oder 25-Keto- oder 24-Ketocholesterin.
In der bevorzugten Ausführungsform stellt R in der vorstehenden Struktur eine Steroidseitenkette mit der Struktur
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dar, worin jeder der Reste R1 und R2 unabhängig Wasserstoff, Hydroxy, geschütztes Hydroxy oder Fluor ist, oder R1 und R2 zusammen eine Doppelbindung oder eine Epoxidgruppe bilden, jeder der Reste R3, R4 und R5 unabhängig Wasserstoff, Hydroxygeschütztes Hydroxy, niedrig-Alkyl oder Fluor darstellt, und R6 Wasserstoff oder niedrig-Alkyl ist. Hydroxyfunktionen, die gegebenenfalls in dem Ausgangsmaterial vorhanden sind (z.B. an C-3 und/oder in der Seitenkette), können ebenfalls acyliert sein (z.B. vorhanden als Acetate, Propionate, Butyrate, Benzoate, Nitro- oder Halogenbenzoate), alkyliert (z.B.
O-Methyl-, O-Äthyl oder O-Isopropyl), oder können auf andere Weise daran gehindert werden, mit den Reagentien, im Verlaufe des Verfahrens zu reagieren d.h. geschützt, wie dem Fachmann bekannt, durch übliche Hydroxy-Schutzgruppen. Jedoch ist ein derartiger Schutz für das erfindungsgemässe Verfahren nicht wesentlich.
Der hier verwendete Ausdruck niedrig-Alkyl bezeichnet einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, mit geradkettiger oder verzweigtkettiger Konfiguration, z.B.
Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl oder Butyl, und das Wort Acyl bezeichnet eine aliphatische Acylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffen, z.B. Acetyl, Propionyl oder Butyryl, oder eine aromatische Acylgruppe, wie Benzoyl, Nitrobenzoyl oder Chlorbenzoyl.
Ein bevorzugtes Reagens zur allylischen Oxidation dieser 5,6-trans-Vitamin-D-Ausgangsmaterialien ist eine Selenverbindung, insbesondere Selendioxid. Die Anwesenheit eines Hydroperoxids (z.B. Wasserstoffperoxid, oder eines Alkylhydroperoxids, wie t-Butylhydroperoxid) und einer organischen stickstoffhaltigen Base während der Oxidation ist günstig. Geeignete Basen umfassen Pyridin oder substituierte Pyridine (z.B. die isomeren Picoline, Collidin, Octahydroacridin oder Chinolin) oder Imidazol oder ein substituiertes Pyrazol (z.B. 3,5-Dimethyl-pyrazol). Eine vorteilhafte Kombination von Reagentien sind insbesondere Selendioxid, t-Butylhydroperoxid und Octahydroacridin.
Die Reaktion wird vorzugsweise in einem Lösungsmittel, z.B. einem Halogen-kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Dichloräthan oder 1,3-Dichlorpropan, bei Raumtemperatur durchgeführt. Bei Raumtemperatur erfolgt die Reaktion rasch und ist normalerweise innerhalb von 10 bis 20 Minuten beendet, obwohl im allgemeinen ein Temperaturbereich von etwa - 15 bis 30 C verwendet werden kann.
Das resultierende Produkt, das gegebenenfalls durch Chromatographie gereinigt werden kann, wird anschliessend einer photochemischen Umwandlung unterzogen.
Die photochemische Umwandlungsstufe kann wirksam durchgeführt werden, wenn man eine Lösung des Oxidationsprodukts aktinischer Strahlung in Anwesenheit eines Photosensibilisators aussetzt. Eine Lichtquelle, die eine für die Anregung des Photosensibilisators geeignete Strahlung emittiert, ist wirksam, vorausgesetzt, dass Licht mit einer Wellenlänge von weniger als etwa 310 nm ausgeschlossen wird, entweder durch geeignete Filter oder durch Wahl einer Lichtquelle, die keine Strahlung unter dieser Wellenlänge aussendet.
