DE3005020A1

DE3005020A1 - Verfahren und mittel zur konservierung und aufwertung von gruenpflanzen

Info

Publication number: DE3005020A1
Application number: DE19803005020
Authority: DE
Inventors: Louis Ostre
Original assignee: Ceva SA
Current assignee: Ceva Sante Animale SA
Priority date: 1979-02-12
Filing date: 1980-02-11
Publication date: 1980-08-28
Also published as: YU34980A; RO85921A; LU82150A1; DE3005020C2; RO85921B; AT368842B; HU185784B; GR74002B; DD149015A6; ES488462A2; PT70817A; GB2046567B; CA1127101A; DK57980A; PL122629B1; GB2046567A; ATA74580A; NL8000876A; PL221935A3; AU5541280A

Description

TlEDTKE - BüHLING - KlNNE Grupe - Pellmann

_3₅0_05020

Patentanwälte: -DTpl.-lng. H.Tiedtke ;DiRl.-Chem. G. Bühling Dipl.-Ing. R. Kinne Dipl.-Ing. R Grupe Dipl.-Ing. B. Pellmann

Bavariaring 4, Postfach 202403 8000 München 2

Tel.: 089-539653

Telex: 5-24845 tipat

cable: Germaniapatent München

11. Februar 1980

DE 0215/Dossier 2106a2/2106a3 DRST.U/
DPICV/JO/NG/3-164

SOCIETE CEVA S.A.

Neuilly-sur-Seine / Frankreich

Verfahren und Mittel zur Konservierung und

Aufwertung von Grünpflanzen

090035/0-707

Deutsche Bank (München) Kto. 51/61070 ■ Dresdner Bank (München) Kto. 3939844 Postscheck (München) Kto. 670-43-804

1 Verfahren und Mittel zur Konservierung und Aufwertung von Grünpflanzen

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und ein Mittel zur Konservierung und Aufwertung, von frischen bzw. Grühpflanzen, wodurch es ermöglicht wird, daß die Pflanzen je nach Bedarf zu einem späteren Zeitpunkt, d. h. nach ihrer Ernte, in appetitanregender Form konsumiert bzw. verfüttert werden können.

Verfahren zur Konservierung von Grünpflanzen sind mit einer Anzahl von Schwierigkeiten verbunden.

Das Silieren beruht auf dem Prinzip, daß frische bzw. Grünpflanzen über einen längeren oder kürzeren Zeitraum in einem geschlossenen, dichten Behälter aufbewahrt werden, und zwar unter sauren Bedingungen, damit die Entwicklung von fäulniserregenden, alkalisch machenden und gasentwickelnden Keimen verhindert-wird, was darauf beruht, daß sich diese Keime unter sauren Bedingungen nicht entwickeln. Die Erzielung eines guten Silierens ist schwierig und mit zahlreichen Problemen verbunden. Das Hauptproblem ist die mögliche Bildung von Gärungsprodukten, die für die Tiere, an die das SiIofutter verfüttert wird, ja sogar für die Menschen, die das Fleisch dieser Tiere und die Milchprodukte verzehren, gesundheitsgefährlich sind.

Die Erforschung des Siliermechanismus ergab folgendes: Den im Siliermedium enthaltenen Milchsäurebakterien wird die Erzeugung von Milchsäure aus zur Verfügung stehenden, löslichen Zuckern ermöglicht, damit der pH des s'iliermediums auf einen Wert in der Nähe von 4 sinken kann. Es kommt jedoch relativ häufig ⁰^ vor, daß die zu silierenden Pflanzen nicht genügend vergärbare Zucker enthalten, daß die Vermehrung der

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einzelnen in dem Siliermedium enthaltenen Milchsäurebakterien unzureichend ist, daß der pH nicht schnell genug auf einen Wert von 4 herabsinkt/ daß sich Buttersäur ebakt er i en und anaerobe Bakterien entwickeln, durch c die die restlichen Zucker in Buttersäure, Essigsäure, Kohlendioxid und Wasserstoff umgewandelt werden, und daß die Proteine bis zur Stufe des Ammoniaks und anderer Metaboliten abgebaut werden.

Zur Beseitigung dieser Probleme sind verschiedene Lösungen vorgeschlagen worden. Es ist insbesondere bekannt, durch Zugabe verschiedener Säuren eine chemische Säuerung zu bewirken, jedoch sind diese Verfahren nicht ungefährlich. Es ist auch bekannt, durch Zugabe von in hohem Maße zur Spaltung von Kohlenhydraten befähigten Bakterien eine biologische Säuerung zu bewirken, jedoch ist die Verwirklichung der biologischen Säuerung mit Schwierigkeiten verbunden.

Es sind auch Verfahren bekannt, bei denen man in den Silo ein an Kohlenhydraten reiches Grundmaterial, z. B. Melasse, hineingibt, jedoch sind diese Verfahren kostspielig, und man erzielt damit keine gleichmäßigen Ergebnisse.

Aus der FR-PS 2 361 828 ist ein Verfahren zur Konservierung und Aufwertung von Grünpflanzen durch Milchsäure-Säuerung bekannt, bei dem zu den Pflanzen vor dem Silieren Bakterien hinzugegeben werden, die zum Hervorrufen der Milchsäuregärung befähigt sind, und bei dem auch ein Wirkzusatz für den Abbau von höheren Kohlenhydraten zu vergärbaren Zuckern, die von den Milchsäuregärung verursachenden Bakterien ausgenutzt werden können, hinzugegeben wird. Dieser ■ Abbau-Wirkzusatz besteht aus grampositiven Bakterien,

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die eine Fermentierung von Stärke, Glucose, Mannit, Rhamnose, Saccharose, Amygdalin und/oder Arabinose bewirken, jedoch zur Fermentierung von Maltose, Inosit oder Sorbit nicht befähigt sind. Diese Bakterien haben folgende Eigenschaften: VP +; Oxidase +; Catalase +; Nitrate +; Harnstoff -; Citrate -; Indol -; H₃S - . Der Abbau-Wirkzusatz kann auch ein Enzym oder mehrere Enzyme enthalten, die zum Spalten von Polysacchariden, insbesondere zum Spalten der Stärken, der Pentosane und anderer komplexer Polysaccharide in vergärbare Zucker, befähigt sind. Insbesondere kann nach der FR-PS 23 61 828 zu den zu silierenden Pflanzen ein hemicellulolytischer Komplex pilzlichen Ursprungs hinzugegeben werden, der als hauptsächliche Aktivität eine GaIactomannanase-Aktivität und sekundäre Aktivstoffe wie Xylanasen, Amylasen, Pectinasen und eine Amyläse zur Gewährleistung der Bildung der für die Erzeugung der Milchsäure durch die Bakterien notwendigen Maltose aufweist.

