DE3031990A1

DE3031990A1 - Verfahren zur gewinnung von myeloperoxidase und arzneipraeparate mit einem gehalt an diesem enzym als hauptbestandteil

Info

Publication number: DE3031990A1
Application number: DE19803031990
Authority: DE
Inventors: Eichi Hasegawa; Takashi Hirakata Kobayashi
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1979-12-28
Filing date: 1980-08-25
Publication date: 1981-07-02
Also published as: SE8005679L; FR2472609A1; ATA436780A; US4306025A; IN153488B; SE448882B; DE3031990C2; AT370997B; US4379141A; FR2472609B1

Description

"Verfahren zur Gewinnung von Myeloperoxidase und Arneipräparate mit einem Gehalt an diesem Enzym als Hauptbestandteil"

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung von Myeloperoxidase aus menschlichen, myelogenen Leukocyten. Ferner betrifft die Erfindung keimtötende Arzneipräparate mit einem Gehalt an Myeloperoxidase als Hauptbestandteil.

Myeloperoxidase ist ein Enzym, das zuerst im Jahre 1941 durch Agner in tierischen Leukocyten nachgewiesen wurde; vgl. Agner, Acta Physiol. Scand., Bd. 2, Suppl. (1941), S. 8. Dieses Enzym ist in grossen Mengen zusammen mit Lysozym in myelogenen, weissen Blutkörperchen, insbesondere in neutralen, mehrkernigen Leukocyten und in Monocyten enthalten. Der Gehalt beträgt bis zu 5 Prozent, bezogen auf das Gewicht der Neutrophilen.

Dieses Enzym ist basischer Natur und weist ein Molekulargewicht in der Grössenordnung von 120 000 bis 150 000 Dalton auf. Das Molekül besteht aus zwei analogen Untereinheiten und enthält zwei Eisenatome, wovon eines in Form von Häm-Eisen

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und das andere als Nichthäm-Eisen vorliegt. Es gehört zur Gruppe der Oxidoreduktasen.

Die physiologische Funktion von Myeloperoxidase scheint darin zu liegen, in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Halogenionen ein Hypohalogenition zu bilden, das eine stark oxidierende und stark halogenierende Wirkung aufweist und dadurch im Protein- oder Nucleinsäureteil von Bakterien, Pilzen, Viren oder dergleichen irreversible Veränderungen hervorruft. Dies ist vermutlich der Mechanismus, der der pharmakologischen Wirkung von Myeloperoxidase, beispielsweise der Zerstörung von Bakterien und Viren oder der Inaktivierung von Viren, zu Grunde liegt.

Wie vorstehend erläutert, lassen die vorstehenden Eigenschaften darauf schliessen, dass Myeloperoxidase einen wertvollen Arz-■ neistoff darstellt. Jedoch birgt aus fremden tierischen Spezies isolierte Myeloperoxidase biologische Gefahren in sich, da. sie aufgrund von Antigen-Antikörper-Reaktionen Nebenwirkungen hervorruft, die eine wiederholte Verabreichung erschweren. Auf der anderen Seite ist es äusserst schwierig, Myeloperoxidase menschlichen Ursprungs in grösseren Mengen zu gewinnen, was darauf zurückzuführen ist, dass die Ausgangsmaterialien nur in sehr beschränktem Umfang zur Verfügung stehen. Aus den vorstehenden Gründen wurde es bisher für unmöglich gehalten, Myeloperoxidase klinisch anzuwenden. Tatsächlich wurde Myeloperoxidase in der Praxis bisher nicht angewendet.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein in grösserem Masstab durchführbares Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Myeloperoxidase menschlichen Ursprungs zur Verfügung zu stellen.