In der Praxis ist es zweckmässig, handelsübliche Standard-Fluoreszenzlampen zur Bestrahlung zu verwenden, wie die handels üblichen Kalt-Weiss-Modelle FC12T10/CW, FC8T9/CW, F6T5/CW oder F15T8D (jeweils Handelsprodukte der Westinghouse Electric Corporation), mit geeigneten Filtern zur wirksamen Eliminierung der niedrigen Ultraviolettstrahlungskomponente. Ein geeignetes Filter ist Pyrexglas, und die Bestrahlung der Lösung, die in einem Reaktionsgefäss enthalten ist, das aus Standard-Pyrexglas hergestellt wurde, ist daher praktizierbar, und eine vorteilhafte Verfahrensweise zur Durchführung dieser Reaktion. Geeignete Lösungsmittel für das Oxidationsprodukt sind beispielsweise Benzol und Toluol, und wirksame photochemische Sensibilisatoren sind beispielsweise Anthrazen, Acridin und Phenazin.
Es ist günstig, die Lösung unter einer inerten Atmosphäre zu halten (z.B. Stickstoff oder Argon). Die Bestrahlung führt man vorzugsweise bei einer Temperatur unter 10 C durch, wobei der Reaktionsprozess (d.h. die Bildung der l-Hydroxy- Vitamin-D-Verbindungen) periodisch durch geeignete chromatographische Methoden, z.B. durch Dünnschichtchromatographie, überwacht wird. Normalerweise benötigt man etwa 5 bis 10 h zur Beendigung der Reaktion.
Beispielsweise kann die photo chemische Umwandlung wirksam erzielt werden durch Bestrahlen einer Toluollösung des Oxidationsprodukt-Reaktionsgemischs, die Anthrazen als einen Photosensibilisator aufweist (in etwa 40fach molarem Überschuss über die Vitaminverbindung) unter einer Stickstoffatmosphäre in einem kaltem Raum bei 4 C mit zwei handelsüblichen zirkularen, fluoreszierenden Lampen (etwa insgesamt 50 Watt), die in geeigneter Weise um ein Standard-Rundkolben-Reaktions gefäss angeordnet sind, während 8 bis 10 h. Ein hohes Verhältnis von Sensibilisator zur Vitaminverbindung (z.B. 30- bis 50fach molarer Überschuss) und niedrige Temperaturen erleichtern die Reaktion.
Verwendet man Benzol als ein Lösungsmittel, so wird eine Temperatur von über 5 C empfohlen, um ein Frieren des Lösungsmittels zu vermeiden. Toluol das unter 5 C verwendet werden kann, ist als Lösungsmittel bevorzugt.
Das durch die Bestrahlung gewünschte Produkt kann leicht durch Verdampfen des Lösungsmittels und Durchführung einer Chromatographie isoliert werden. Es ist häufig vorteilhaft die Masse des Photosensibilisators vor der Chromatographie zu entfernen, z.B. durch erneutes Auflösen des Produkts in einem Lösungsmittel, in dem der Photosensibili sator schlecht löslich ist (z.B. ein Alkohol, wie Äthanol oder Methanol, im Falle von Anthrazen) und Entfernen des Photosensibilisators durch Filtrieren. Das resultierende Filtrat enthält ein Gemisch von la-hydroxylierten Vitamin-D-Verbindungen und einigem 1 ss-Hydroxyvitamin-D-Epimer.
Diese Verbindung können zweckmässig durch Chromatographie getrennt werden (z.B. Säulenchromatographie, Dünnschichtchromatographie oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie), die auch jeglichen verbleibenden Sensibilisator entfernt, unter Erzielung der 1 a-hydroxylierten Vitamin-D Verbindung der nachstehenden allgemeinen Formel, worin R und X Substituenten, wie vorstehend definiert, darstellen, in reiner Form:
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Jegliche Hydroxy-Schutzgruppen (z.B. Acylgruppen), die vorhanden sein können, können gegebenenfalls in einer abschliessenden Hydrolyse- oder Reduktionsstufe entfernt werden, unter Anwendung von Standard-Bedingungen und üblichen Bedingungen, z.B. Hydrolyse mit 0,1 m KOH/MeOH bei 25 bis 60 während 1 bis 4 h, oder Reduktion mit Lithiumaluminium-hydrid bei Raumtemperatur während 0,5 bis 1 h.