Das Verfahren der FR-PS 2 390 908 stellt gegenüber dem Verfahrender FR-PS 23 61 828 eine Verbesserung dar. Während bei dem Verfahren der FR-PS 23 61 828 als Amylase eine Exoamylase pilzlichen Ursprungs eingesetzt wird, durch die Stärke nicht vollständig abgebaut wird, handelt es sich bei der in dem Verfahren der FR-PS 23 90 908 eingesetzten Amylase um eine Amylase bakteriellen Ursprungs. Dieses Enzym (Endoamylase) wirkt auf die verflüssigten Stärken und erzeugt hauptsächlich oi -D-Maltose und etwas ab -D-Glucose. Diese Endoamylase wirkt in einem pH-Bereich zwischen 5 und 8. In der FR-PS 23 90 908 wird auch die Verwendung von Amyloglucosidase beschrieben, die gegenüber den Ketten der Amylose und des Amylopectins in bezug auf die Erzielung

^OJ von Ob -D-Glucose eine viel stärkere Wirkung entfaltet.

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— ΟΙ Die Enzymzusammensetzung gemäß der FR-PS 23 90 908 enthält auch einen hemicellulolytischen Komplex pilzlichen Ursprungs, der auf die Polysaccharid-Bestandteile der Zellmembranen und auf die Dextrine wirkt, und zwar in pH-Bereichen zwischen 5,5 und 2.

Aufgabe der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zum Silieren von Pflanzen, bei dem sowohl der Enzymkomplex als auch der Bakterienkomplex ver-10 bessert ist.

Diese Aufgabe wird durch das in Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren gelöst.

Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Enzymkomplex ist dadurch gekennzeichnet, daß er, gegebenenfalls unter zusätzlicher Verwendung, von an sich bekannten Enzymen, einen cellulolytischen Komplex oder eine Gellulase enthält, der oder die zur Spaltung der

ß-glykosidischen 1,3- und 1,4-Binrtuneen ^der Polysaccharide befähigt ist, die durch die bekannte Enzymzusammensetzung nicht angegriffen werden.

Bei dem im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten cellulolytischen Komplex handelt es sich um

einen cellulolytischen Komplex pilzlichen Ursprungs, on
^ου durch den die natürliche Cellulose und die anderen Polysaccharide, die in den Zellmembranen enthalten sind, abgebaut werden.

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-ιοί Dieses Enzym · wirkt in einem pH-Bereich zwischen 2 und 5. Hinsichtlich des Abbaus der pflanzlichen Strukturen besteht eine synergistische Zusammenwirkung zwischen dem cellulolytischen Komplex und dem hemicellulolytischen Komplex.

Wegen der Umgebung der Cellulose in der Pflanze werden für die Hydrolyse der Cellulose mehrere Enzyme oder ein einzelnes Enzym benötigt, die mehrere Funktionen erfüllen, die nachstehend angegeben werden:

- Hydrolyse der amorphen Zonen,

- Quellung der kristallinen Bereiche und Spaltung der Wasserstoffbindungen zwecks

15 Bildung von linearen Molekülen,

- Hydrolyse der Cellobiose zu Glucose,■

- Transglucos ylierung der Di- und Oligosaccharide sowie Spaltung der unregelmäßigen Bindungen der Cellulose und ihrer primären Hyärolyse-

20 produkte.

Der cellulolytische Komplex ist entsprechend den vorstehend angegebenen Kriterien nach einer großen Anzahl von Versuchen mit verschiedenen Pflanzen ausgewählt worden.

Eine Cellulase wird durch ihre Aktivität definiert, die in Internationalen Einheiten (IE) pro Gramm des Produkts ausgedrückt wird, wobei eine ie die Enzymmenge ist, durch die auf einem gegebenen Cellulosesubstrat pro Minute das Äquivalent von einem Mikromol Glucose in Form von reduzierendem Zucker freigesetzt wird.

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] Die Aktivitäten variieren in Abhängigkeit von

dem verwendeten Substrat:

- Wenn die Aktivität auf Papierpulver

5 · aus Whatman CC 31-Papier getestet wird/ erhält man die Aktivität C.;

- wenn die Aktivität auf Carboxymethylcellulose getestet wird, erhält man die Aktivität C .

Der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte

Komplex weist eine sehr hohe cellulolytische Aktivität auf und besitzt auch sekundäre Aktivitäten vom hemicellulolytischen Typ. Die starke cellulolytische Wirkung äußert sich in einer sehr starken Aktivität C|, einer sehr starken Aktivität C und einer Cellobiase-Aktivität (ß-Glucosidase-Aktivität).

Die Aktivität C- des Enzymkompiexes,'die gemäß hypothetischen Annahmen aus einer Aktivität C besteht,

Ji

zu der ein unbekannter Faktor hinzugetreten ist, äußert sich insbesondere in einer iösbarmachenden Wirkung auf die Cellulose.

C₁ ist zum Abbau der nativen Cellulose (kristalline Ceiiuiose mit einem Polymerisationsgrad von mehr als 3500 Giucoseeinheiten) in amorphe Cellulose befähigt.

Die Aktivität C des Enzymkomplexes äußert sich insbesondere in der reduzierenden Wirkung der Endo- und ExogiuGanasen. Diese Enzyme wirken hauptsächlich auf die Ceiiulosefasern in den Zonen mit schwacher Kristaliinität und zerlegen die langen Verkettungen

der Glucose in kleinere Einheiten. 35

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Die Aktivität der ß-Glucosidase äußert sich in einer Wirkung auf die nach der Wirkung des C erhaltenen Cellobiose-Einheiten.