Erfindungsgemäss wurde festgestellt, dass beim Vermischen einer wässrigen Suspension eines Zerkleinerungs- (Zerfalls-)produkts von menschlichen, myelogenen Leukocyten mit mindestens einem Bestand-

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Γ - 6■■- .

teil aus der Gruppe Mangansalze und Protaminsulfat die Suspension in einen überstand mit einem Gehalt an Myeloperoxidase und einen Verunreinigungen enthaltenden Niederschlag getrennt wird. Ferner wurde festgestellt, dass aus diesem überstand hochreine menschliche Myeloperoxidase in grösserem Masstab abgetrennt und gewonnen werden kann, indem man zunächst durch Zentrifugation eine Myeloperoxidase enthaltende Fraktion gewinnt und diese Fraktion mit einem Kationenaustauscher in Kontakt bringt, um die Myeloperoxidase zu adsor-10

bieren, die anschliessend eluiert und gewonnen werden kann.

Bei Untersuchungen an der erfindungsgemäss erhaltenen Myeloperoxidase wurde ferner festgestellt, dass Präparate, die · Myeloperoxidase und ein Alkalimetallhalogenid in einem bestimmten Verhältnis enthalten, in Abwesenheit von Wasserstoffperoxid die vorerwähnte pharmakologische Wirkung auf solche Mikroorganismen, deren Katalase-Synthesesystem fehlt oder verringert ist, ausüben. Schliesslich wurde festgestellt, dass derartige Präparate in grossen Mengen durch

Injektion verabfolgt werden können, was die Möglichkeit einer ausgeprägten therapeutischen Wirkung von Myeloperoxidase auf Krankheiten, die durch Infektionen mit den vorerwähnten Mikroorganismen verursacht werden, eröffnet.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung von Myeloperoxidase, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine wässrige Dispersion eines Zerkleinerungs dukts' von menschlichen, myelogenen Leukocyten mit mindestens

einem Bestandteil aus der Gruppe Mangansalze und Protarain-30

sulfat versetzt und Myeloperoxidase aus der überstehenden

Flüssigkeit abtrennt und gewinnt.

Ferner wird erfindungsgemäss ein Verfahren zur Abtrennung

und Gewinnung von Myeloperoxidase bereitgestellt, indem man 35

durch Zentrifugation aus der genannten überstehenden Flüssig-

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keit eine Myeloperoxidase-Fraktion abtrennt und diese Fraktion mit einem Kationenaustauscher in Kontakt bringt, um die Myeloperoxidase daran zu adsorbieren.

Ferner kann erfindungsgemäss in einer beliebigen Stufe der vorgenannten Verfahren eine 8- bis 36-stündige Wärmebehandlung bei Temperaturen von 50⁰C oder darüber und vorzugsweise bei Temperaturen von 50 bis 80°C durchgeführt werden.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Arzneipräparate mit einer Wirkung gegen Mikroorganismen, deren Katalase-Synthesesystem fehlt oder verringert ist. Diese Arzneipräparate sind gekenn-' zeichnet durch einen Gehalt an 5 bis 0,05 Millimol eines Alkalimetallhalogenids pro 100 bis 0,05 Einheiten an Myelo-

15 peroxidase.

Als Ausgangsmaterial zur Gewinnung von Myeloperoxidase wird ein Zerfallsprodukt von menschlichen, myelogenen Leukocyten, die die abzutrennende und zu gewinnende Myeloperoxidase enthalten, verwendet.

Beim Menschen machen die Leukocyten im allgemeinen 60 bis 70 Prozent der weissen Blutkörperchen im allgemeinen Sinn, die kein im Blut auftretendes Atmungspigment enthalten, aus (nachstehend werden diese weissen Blutkörperchen als "weisse Blutkörperchen im allgemeinen Sinn" bezeichnet). Obgleich "das Zerkleinerungsprodukt derartiger Leukocyten beim erfindungsgemässen Verfahren als Ausgangsmaterial verwendet werden kann, werden vorzugsweise vorher Blutbestandteile, wie Erythrocyten und Thrombocyten, sowie Blutplasma entfernt. Zur Zeit werden die weissen Blutkörperchen im allgemeinen Sinn zur Verwertung der darin enthaltenen Lymphocyten bei der induzierten Herstellung von Interferon, welches z.Zt. grosse Aufmerksamkeit als antimikrobieller Wirkstoff mit breitem Wirkungsspektrum findet, verwendet. Die nach der Abtrennung von Interferon verbleibenden Leukocyten können selbstverständlich als Aus-

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gangsmaterial im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden.