Alternativ kann die Entfernung derartiger Hydroxyschutzgruppen auch erzielt werden in einer Zwischenstufe, z.B. vor der photochemischen Reaktionsstufe.
Das Produktgemisch, das durch die von Pelc und Paaren et al. loc. cit. beschriebenen Methoden erhalten wird, umfasst beispielsweise la- und 1 ss-Hydroxy-5,6-cis- und 5,6-trans-Vitamin-D, sowie eine Anzahl anderer Oxidationsprodukte, die fast die Gesamtmenge des gebildeten Produkts einnehmen.
Ein besonders vorteilhaftes Merkmal des erfindungsgemässen Zweistufenverfahrens, d.h. Oxidation gefolgt von photochemischer Umwandlung, liegt darin, dass im wesentlichen nur l-hydroxylierte Vitamin-D-Verbindungen erhalten werden und dass die gewünschte la-Hydroxy-Vitamin-D Verbindung das Hauptprodukt darstellt. Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht somit eine wirksame und einfache Umwandlung von 5,6-trans-Vitamin-D-Verbindungen in 1 a-hydroxylierte Vitamin-D-Verbindungen (5,6-cis-Doppelbindungs-Konfiguration). Ein weiterer vorteilhafter Aspekt des Verfahrens liegt in seiner allgemeinen Durchführbarkeit; es ist anwendbar auf 5,6-trans-Vitamin-D-Ausgangsmaterialien, die jegliche der üblichen Steroidseitenketten enthalten.
Beispielsweise führt die allylische Oxidation und anschliessende Bestrahlung von 5,6-trans-Vitamin-D3 und 5, 6-trans- Vitamin-D2 zu den entsprechenden la-Hydroxy-Vitamin-D3bzw. la-Hydroxy-Vitamin-D2 -Verbindungen. Das gleiche Verfahren, angewendet auf 5,6-trans-25-Hydroxyvitamin-D3 oder 5,6-trans-25-Hydroxyvitamin-D2 ergibt la,25-Dihydroxyvitamin D3 bzw. la,25-Dihydroxyvitamin-D2, und die Oxidation und anschliessende Bestrahlung von 5,6-Trans-24,25 Dihydroxyvitamin D3 oder 5,6-trans-25,26-Dihydroxyvitamin D3 ergibt la,24,25-Trihydroxyvitamin D3 bzw.
la,25,26-Trihydroxyvitamin D3 in guter Ausbeute.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
Beispiels Synthese von la-Hydroxyvitamin D3 aus 5,6-trans- Vitamin D3
In einen 10 ml-Rundkolben werden 152 mg (1,37 mMol) Selendioxid gefolgt von 5 ml Methylenchlorid gefügt. Eine Beschickung von 750 mg (4,01 mMol) Octahydroacridin wird zu der vorstehenden Suspension, gefolgt von 300 1ll trockenem t-Butylhydroperoxid, gefügt. Die resultierende Lösung wird bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt, und anschliessend werden 100 mg (0,26 mMol) festes 5,64rans- Vitamin-D3 zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre während 16 Minuten gerührt und anschliessend aufgearbeitet durch Giessen in ein Gemisch von 70 ml Äther und 15 ml 10% wässrigem Natriumhydroxid.
Nach der Phasentrennung wird die ätherische Schicht mit 10% Natriumhydroxid (5 ml, 1 x), Wasser (5 ml, 2 x), 1% wässriger Essigsäure (5 ml, 2 x ), Wasser (5 ml, 3 x 10% wässrigem Natriumhydroxid (5 ml, 1 x ) und Wasser (5 ml, 3 x ) gewaschen. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels gewinnt man 108,1 mg Rohprodukt.