Diese unterschiedlichen Aktivitäten können nicht getrennt betrachtet werden. In bezug auf den Abbau dieser Homopolymeren existiert ein synergistischer Mechanismus zwischen C₁ und C . Die enzymatischen Mechanismen der Aktivitäten C₁ und C führen zur Bildung von Cellobiose, die anschließend unter Bildung von zwei Glucoseeinheiten durch eine ß-Glucosidase hydrolysiert wird.

Die Hydrolysereaktionen der Cellulose sind anscheinend gemäß dem nachstehenden Schema aufgeteilt:

^C1
Native Cellulose ^ reaktive Cellulose

C (hydrolytisch) Reaktive Cellulose —— > . Cellobiose

/3-Giucosidase (hydrolytisch)

Cellobiose -^ 2 Moleküle Glucose

Der Komplex C₁ macht die kristalline Cellulose (Cellulose mit einem Polymerisationsgrad, der mehr als 3500 Glucosemonomoren entspricht) löslich und erzeugt

reaktive Cellulose (amorphe Cellulose)· 30

Unter der Wirkung des Enzymkomplexes C (Endo- und Exoglucanasen) werden die Ketten der reaktiven Cellulose zerteilt", und zwar entweder im Inneren der Kette und zufällig im Falle der Endoglucanasen oder "■" von den nicht reduzierenden Enden ausgehend im Falle der

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Exogiucanasen.

Diese Reaktionen führen insgesamt zur Bildung von Ceiiobiose-Einheiten. 5

Die Ceiiobiose-Einheiten werden durch eine /3-Glucosidase hydrolysiert, wodurch zwei Moleküle Glucose gebildet werden.

10 Im Falle der erfindungsgemäß eingesetzten PiIz-Ceilulasen ist der Enzymkomplex C₁ und C in der Lage, die native, unlösliche Cellulose unter Bildung von Glucose zu hydrolysieren.

Ϊ5 Die erfindungsgemäß eingesetzten Cellulasen

wurden nicht nur im Hinblick auf die vorstehend angegebenen, allgemeinen Kriterien ausgewählt. Ihre Auswahl wurde vielmehr auch unter Berücksichtigung des Siiiermediums getroffen, das in Abhängigkeit von dem

polysaccharolytischen Verhalten dieser Cellulasen besonderer Art ist.

Dieses poiysaccharolytische Verhalten wurde

auf zwei Typen von Substraten bestimmt: 25

a) auf reinen Substraten;

b) auf dehydratisierten Substraten.

Reine Substrate:

Man bestimmte die Aktivität der Cellulasen A₁- B, C, D, E und F auf verschiedenen Substraten bei einer gegebenen Konzentration in einem mit 0,1 m

Acetat gepufferten Medium.

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- IA -

Die Aktivität wurde gemäß den üblichen Vorschriften getestet, d. h. bei pH 4,8 und 50 ⁰C nach 20-minütiger Hydrolyse- Die reduzierende Wirkung wurde unter Anwendung des Hexacyanoferrat-Verfahrens bestimmt.

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Substrat ^Konzentration)	Whatman- Papier	Carboxymethyl cellulose	Pectin	Xylan	Arabino- galactan	Stärke	Johannis brot
^^^^^	1 %	1 %	0,25 %	0,25 %	0,10 %	0,25 %	0,25 %
Enzyme (Aktivität)	IE/g (C₁)	IE/g <^Cx>	IE/g	IE/g	IE/g	IE/g	IE/g
A	400	6444	356	511	22	394	544
B	211	5660	322	611	33	100	300
C	266	1999	411	311	0	244	389
D	52	6440	255	511	0	120	132
E	372	8500	305	605	0	0	0
F	960	7666	1030	1200	0	0	140

In -■ <■ .'ne Cubs Irate

Auch die Aktivität der Enzyme A, B, C, D, E und F auf verschiedenen dehydravisierten pflanzlichen- Substraten wurde bestimmt.

Die_:Aktivität wurde bei den pH-Werten 3,8; 4,8 und 5,8 und 30 ⁰C nach einer Hydrolyse von 24 h getestet. Die;-reduzierende Wirkung wurde unter Anwendung des Dinitrosalicyisäure-Verfahrens bestimmt.

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Getestete	pH	Luzerne	Englisches^ Mais	1560	Rüben-	Stroh
Substrate	3,8		RaigraS//	2080	püipe
	4,8			1690	bzw.
	5,8			1530	schnitzel
Getestete^^.	3,8			1670
Cellulasen	4,8			1940
	5,0.			1390
	3,8	2810		1530	1810	1560
A	4,8	2440		1170	1530	1690
	5,8	1560		1470	1500	1530
	3,8	1560		1390	1220	1390
B	4,8	1280		1530	1220	1500
	5,8	890		1111	890	1280
	3,8	1280		1250	1110	1110
C	4,8	1280		1278	1110	1290
	5,8	940		500	720	1110
	3,8	1390	Aktivität (IE/g)	1222	1278	1167
D	4,8	1190	2280	560	1111	1306
	5,8	890	2560	972	1223
	611	2220	556	694
E	972	1670	0	694
	0	2060	0	691
	1306	1680	694··	556
F	889	1530	610	444
	750	1750	550	333
1560
, 1440
2060
1720
1190
1528
1167
1306
972
1000

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- 18 -

Die Analyse dieser verschiedenen Verhaltensweisen erlaubte eine Bestimmung der Aktivität des bei der Silierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzenden cellulolytischen Komplexes:'

So wurde gefunden, daß die Cellulase oder der ceilulolytische Komplex, die beim erfindungsgemäßen Verfahren zu frischen Pflanzen für die Silierung hinzuzugeben sind, einer Aktivität C₁ von 50 bis 0,005 IE und einer Aktivität C von 500 bis 0,05 IE pro 100 g der Pflanzen entsprechen müssen, wobei diese Aktivitäten bei pH 4,8 und 50 ⁰C nach 20-minütiger Hydrolyse bestimmt werden.