Das im erfindungsgemässen Verfahren verwendete Zerldeiiierungsprodukt von menschlichen, myelogenen Iieukocyten wird durch Zerkleinerung der vorgenannten Ausgangsstoffe erhalten. Diese Zerkleinerung wird normalerweise herbeigeführt, indem man eine wässrige Suspension von Leukocytenzellen 5 Minuten bei O⁰C in einem Homogenisator behandelt.

vor der Weiterbehandlung in der nächsten Stufe, bei der mindestens ein Mangansalz und/oder Protaminsulfat zugemischt wird, wird die wässrige Suspension vorzugsweise durch Zentrifugation (10 000 U/min) in einen Niederschlag und einen überstand aufgetrennt. Der gelblich-grüne überstand wird als eine Myeloperoxidase enthaltende Fraktion gewonnen und in der 50- bis 100-fachen (Vol./Vol.) Menge einer Pufferlösung (pH-Wert 6,0 bis 8,0) mit einem Gehalt an Kaliumsulfat oder Tris und 5 bis 15 Prozent (Gew./Vol.) Ammoniumsulfat suspendiert. Die erhaltene Suspension wird sodann homogenisiert.

in der nächsten Stufe wird die homogenisierte Suspension mit mindestens einer Verbindung aus der Gruppe Mangansalze und Protaminsulfat vermischt. Aufgrund der Zugabe eines derartigen Salzes verbleibt die Myeloperoxidase im überstand und lässt sich sehr leicht abtrennen und gewinnen. Es kommen Manganionen bildende Mangansalze in Frage wie Mangansulfat, Mangannitrat oder Manganchlorid. Mangansulfat wird bevorzugt. Die Menge des Salzzusatzes wird so gewählt, dass die Endkonzentration im allgemeinen 5 bis 20 millimolar und vorzugsweise 8 bis 10 millimolar für die Mangansalze und 0,1 bis 0,02 Prozent (Gew./Vol.) und vorzugsweise 0,2 bis 0,01 Prozent (Gew./Vol.) für Protaminsulfat beträgt. Nach der Salzzugabe wird die Suspension zentrifugiert (10 000 U/min), um die Myeloperoxidase-Fraktion, d.h. den überstand, zu gewinnen. Dieser überstand wird sodann zur Abtrennung der Myeloperoxidase der Säulenchromatographie mit einem Kationenaustauscher unterzogen. Vor der Säulenchromatographie wird der überstand

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vorzugsweise dialysiert und zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen.

Die bevorzugt am Kationenaustauscher adsorbierte Myeloperoxi-S dase wird sodann eluiert. Kationenaustauscher mit unterschiedlichen Säurestärken, von ernem stark sauren bis zu einem schwach sauren pH-Wert, können ohne besondere Beschränkungen verwendet werden. Die Adsorption ist bei einem pH-Wert von 5,5 bis 8,0 und insbesondere von 7,0 bis 7,5 besonders ausgeprägt. In der Praxis wird die Adsorption vorzugsweise unter Verwendung eines auf den gewünschten pH-Wert eingestellten Puffers von geringer Konzentration durchgeführt, beispielsweise mit 10 bis 80 millimolarera Phosphatpuffer oder 50 bis 80 millimolarem Dikaliumhydrogenphosphatpuffer. Die Elution wird ausgeführt, indem man zunächst mit einer äquilibrierten Pufferlösung wäscht und sodann mit Pufferlösungen mit erhöhter Salzkonzentration (gemäss einer bevorzugten Ausführungsform wird die Phosphatkonzentration allmählich von 80 auf 400 millimolar· erhöht) behandelt, um die Fraktion mit Myeloperoxi-

20 dase-Aktivität zu gewinnen.