Das Rohprodukt wird an einer 1 x 50 cm Siliciumdioxidgel (Silicar CC-7) säule mit Äther als Eluierlösungsmittel chromatographiert. Die Säulenfraktionen werden durch Dünnschichtchromatographie bewertet, und solche Fraktionen, die ein Material gleicher Polarität mit l-hydroxylierten Vitamin D3-Verbindungen aufweisen, werden gepoolt, unter Bildung einer Rohfraktion, die 54,5 mg wiegt nach Verdampfen des Lösungsmittels. Ein Hauptanteil (47,0 mg, 86%) dieser Rohfraktion wird in ein doppelwandiges wassergekühltes Quarzemissionsgefäss überführt. Der Quarzbestrahlungsvorrich tungwerden 610 mg (3,42 mMol) Anthrazen und 150 ml Benzol zugesetzt.
Nach dem Entgasen beginnt man mit dem Bestrahlen (unter Stickstoffatmosphäre bei 5 C) unter Verwendung einer 15 Watt, kaltweissen, rohrförmigen, fluoreszierenden Lichtbirne. Nach 13 h bei 6 bis 7 C wird das Licht abgeschaltet und das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wird in Äthanol suspendiert und filtriert. Das Filtrat wird verdampft, und der rohe Rückstand des Filtrats wird auf eine 1 x 50 cm Siliciumdioxidgelsäule (Silicar CC-7) aufgebracht.
Eluieren der Säule mit 1% Methanol in Chloroform, gefolgt vom Poolen und Verdampfen solcher Fraktionen, die Material enthalten, das chromatographisch gleich mit einer bekannten Probe von la-Hydroxyvitamin D3 ist, führt zu 24,0 mg (27% Ausbeute) eines farblosen Öls, von dem es sich durch Vergleich der NMR-, UV- und Massenspektren der Probe mit denen einer authentischen Probe zeigt, dass es identisch mit lu-Hydroxyvitamin D3 ist. Die Probe ist cochromatographisch mit einer bekannten Probe von la-Hydroxyvitamin D3 (hergestellt aus la-Hydroxycholesterin) bei Siliciumdioxidgel-Dünnschichtchromatographie (2,5% Methanol in Chloroform oder alternativ Äther als Eluierlösungsmittel).
Beispiel 2 Syndiese von la-HSdroxyvitamin D2 aus 5,6-trans- VÜamz D2
Eine Lösung von 100 mg 5,6-trans-Vitamin D2 in Methylen-chlorid wird allylisch oxidiert, genau wie im Beispiel 1 beschrieben. Das resultierende l-hydroxylierte Produktgemisch wird wie im vorstehenden Beispiel beschrieben, gewonnen und direkt unter folgenden Bedingungen bestrahlt.
Zu einer Toluollösung (150 ml) des Produkts, die in einem 250 ml-Standard-Rundkolben enthalten ist, wird ein 20facher Uberschuss von Anthrazen als Photosensibilisator gefügt.
Die Lösung wird entgast und unter einer Stickstoffatmosphäre gehalten. Sie wird anschliessend mit zwei üblichen zir klaren, fluoreszierenden Lampen (Westinghouse-Modelle FC12T10/CW (32 Watt) und FC8T9/CW (22 Watt), die um den Kolben plaziert sind, während 9 h bestrahlt; die Lösung wird während der Bestrahlung bei 4 "C gehalten. Das Produkt wird isoliert durch Zusatz von Isopropanol und azeotrope Verdampfung des Lösungsmittels, Zusatz von Äthanol zu dem Rückstand und Filtrieren des Anthrazens. Durch Chromatographie des nach dem Verdampfen des Äthanollösungsmittels verbleibenden Rückstands an einer Siliciumdioxidgelsäule (1 x 50 cm), eluiert mit 1% Methanol in CHCl3, erhält man das gewünschte la-Hydroxyvitamin D2 in 25% Gesamtausbeute.
Das Produkt ist identisch mit dem einer authentischen Probe in seinen chromatographischen und spektroskopischen Eigenschaften.