Außerdem muß die ausgewählte Cellulase selbst nach einem langen Verweilen in dem Silo eine bedeutende Aktivität beibehalten.

Wie durch Versuche gezeigt wurde, muß der cellulolytische Komplex unter Bedingungen, die an die Bedingungen der Silierung angenähert sind, nach 10 Tagen mindestens 30 % seiner anfänglichen Aktivität beibehalten.

Konservierungszeit (Tage)	0	5	10 ·	15	20
pH 4,8	1OO %	97 %	61 %	26 %	3 %
pH 5,8	100 %	85 %	58 %	27 %	0 %

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Die Geschwindigkeit des enzymatischen Abbaus der pflanzlichen Struktur ist eine Funktion der Beseitigung der Glucose. Diese Verschiebung des enzymatischen Gleichgewichts wird durch Verwendung von Bakterien mit einem hohen Fermentiervermögen erzielt; die Säuerung des Mediums erfolgt sehr rasch. Wenn die pflanzliche Masse stabilisiert ist, werden die Vermehrung der Bakterien sowie die Bildung von Milchsäure angehalten, und zwar im Gegensatz zur cellulolytischen Aktivität der Cellulase, die mehr als 10 Tage länger andauert.

Diese Aktivität verursacht im Inneren des Gärfutters eine Erzeugung und Ansammlung von Glucose und erhöht dadurch den Nährwert der silierten Pflanzen.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Enzymkomplex enthält daher eine Cellulase oder einen cellulolytischen Komplex mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften, gegebenenfalls in Verbindung mit

20 den in der FR-PS 23 90 908 beschriebenen Enzymen,

d. h. mit einer Pilz-Amylase, einer Bakterien-Amylase, einer Amyloglucosidase und einem hemicellulolytischen Komplex.

Die in dem Enzymkomplex vorhandenen Enzyme haben demnach eine komplementäre Wirkung hinsichtlich ihrer Aktivität gegenüber den Kohlenhydraten, von den komplizierteren bis den einfacheren, und zwar in pH-BereJ-chen, die zwischen den Werten 7 und 2 liegen können.

Die maximalen Werte der Aktivität für jedes Enzym wechseln sich ab entsprechend der Herabsetzung des pH-Wertes, der in dem Silo nicht unter 3,5 herabsinkt, und in den von 10 bis 30 ⁰C variierenden Temperaturintervallen, die mit den Bedingungen des Silos verträg-

³⁵ lieh sind.

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Der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Bakterienkomplex ist gekennzeichnet durch die Verwendung neuer, für die Silierung von Pflanzen geeigneter Bakterienstämme, die für sich oder im Gemisch mit den Bakterienstämmen und/oder den Enzymen eingesetzt werden können, die nach dem Stand der Technik bekannt und erfindungsgemäß beschrieben worden sind. Der neue Bakterienkomplex führt zu in hohem Maße verbesserten Ergebnissen der Silierung. Bei dem im erfindungsgemäßen Verfahren und in dem erfindungsgemäßen Mittel eingesetzten, neuen Bakterienstämmen handelt es sich um gramnegative Bakterien, die zur Familie der Enterobacteriaceae/ Gattung Erwinia oder Pectobacterium, Gruppe Herbicola, gehören und als Enterobacter agglomerans bezeichnet werden (Klassifizierung gemäß Bergey, Manual of Bacteriology, 8. Auflage). Der Stamm Enterobacter agglomerans ist unter der Register Nr. 1-114 im Institut Pasteur, Paris, am 11. Februar 1980 hinterlegt

worden. 20

In Tabelle I werden die Eigenschaften dieser Bakterien aufgeführt:

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Tabelle I Enterobacter agglomerans

Gram - Arabinose +

Verwendung von Malonat + Maltose Glucose + Trehalose +

Phenylalanin-

desaminase - Xylose

_in ONPG (/5-Galacto-

^IU sidase) + Stärke +

Indol - Oxidase

H₂S - Gelatine +

LDC (Lysindecarboxylase) - Amygdalin +

ODC - Melibiose

Urease - VP (Vöges- +

Proskauer)

Saccharose + Rhamnose

Arginindihydrolase Salicin
Adonit
Inosit
Sorbit

Der Einsatz dieser für sich oder in Verbindung

mit anderen Bakterienstämmen und/oder mit Enzymen verwendeten, neuen Bakterienstämme zum Silieren von Pflanzen erfolgt in der nach dem Stand der Technik bekannten Art und Weise. Die Bakterien können auf einem Getreidemehle enthaltenden Nährsubstrat gezüchtet werden, ^er erfindungsgemäß in das Silo einzuführende Bakterienkomplex enthält eine Mischung der benötigten Bakterien, die auf einem löslichen oder nichtlöslichen Träger aufge-λγ bracht sind, gegebenenfalls zusammen mit dem erfindungsgemäß empfohlenen Enzymkomplex.

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Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Enzyme und die Bakterien auf einen Träger auf Getreidebasis (Weizen, Gerste, gekeimte Gerste) aufgebracht, der vorzugsweise in fein gemahlener

5 bzw. fein zerriebener Form eingesetzt wird.

Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Bakterien und die Enzyme auf einen Träger vom Typ der vorgelierten Stärke, der Maltohexose usw. aufgebracht, d. h. auf einen Träger, der in kaltem Wasser leicht löslich ist.

Die Stärke und die anderen in den Trägern enthaltenen Polysaccharide kommen zu den Kohlenhydraten

'5 der Pflanzen hinzu und erhöhen so den Nährwert des Gärfutters. Das erfindungsgemäße Mittel aus der Mischung der auf einem Träger befindlichen Bakterien und dem Enzymkoiuplex, der auf einem Träger, .auf Getreidebasis aufgebracht ist oder nicht, kann jeden dieser

^ Bestandteile in verschiedenen Anteilen enthalten.