Das erhaltene wässrige Eluat ist grüngefärbt. Die Ausbeute an gewonnener Myeloperoxidase beträgt etwa 40 Prozent. Beispielsweise erhält man insgesamt 8815 Einheiten (bestimmt gemäss dem Verfahren von B. Chance u. Mitarb., Methods in Enzymology, Bd. II (1955), S. 764) an Myeloperoxidase aus 1,47 x 10¹¹ Leukocytenzellen. Die auf diese Weise erhaltene wässrige Lösung von Myeloperoxidase wird sodann verschiedenen, zur Herstellung von Arzneipräparaten üblichen Behandlungsschritten unterzogen, beispielsweise wird dialysiert, aseptisch filtriert, in Fläschchen abgefüllt und lyophilisiert.

Gegebenenfalls kann das erfindungsgemässe Verfahren durch eine 8-bis 36-stündige Wärmebehandlung bei 50 bis 70⁰C ergänzt werden. Diese Behandlung wird in wässriger Lösung oder wässriger Suspension vom pH-Wert 5 bis 8 durchgeführt, um verschiedene Viren"und Bakterien, die als Verunreinigungen in Blut-

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-ΙΟΙ Präparaten enthalten sein können, zu inaktivieren. Diese Wärmebehandlung wird bei einer beliebigen Verarbeitungsstufe durchgeführt. Wenn das Rohmaterial, die myelogenen Leukocyten, der Wärmebehandlung unterzogen werden, erreicht man die Entfernung der thermolabilen Substanzen durch gleichzeitige Ausfällung, was die Wirksamkeit der Reinigung erhöht. Selbstverständlich ist es möglich, auch das Endprodukt der Wärmebehandlung zu unterziehen.

Ferner kann das erfindungsgemässe Verfahren vorzugsweise auch durch Gelfiltration ergänzt werden. Dabei wird ein für die Abtrennung einer Substanz mit einem Molekulargewicht von etwa^r 3000 bis 150 000 Dalton geeigneter Träger verwendet, beispielsweise ein Polyacrylamidgel, wie Sephadex G-200 und Biogel P-300, oder ein Agarosegel, wie Sepharose 6B. Vorzugsweise wird ■ das Produkt nach der Behandlung mit dem Kationenaustauscher der Gelfiltration unterzogen. Durch die Gelfiltration werden Verunreinigungen von niederem Molekulargewicht entfernt. Man erhält ein Produkt, das sich bei der elektrophoretischen Analyse (1,5-stündige Elektrophorese bei Raumtemperatur mit einem Gel vom pH-Wert 4,0) als ausreichend einheitlich erweist.

Mit dem erfindungsgemässen Verfahren gelingt es, in grosstechnischem Masstab hochreine,· menschliche Myeloper^xidase in hohen Ausbeuten herzustellen. Da das Produkt im wesentlichen keine Verunreinigungen enthält und menschlichen Ursprungs ist, ist seine sichere Anwendung als Arzneipräparat ohne die Gefahr von Nebenwirkungen aufgrund von vorhandenen heterogenen Protein-Antigenen möglich.

In den erfindungsgemässen Arzneipräparaten wird vorzugsweise, aber nicht ausschliesslich die nach dem erfindungsgemässen Verfahren gereinigte Myeloperoxidase verwendet. Es ist auch möglich, nach anderen Verfahren hergestellte Myeloperoxidase-Präparate zu verwenden, sofern diese Verfahren es ermöglichen, einen ebenso hohen Reinigungsgrad wie beim erfindungsgemässen

Verfahren zu erzielen.

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L -J

In den erfindungsgemässen Arzneipräparaten können beliebige Alkalimetallhalogenide enthalten sein, sofern sie pharmakologisch verträglich sind. Beispiele dafür sind Chloride und Jodide von Alkalimetallen, wie Kalium und Natrium.

Der Anteil des Alkalimetallhalogenide in den Präparaten beträgt im allgemeinen 5 bis 0,05 mMol und vorzugsweise 1 bis

. 0,1 mMol pro 100 bis 0,5 Einheiten Myeloperoxidase.

■¹⁰ Die erfindungsgemässen Arzneipräparate werden auf beliebige, an sich übliche Weise durch Zugabe eines Alkalimetallhalogenids zu gereinigter Myeloperoxidase hergestellt. Gegebenenfalls können weitere, in der pharmakologischen Praxis übliche Trägerstoffe, Verdünnungsmittel, Stabilisatoren, Aktivatoren und Konservierungsmittel zugesetzt werden.

Die auf diese Weise hergestellten Arzneipräparate weisen in vivo eine ausgeprägte keimtötende Wirkung gegenüber pathogenen Mikroorganismen auf, deren Katalase-Syntheseaktivität fehlt oder verringert ist. Die Präparate lassen sich therapeutisch bei von diesen Mikroorganismen hervorgerufenen Infektionen einsetzen. Unter dem Ausdruck "pathogener Mikroorganismus, dessen Katalase-Syntheseaktivität fehlt oder verringert ist" sind solche pathogenen Mikroorganismen zu verstehen, bei denen die enzymatische Aktivität zur extrazellulären Bildung von Katalase in einem lebenden, mit dem Mikroorganismus infizierten Körper fehlt oder verringert ist. Ein typisches Beispiel dafür sind gegen Isonicotinsäurehydrazid resistente Tuberkelbazillen. Die Arzneipräparate der Erfindung eignen sich daher zur Behandlung von unbeeinflussbarer Tuberkulose, die auf Chemotherapie und antibiotische Wirkstoffe nicht anspricht.

Für Injektionszwecke wird das erfindungsgemässe Präparat in entsprechender Kochsalzlösung zu einer Konzentration von etwa 100 bis etwa 1000 Einheiten/ml Lösung gelöst und vor-

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ι zugsweise lokal verabfolgt.

Die Verabreichung kann auch parenteral erfolgen. Obgleich die lokale Verabfolgung bevorzugt wird, kann das Präparat auch extern gegeben werden. In der Praxis wird es beispielsweise intravenös (im Fall einer systemischen Erkrankung, sowie Septikämie oder miliarer Tuberkulose) ,intramuskulär oder durch Sprühen in die Luftwege verabreicht.

Die Dosen hängen vom Verabfolgungsweg, der zu behandelnden Krankheit und den Symptomen ab. Im Fall einer intravenösen Injektion oder lokalen Verabfolgung beträgt die Tagesdosis für Erwachsene 100 bis 1 Einheit/kg Körpergewicht.

Nachstehend werden die keimtötende Wirkung und die akute Toxizität der erfindungsgemässen Präparate erläutert. Die Myeloperoxidase-Einheiten werden gemäss dem Verfahren von B. Chance u. Mitarb., Methods in Enzymology, Bd. II (1955), S. 764 bestimmt.

(1) Keimtötende Wirkung

Zur Untersuchung der keimtötenden Wirkung der erfindungsgemässen Präparate werden verschiedene Präparate jnit einem Gehalt an Myeloperoxidase und einem Halogen- hergestellt.

Hierbei wird auch die Wirkung festgestellt, die durch die Anwesenheit von Wasserstoffperoxid hervorgerufen wird. Die Untersuchung wird durchgeführt, indem man die einzelnen Bestandteile in 0,1 ra Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert '7,0 löst. Man stellt ein Testgemisch mit einem Gehalt an 1 ml wässriger Myeloperoxidase-Lösung, 1 ml Kaliumjodidlösung (der KJ-Gehalt ist in Tabelle I angegeben), 1 ml Wasserstoffperoxidlösung (der HpOp-Gehalt ist in Tabelle I angegeben) und 1 ml Bakteriensuspension her. Das Gemisch wird 60 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Die Anzahl der überlebenden Bakterien wird ³^ gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