Die trockene Mischung bzw. das trockene Mittel enthält pro Gramm eine Kokkenmenge in der Größenordnung von 1OOOOO bis zu einer Million und eine Bazillenmenge

in einer Größenordnung von 100000 bis zu einer Million. 25

Die Mengen der Cellulase, des hemicellulolytischen Komplexes, der Amylase und der Amyloglucosidase können variabel sein; sie werden in Abhängigkeit von der Art des zu behandelnden Futters berechnet.

Die Menge der Cellulase, die zu den frischen, zu silierenden Pflanzen hinzuzufügen ist, muß einer Aktivität C. von 50 bis 0,005 IE pro 100 g Pflanzen entsprechen. Die Cellulase muß daher in einer Menge von 2 bis 2 χ 10 o/oo, bezogen auf das.Gewicht der frischen Pflanzen, eingesetzt werden, wenn die Ceilulase einen Titer bzw. einen Gehalt von 250 IE/g

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hat. Die anderen Enzyme werden in den folgenden Mengen eingesetzt:

Bakterien-Amylasen mit einem Gehalt von 250 Einheiten/g in einer Menge von 0,05 bis 0,20 o/oo, auf das Gewicht der Pflanzen bezogen,

Pilz-Amylasen mit einem Gehalt von 50000 PS 50-Einheiten/ g in einer Menge von 0,10 bis 0,20 o/oo, auf das Gewicht der Pflanzen bezogen,

Amylogiucosidase mit einem Gehalt von 200 AG-Einheiten/ g in einer Menge von 0,10 bis 0,70 o/oo, auf das Gewicht der Pflanzen bezogen, und ein 15

hemicellulolytischer Komplex mit einem Gehalt von 35000 lE/g in einer Menge von 0,05 bis 0,20 o/oo, auf das Gewicht der Pflanzen bezogen.

^" Wenn die Enzyme gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auf einen Träger auf Getreidebasis aufgebracht werden, kann das in das Silo bzw. zum Silieren einzumischende, erfindungsgemäße Mittel etwa 1 kg Enzyme pro kg Träger enthaltem. Im Falle eines

^° löslichen Trägers ändert sich das Konzentrationsverhältnis von Enzym und Träger; es kann zwischen 1/1,5 und 1/4 variieren.

Durch das Einmischen von Celiulase in den Träger

wird die Menge der zur Verfügung stehenden, vergärbaren Zucker erhöht, wodurch eine stärkere und schnellere Bildung von Milchsäure hervorgerufen wird. Auf diese Weise wird das pflanzliehe Protein besser konserviert. Andererseits wird der Nährwert des Mediums dadurch nur

35 , .._ ·
erhöht.

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Zur Veranschaulichun<: der Vorteile beim Einsatz eines ceiluiolytischen Komplexes und von Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae wurden Versuche in Mikrosiios und Minisilos durchgeführt.·Die verschiedenen Konservierungsparameter sowie die Parameter, durch die die pflanzliche Struktur verändert wird, wurden untersucht.

1 - In Hikrosilos durchgeführte Versuche 10

Eine ernte Reihe von Versuchen wurde im Labor in Mikrosiios durchgeführt, und zwar im Mai unter Verwendung von Luzerne. Die Mikrosiios hatten ein Fassungsvermögen von 1 kg. Die Luzerne wurde fein zerhackt und dann entsprechend der nachstehenden VersuchsvorschrJft siliert:

Λ- Eine Reihe von Mikrosiios wurde unter Verwendung des Konservierungs-Zusatzstoffes mit'der nachstehenden allgemeinen Zusammensetzung behandelt:

Träger auf Getreidebasis: 90 % Vormischung: 10 %

25 Die Vormischung bestand aus:

- einem Bakterienkomplex (5 -Milchsäurebakterxen auf Lactose ais Träger);

- einem Enzyrakoir.plex mit folgenden Bestandteilen:

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. einer Amylase pilzlichen Ursprungs; . einer Amyiase bakteriellen Ursprungs; . einer Amyloglucosidase und . einem hemicellulolytischen Komplex pilzlichenUrsprungs mit einer galacto-

mannanasischen bzw. Galactomannanase-Aktivität als Hauptaktivität und

- einem energiereichen Träger (fein gemahlene TO Gerste + Lactoserum)

wobei derRakterienkomplex und der Enzymkomplex

jeweils in einer Menge von 1 % in die Zusammensetzung der Vormischung eingingen. 15

Der Konservierungs-Zusatzstoff wurde in einem Anteil von 2 % zu der Luzerne hinzugegeben, was einer Einmischung der Vormischung in einer Menge von 0,2 % entspricht, und auch 1 % Gerste wurde zu der Luzerne 20 hinzugegeben.

B- Eine Reihe von Mikrosilos wurde mit dem gleichen Konservierungs-Zusatzstoff wie bei A behandelt, wobei jedoch eine Celluiase pilzlichen Ursprungs, die von 25 Trichoderma viride herrührte, dazu hinzugegeben wurde. Diese Celiulase hatte eine Aktivität C₁ von 250 Einheiten/g und eine Aktivität C von 2500 Einheiten/g. (Diese Aktivitäten waren bei pH 4,8 und 50 ⁰C bei einer Reaktionszeit von 20 min bestimmt worden). Diese

30 Celluiase wurde in einer Menge von 2 g/t, d. h. in einer

-4
Menge von 2 χ 10 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht

der frischen Pflanzen (Versuch B), bzw. in einer Menge von 200 g/t (d. h. von 0,02 %), bezogen auf das Gewicht

der frischen Pflanzen, (Versuch B¹) eingemischt. 35

030035/0707 bad original

C- Veraieichs-Mikrosilos:

Zum Vergleich wurde eine Reihe von Mikrosiios mit Luzerne herangezogen, die keinen Konservierungs-Zusatzstoff enthielten: T=O.

Nach 100-tägigem Silieren wurden die Mikrosilos geöffnet. Folgende Parameter wurden bestimmt: pH, Milchsäuregehalt und KL— /N _t · Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle gezeigt:

	pH	Milchsäure (g/kg Trockenmaterial)	N„„ /N . NH₃ gesamt
Vergleichs- Mikrosilos: T = O	5,66	26	25,15 %
Luzerne + 0,2 % der Vor mischung (A)	4,13	143,68	16,33 %
Luzerne +0,2 % der Vormischung + 2 g/t Cellu- iase pilzlichen Ursprungs (B)	4,32	144,75	16,20 %
Luzerne + 0,2 % der Vormischung + 200 g/t Ceilul pilziichen Urspn (B¹)	äse jngsj [T, 73	169,47	15,02 %

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BAD ORIGINAL

Man stellt fest, daß die Zugabe einer Cellulase zu dem Bakterien- und Enzymkomplex gemäß der FR-PS 23 90 908 zu einer Verbesserung der Gebrauchsleistung des Konservierungs-Zusatzstoffes führt. Man erzielt eine bessere Konservierung der Pflanzen, die sich beim Vergleich von A und B¹ in folgendem äußert:

in einer Verminderung des pH-Wertes von 4,13 auf

3,73 (Verminderung um 10 %);
10

in einem Anstieg der Erzeugung von Milchsäure um 15 % und

in einer relativen Verminderung des Verhältnisses

^IJ N-_T„ /N . um 8 %, was zu einer besseren Konservie-NH^ gesamt

rung des pflanzlichen Proteins führt und auf eine schnelle Säuerung des Siliermediums zurückzuführen ist.

2- In Minisilos durchgeführte Versuche

Diese Versuche wurden im Juni unter Verwendung von Luzerne in Minisilos mit einer» Fassungsvermögen

von 150 kg durchgeführt.
25

Die Luzerne wurde fein zerhackt und dann einer Siiierung entsprechend der nachstehenden Versuchsvorschrift unterzogen.

A - Eine Reihe von Minisilos wurde unter Verwendung

des gleichen Konservierungs-Zusatzstoffes·wie bei den Mikrosilos (unter Punkt A) behandelt, wobei die Vormischung in einer Menge von 0,2 % eingemischt wurde.

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B- Eine Reihe von Minisilos wurde unter Verwendung der bei A angegebenen Zusammensetzung und Dosismenge behandelt, wozu die gleiche Cellulase pilzlichen Ursprungs in einer Menge von 2 g/t hinzugegeben wurde.

Nach 100-tägigem Silieren wurden die Minisilos geöffnet. Die Analyse des Gärfutters führte zu folgenden Ergebnissen:

	A Silos mit 0,2 % Vor mischung	B Silos mit 0,2 % Vor mischung + Cellulase (2 g/t)
Trockenmaterial (TM; %)	23,67	27,27
E.N.A. (g/kg TM)	51,25	48,97
PH	4,20	3,94
Milchsäure (g/kg TM	) 80,62 I	114,40
Essigsäure (g/kg TM	) 17,42	20,04
V/Vsamt <*>	18,40	13,31
Vamt ^(g/Kg ^m)	21,70	23,12
^NNH ^{(g/kg 1M)}	3,87	3,09

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1 Aus den vorstehenden Ergebnissen geht der

Vorteil der Zugabe einer Cellulase zu dem aus der FR-PS 23 90 908 bekannten Bakterien- und Enzymkomplex deutlich hervor.

Die Zugabe der Cellulase führt zu folgenden Ergebnissen:

zu einem geringeren pH-Wert (3,94 gegenüber 4,20, d. h. eine Verminderung um 6 %);

zu einer bedeutenderen Menge an Milchsäure (Zunahme um 41,9 %) und

zu einer viel besseren Konservierung des Proteinanteils des Gärfutters, was durch die Analyse bestätigt wird. In diesem Fall erhält man folgende Ergebnisse:

ein geringeres N /N -Verhältnis (relative Verminderung um 27,6 %),

einen um 6 % erhöhten Proteingehalt und

einen um 20,1 % verminderten Gehalt an ammoniakalischem Stickstoff.

Diese größere Säuerungsgeschwindigkeit kann dadurch erklärt v/erden, daß die Bakterien schneller über eine on bedeutende Menge an leicht in Milchsäure umwandelbaren, vergärbaren Zuckern verfügen können. In dieser Verfügbarkeit von vergärbaren Zuckern findet' man die Wirkung der in das Siliermedium eingeführten Cellulase wieder.

030035/0707 .· ^B^0 ORiGfNAL

In den nachstehenden Beispielen besteht die Mischung auf dem Träger entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren aus dem in der FR-PS 23 61 828 und/ oder der FR-PS 23 90 908 beschriebenen Komplex, dem in der Erfindung beschriebenen Enzymkomplex, zu dem gramnegative Bazillen aus der Familie der Enterobacteriaceae, Gattung Erwinia oder Pectobacterium, Gruppe Herbicola, in einer Menge hinzugefügt werden, die einer Einmischung von 10 bis 10 Bazillen/g in die Mischung entspricht.

Beispiele

In Silos mit einem Fassungsvermögen von 4 m³ wurden mit im Juni zu Beginn der Ährenbildung geerntetem Knäuelgras "Lucifer" Versuche durchgeführt. Die fein gehackten Futterpflanzen wurden unter vier Bedingungen eingelagert:

20 A: Siiierung ohne Behandlung

B: Durchführung der Silierung mit 4 1 Ameisensäure/t in bekannter Weise

C: Durchführung der Silierung mit der Vormischung, deren Zusammensetzung in den FR-P₁SS 23 61 828 und 23 90 908 angegeben wird,

wobei zu dem zu -silierenden Futter 7 kg der Kultur von sieben Bakterien auf einem Träger hinzugegeben wurden, deren Eigenschaften in der FR-PS 23 61 828, Seite 7, Nrn. 1 bis 7, angegeben werden, und wobei Enzyme in einer Menge von 10 kg/t eingemischt wurden.

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• D: Durchführung der Silierung mit der Vormischung gemäß C unter Zugabe von Bazillen gemäß der Erfindung, d. h. von gramnegativen Bakterien aus der Familie der Enterobacteriäceae,

5 Gattung Erwinia oder Pectobacterium, Gruppe

Herbicola, die mit Entercbacter agglomerans bezeichnet werden. Die Einmischung des Komplexes erfolgte in einer Menge von 10 kg/t.