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Tabelle I

	Bestandteil	KJ, raMöl	H₂O₂, mMol	Anzahl der-überlebenden Bakterien	Staphylo coccus aureus	Pseudojnonas aeruginosa	Candida albicans	Myco- bacterium tubercu losis	Myco- bacterium tubercu- . losis resistent gegen INH
	Myeloper- oxidase, Einheiten	5,0	2,0	0	0	0	0	0
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30027/0	20	t!	II	It	ti	Il	ti	11
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	0,1	Il	ti	2,5 x103	3,1x103	3,1 x 10²	2,8 x 10²	1,3 x 103
	0,01	It	It	3,8 χ io5	2,0 x 10⁷	1,3 x 10⁶	1,1x10⁶	1,2 χ 10⁶
	0		It	0	0	0	0	0
	100	It	Il	It	It	II	It	ti
	20	ti	It	Il	Il	It	Il	Il
	1	ti	Il	k,5 x 10	3,3 χ 10	2, 3 χ 10	2,1 χ 10	2,iJ χ 10
	0,1	Il	Il	3,1 χ ίο³	1,2 χ 10²	2,1 χ 10²	1,8 χ 10²	1,9 χ 10²
0,01	II	Il	2,2 xlO⁶	1, Ί χ 107	1,3 x 10⁶	1,6 χ10⁶	1,3 χ 10⁶
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Tabelle·. T (Forts.)

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0	Il	11	2,9 x 1θ6	1,1 χ 107	1,3 χ 107	2,1 χ 107	2,1 χ ΙΟ⁷
20	1,0	0,1	0	0	0	0	O
20	1,0	0	3,¹J χ 1θ5	1,1 χ 10⁶	1,3 χ ΙΟ⁶	1,2 χ 1θ6	1,8 χ.ΙΟ⁶
20	0	0	1,1 χ 10⁷	1,3 χ 10⁶	1,8 χ ΙΟ⁶	1,9 χ ΙΟ⁶	1,7 χ ίο⁶
0	2,0	0	2,2 χ ΙΟ⁷	7,1 χ ίο⁶	3,ιχ ίο⁶	4,1 χ ΙΟ⁶	5,1 χ ΙΟ⁶
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- 1 ο -

(2) Tierversuch

1) Die Wirkung eines erfindungsgemässen Arzneipräparats (5o Einheiten Myeloperoxidase und 2 mMol Natriumiodid pro 1 ml) auf eine durch Tuberkelbazillen hervorgerufene experimentelle Infektion wird an 3 Gruppen von Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von jeweils 200 bis 250 g untersucht. Die Gruppen

bestehen aus jeweils 5 Tieren. 3,7 x 10 gegen INH resistente - ., Tu.berkelbazillen werden in 1 ml einer., wässrigen. Lösung sus-. .Q pendiert. Jeweils 0,05 ml der erhaltenen Suspension werden in die Nasenhöhle der Ratten injiziert.

Die erste Tiergruppe dient als Kontrollgruppe und erhält keine Arzneimittelbehandlung. Der zweiten Gruppe wird 2 Wochen nach der Impfung mit den Bazillen das erfindungsgemässe'Präparat 4 mal in Abständen von 8 Stunden verabreicht, wobei jeweils 2 ml Präparat verwendet werden und die Sprühzeit 15 Minuten beträgt. Die dritte Gruppe erhält vor der Bazilleninjektion eine 15-minütige Sprühbehandlung mit dem erfindungsgemässen Präparat. Nach der Bazilleninjektion werden weitere 4 Sprühbehandlungen durchgeführt. Die Sprühbehandlung wird ausgeführt, indem man die Ratte in einen mit einem falschen Boden versehenen Exsikkator von 35 cm Durchmesser bringt. Aus dem Arzneipräparat wird mit Hilfe eines Zerstäubungsgeräts ein Nebel erzeugt, der durch den falschen Boden eingeleitet und von oben im Exsikkator freigesetzt wird.

Die pharmakologische Wirkung wird aufgrund der Sterblichkeit der Ratten nach 6 Monaten bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Anzahl der überlebenden Ratten

1. Gruppe 0/5

2. Gruppe 5/5

3- Gruppe 5/5

1 30027/082S ι J

Aus Tabelle II ergibt sich, dass sämtliche Ratten, die das Arzneipräparat nicht erhalten haben, eingegangen sind, während sämtliche behandelten Tiere überlebt haben.