10 Nach 90 bis 100 Tagen wurden die verschiedenen

Silos geöffnet, und die silierten Pflanzen (Gärfutter) wurden analysiert. Man erhielt die nachstehend (in Tabelle II) aufgeführten Ergebnisse.

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Tabelle II

Parameter	ph \	^NNH	^Nlöslich .„.	Organische	Milch säure	Propion säure	Säuren (g/kg TM)	Butter säure
Behandiungs X. weisen n.	5,28		N gesamt :		23	1 ,38		Spuren
A: nicht behandelt	4,05	¹ gesamt	63,80	41 ,36	Spuren	Essig säure	0
B: Behandlung mit Ameisensäure (0,4 %)	4,02	17,76	45,43	90	0	29,46	0
C: Behandlung gemäß der FR-PS 23 90 908	3,70	7,10	48,10	112	0	14,95	0
D: Erfindungs gemäße Be handlung (C + erfin dungsgemäße Bakterien- · stamme)	14	44	14,20
	8	18,28

1 Aufgrund der vorstehenden Ergebnisse kann festgestellt werden, daß die Mischung gemäß den FR-PSS
23 61 828 und 23 90 908 schon zu einer Verbesserung bei
der Konservierung des Gärfutters führt, wobei sich die

Verbesserung in folgendem äußert:

- in einer Verminderung des pH-Wertes von 5,28 auf 4,o2,

- in einer Erhöhung des Gehalts an Milchsäure von 23 auf 90 g/kg Trockenmaterial und

- in einem besseren Schutz des Proteins, der sich aus einer Verminderung des Verhältnisses N„_TT /N . von 17,76 auf

NH₃ gesamt

14 % und aus einer Verminderung des Verhältnisses ^_löalLch^_geaamt von 63,80

auf 48,10 % ergibt.

Diese Mischung hat den Vorteil, daß weder Propion-20 säure noch Buttersäure gebildet wird.

Das erfindungsgemäße Mittel führt zu einer weiteren Verbesserung, die sich in folgendem äußert:

- in einer Verringerung des pH-Wertes von 4,02 auf 3,70,

- in einer Erhöhung des Gehaüts an Milchsäure von 90 auf 112 g/kg Trockenmaterial und

- in einem verbesserten Schutz des Proteins, der sich aus einer Verminderung des Verhältnisses N_NH /N . von 14 auf 8 % und

aus einer Verminderung des Verhältnisses

N₁.. -, . ./N , von 48,10 auf 44 % ergibt, löslich gesamt ' ^

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Auch diese Mischung, d. h. das erfindungsgemäße Mittel, hat den Vorteil, daß weder Propionsäure noch Buttersäure durch Vergärung gebildet wird.

Die Verdaubarkeit und die Aufnahme der Gärfutterbereitungen wurden bei Schafen gemessen. Nach Verabreichung der verschieden behandelten Gärfutterbereitungen fand man folgende Ergebnisse:

Β: Behandlung mit Ameisensäure: 0,64 UF/kg C: Behandlung entsprechend den FR-PSS

23 61 828 und 23 90 908: 0,74 UF/kg D: Erfindungsgemäße Behandlung: 0,82 ÜF/kg.

Wie aus Tabelle. III ersichtlich ist, führt die Stickstoffbilanz bei im Wachstum befindlichen Tieren zu Ergebnissen, aus denen der Vorteil der Verabreichung von Gärfuttern, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden sind, hervorgeht.

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Tabelle III

Parameter	Verfütter ter N	N im Kot	3,76	N im	Harn	Zurückbe haltener N	.0,50
Behandlungs-\ weisen \	(g/Tag)	(g/Tac)/Anteil 7 (θ)*	38,8	(g/Tag)	Anteil (%)*	(c!/TagJ/ Anteil /(S)*	5,88
A: nicht behan delt	21	7,90	41,6	13	61,9	0,10	10,5
B: Behandlung mit Ameisen säure (0,4 %)	18,9	7,34	38,8	10,4	55	1,1	14,5
C: Behandlung ent sprechend den FR-rPSS 23 61 828 und 23 90 908	■ 17	7,07	8,12	47,7	1,8
D: Erfindungs gemäße Behand lung	16,5	5,4	7,70	47	2,40

* auf den verfütterten N bezogen

Im Falle des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt die zurückbehaltene Stickstoffmenge mehr als das Doppelte der Stickstoffmenge, die nach der Behandlung des Silofutters mit Ameisensäure zurückbehalten wird.

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1 'Zusammenfassung:

Verfahren zur Konservierung von Grün pflanzen durch Milchsäure-Säuerung, bei dem zu den Grünpflanzen vor dem Silieren eine Wirkzusatz für den Abbau von höheren Kohlenhydraten zu vergärbaren Kohlenhydraten, die von den Milchsäuregärung hervorrufenden Bakterien ausgenutzt werden können, hinzugegeben wird, der aus einem Enzymkomplex und/ oder einem Bakterienkomplex besteht.

Der Enzymkomplex enthält einen cellulolytischen Komplex pilzlichen Ursprungs, der gegebenenfalls zusammen mit bekannten Enzymkompiexen eingesetzt wird. Der Bakterienkomplex enthält gramnegative Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae, die gegebenenfalls mit bekannten Bakterien, insbesondere mit grampositiven Bakterien, die eine Fermentierung von Stärke bewirken, jedoch nicht zur Fermentierung von Maitose befähigt sind, eingesetzt werden.