2) Die akute Toxizität wird durch Verabfolgung von 2130 Einheiten/kg Myeloperoxidase und 210 mg/kg Natriumiodid an eine Gruppe von 4 männlichen dd-Mäusen von 16,5 bis 20,0 g Körpergewicht untersucht.

Das Arzneipräparat wird durch die Vena coccygea verabreicht. 72 Stunden und 7 Tage nach der Verabreichung befinden sich sämtliche Mäuse am Leben und in einem guten Zustand. Nach 7 Tagen wird eine Autopsie durchgeführt. In den inneren Or-. ganen von sämtlichen Mäusen lassen sich keine Abnormalitäten

15 feststellen.

Aus den vorstehenden Befunden lässt sich schliessen, dass beim Menschen eine therapeutische Wirkung durch Verabfolgung von 100 bis 0,05 Einheiten Myeloperoxidase und 5 bis 0,05 mMol Halogenid hervorgerufen wird.

Erfindungsgemäss ist es erstmals möglich, Myeloperoxidase als Arzneistoff mit hervorragender und bisher nicht gekannter therapeutischer Wirkung einzusetzen. 25

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispieli

Etwa 1 Liter einer ί
30

Etwa 1 Liter einer Suspension von 1,47 x 10 weissen Blutzellen (weisse Zellen im allgemeinen Sinn) werden 5 Minuten bei 0⁰C in einem bei 30 000 U/min betriebenen Homogenisator behandelt, um die Zellen zu zerkleinern. Die erhaltene Suspension wird 20 Minuten bei 0 bis 10⁰C zentrifugiert. Man erhält einen gelblich-grünen flüssigen überstand (Gesamt-

aktivität 22 493 Einheiten). Der überstand wird mit Mangan-

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sulfat bis zu einer Endkonzentration von 5 bis 10 millimolar versetzt. Sodann wird der Niederschlag abzentrifugiert. Der Überstand wird durch Dialyse gegen eine 80 millimolare wässrige Dikaliumhydrogenphosphatlösung unter Verwendung eines Cellophanschlauchs als semipermeabler Membran entsalzt. Die entsalzte Lösung wird auf eine mit etwa 60 ml CM-Sephadex C-50 (Pharmacia Co., Schweden) gepackte Säule, die mit 80 millimolarer· wässriger Dikaliumhydrogenphosphatlösung äquilibriert worden ist, aufgesetzt. Die Säule wird mit der zum Äquilibrieren

Ό verwendeten wässrigen Lösung gewaschen und sodann mit einem linearen Konzentrationsgradienten unter. Verwendung von wässrigen Dikaliumhydrogenphosphatlösungen mit Konzentrationen von 80 millimolar und 400 millimolar eluiert. Die gewünschte Fraktion wird aufgrund der Absorptionsmessung des Eluats bei 280 nm und 43o nm gewonnen. Die letztgenannte Wellenlänge ist charakteristisch für Myeloperoxidase.

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, mit der Ab-20

änderung, dass Protaminsulfat (Endkonzentration 0,1 bis 0,02 Prozent) anstelle von Mangansulfat verwendet wird. Ferner wird SP-Sephadex C-50 (Pharmacia Co.) äquilibriert mit 50 millimolarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 anstelle von CM-Sephadex C-50 verwendet. Nach dem Waschen der Säule mit -50 millimolarer wässriger Dikaliumhydrogenphosphatlösung wird sie mit einem linearen Konzentrationsgradienten unter Verwendung von Dikaliumhydrogenphosphatlösungen mit Konzentrationen von 50 millimolar und 200 millimolar eluiert. Die Ergebnisse entsprechen denen von Beispiel 1.
30

Beispiel 3

Ähnliche Ergebnisse wie in Beispiel 1 werden erhalten, wenn man das Verfahren von Beispiel 1 mit der Abänderung wiederholt, dass die gewonnene Myeloperoxidäse-Fraktion auf den pH-Wert 5 bis 7 eingestellt und 1 Stunde einer Wärmebehandlung bei 6p°C unterzogen wird.

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Beispiel*»

Das bei der letzten Stufe von Beispiel 1 erhaltene Produkt wird der Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-200 (Säule der Abmessungen 2,5 x 16 cm; äquilibriert mit 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0; Elution der Säule mit dem Aquilibrierungspuffer) unterworfen. Es wird ein hochreines Produkt erhalten. Die Steigerungen in bezug auf Reinheit und Ausbeute sind in Tabelle III angegeben.

Tabelle III

10 Reinigung	Gesamt volumen ■ (ml)	Absorption	(43Onm)	(430nm/ 280nm)	Gesamt aktivität (Einheiten)	Aus beute (%)
Extrakt- 15 lösung	1059	(280nm)	-	-	22 493	100
dialysierte Lösung	1170	15,18	0,281	0,05	12 747	56,7
nach Behand lung mit 20 CM-Sephadex	282	5,53	0,204	0,67	8815	39,2
nach Gel filtration	47	0,305	0,974	0,83	5182	23,0
1,170

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Nachstehend ist die Herstellung eines Arzneipräparats für Injektions- und Sprühzwecke erläutert:

Entsprechende Lösungen werden aseptisch in solchen Mengen in braune Fläschchen gefüllt, dass jedes Fläschchen 100 Einheiten Myeloperoxidase und 3 mMol Natriumjodid enthält. Die Fläschchen werden lyophilisiert und verschlossen. Unmittelbar vor der Verwendung wird jedes Fläschchen mit 5 ml physiologischer Kochsalzlösung versetzt. Man erhält eine für Injektionszwecke (bzw. für Sprühzwecke) geeignete Lösung.

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Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von Myeloperoxidase, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Suspension eines Zer-]d.einerungsprodukts von menschlichen, myelogenen Leukocyten mit mindestens einem Bestandteil aus der Gruppe Mangansalze und Protaminsulfat vermischt und anschliessend die Myeloperoxidase aus der überstehenden Flüssigkeit abtrennt und gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

man die Abtrennung und Gewinnung der Myeloperoxidase durchführt, indem man aus der überstehenden Flüssigkeit durch Zentrifugation eine Myeloperoxidase-Fraktion gewinnt und anschliessend diese Fraktion mit einem Kationenaustauscherharz in Kontakt bringt, um daran die Myelo-

peroxidase zu adsorbieren.

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3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeicnnet, dass man in einem beliebigen Stadium der Abtrennung der Myeloperoxidase eine 8- bis 36-stündige Wärmebehandlung bei Temperaturen von 50 bis 70⁰C vornimmt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mangansalz Mangansulfat, Mangannitrat oder Manganchlorid verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Mangansalz bis zu einer Endkonzentration von 5 bis 20 millimolar und Protaminsulfat bis zu einer Endkonzentration von 0,1 bis 0,02 Prozent (Gew./Vol.) zusetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den Kontakt mit dem Kationenaustauscherharz bei einem pH-Wert von 5,5 bis 8,0 durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das gewonnene Produkt zusätzlich der Gelfiltration unterwirft.

8. Arzneipräparat mit einer Wirkung gegenüber Mikroorganismen, deren Katalase-Syntheseaktivität fehlt oder verringert ist, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 5 bis 0,05 Millimol eines Alkalimetallhalogenide pro 100 bis 0,05 Einheiten einer Myeloperoxidase aus menschlichen, myelo-

genen Leukocyten. 30

9. Arzneipräparate nach Anspruch 8_r dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Mikroorganismen, deren Katalase-Syntheseaktivität fehlt oder verringert ist, um gegenüber Isonicotinsäurehydrazid resistente Tuberkelbazillen handelt.

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10. Arzneipräparate nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Alkalimetallhalogenid um ein Chlorid oder Jodid von Kalium oder Natrium handelt.

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