Dieses Mittel auf Basis von Enzymen und/oder Bakterien, auf einem Träger auf Getreidebasis aufgebracht, führt im Fall von Pflanzen, die arm an Kohlenhydraten sind, zu besonders vorteilhaften Ergebnissen. 25

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Claims

DE 0215/Dossier 2106a2/2106a3 DRST.U/ DPICV/JO/NG/3-164 Patentansprüche

1. Verfahren zur Konservierung und Aufwertung von Grünpflanzen durch Milchsäure-Säuerung, bei dem zu den Grünpflanzen vor dem Silieren ein Wirkzusatz für den Abbau von höheren Kohlenhydraten zu vergärbaren Kohlenhydraten, die von den Milchsäuregärung verursachenden Bakterien ausgenutzt werden können, hinzugegeben wird, der aus einem Enzymkomplex und/oder einem Bakterienkomplex besteht, dadurch gekennzeichnet, daß der Enzymkomplex, gegebenenfalls in Verbindung mit einer PiIz-Amylase, einer Bakterien-Amylase, einer Amyloglucosidase und/oder einem hemicellulolytischen Komplex pilzlichen Ursprungs, der als hauptsächliche Aktivität eine Galactomannanase-Aktivität aufweist, eine Cellulase oder einen cellulolytischen Komplex pilzliqhen Ursprungs enthält, wobei der cellulolytische Komplex pilzlichen Ursprungs dazu befähigt ist, die native Cellulose zu Glucose abzubauen, eine Aktivität C^ von 50· bis 0,005

IE

und eine Aktivität C von 500 bis 0,05 j_E pro

100 g der frischen bzw. Grünpflanzen hat und unter den Silierbedingungen mindestens 30 % dieser Aktivität nach Ablauf von 10 Tagen beibehält, und daß der Bakterien- * "' komplex gramnegative Bakterien enthält, die zur Familie der Enterobacteriaceae, Gattung Erwinia oder Pectobacterium, Gruppe Herbicola, gehören, mit Enterobacter agglomerans*bezeichnet werden und eine Fermentierung von Stärke bewirken, jedoch zur Fermentierung von Maltose nicht befähigt sind.
*Hinterlegungs-Details siehe Seite 20

&WO35/Q707

Deutsche Bank (München) Kto. 51/61070

Dresdner Bank (München) Kto. 3939844

Postscheck (München) Kto. 670-43-804

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bakterien aus der Familie der Enterobacteriacea'e zusammen mit bekannten Bakterien einsetzt, die zum Abbau der höheren Kohlenhydrate zu ver-

5 gärbaren Kohlenhydraten befähigt sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae zusammen mit grampositiven Bakterien einsetzt, die eine Vergärung von Stärke, Glucose, Mannit, Rhamnose, Saccharose, Amygdalin und/ oder Arabinose bewirken, jedoch nicht zur Fermentierung von Maltose, Inosit oder Sorbit befähigt sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Enzymkomplex aus

-4
2 χ 10 bis 2 o/oo Cellulase mit einem Gehalt

20 von 250 IE der Aktivität C₁Zg,

0,05 bis 0,20 o/oo Bakterien-Amylase mit einem Gehalt von 250 Einheiten/g,

0,10 bis 0,20 o/oo Pilz-Amylase mit einem Gehalt von 5000 PS 50-Einheiten/g,

0,10 bis 0,70 o/oo Amyloglucosidase mit einem Gehalt von 200 AG-Einheiten/g und 30

0,05 bis 0,20 o/oo hemicellulolytischem Komplex mit einem Gehalt von 35000 IE/g

• *

besteht, wobei sich die Angaben in o/oo auf das Gewicht der silierten Pflanzen beziehen.

Ü3003$/Q707

'

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch

gekennzeichnet, daß man die Enzyme auf einem Träger auf Getreidebasis in einer Menge von etwa 1 kg Enzyme pro 9 kg Träger einmischt.
5

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien auf einem Getreidemehle enthaltenden Träger gezüchtet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien und die Enzyme auf einem aus Getreidestärke, vorgelierter Stärke und Maltohexose ausgewählten, in kaltem Wasser löslichen Träger in einer Menge von 1 kg Bakterien und Enzymen

15 pro 1,5 bis 4 kg Träger eingemischt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Mengen an Enzymen und Bakterienkultur mit deren Träger im trockenen Zustand,

20 die pro t der zu silierenden Pflanzen hinzugefügt

werden, 10 bis 15 kg betragen und daß dieser Zusatzstoff 10 bis 10 lebende Keime pro g enthält.

9. Mittel zur Konservierung und Aufwertung von Grünpflanzen, enthaltend Milchsäure erzeugende Bakterienstämme und einen Wirkzusatz für den Abbau von höheren Kohlenhydraten zu vergärbaren Kohlenhydraten, der aus einem Enzymkomplex und/oder einem Bakterienkomplex besteht, dadurch gekennzeichnet, daß der Enzymkomplex, gegebenenfalls in Verbindung mit einer Pilz-Amylase, einer Bakterien-Amyläse, einer Amyloglucosidase und/oder einem hemicellulolytischen Komplex pilzlichen Ursprung's, der als hauptsächliche Aktivität eine Galactomannanase-Aktivität aufweist, eine

35 Cellulase oder einen cellulolytischen Komplex pilzlichen. Ursprungs enthält, wobei der cellulolytische

03003 6/07

Komplex pilzlichen Ursprungs dazu befähigt ist, die native Cellulose zu Glucose abzubauen, eine Aktivität C von 50 bis 0,005 IE und eine Aktivität C von

1 ^x

bis 0,05 IE pro 100 g der. frischen bzw. Grünpflanzen hat und unter den Silierbedingungen mindestens 30 % dieser Aktivität nach Ablauf von 10 Tagen beibehält, und daß der Bakterienkomplex gramnegative Bakterien enthält, die zur Familie der Enterobacteriaceae, Gattung Erwinia oder Pectobacterium, Gruppe Herbicola, gehören, mit Enterobacter agglomerans bezeichnet werden und eine Fermentierung von Stärke bewirken, jedoch zur Fermentierung von Maltose nicht befähigt sind.

10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die gramnegativen Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae in Verbindung mit Bakterien enthalten sind, die dazu befähigt·sind,die höheren Kohlenhydrate zu vergärbaren Zuckern abzubauen, ins-

^zu besondere in Verbindung mit grampositiven Bakterien, die eine Fermentierung von Stärke, Glucose, Mannit, Ehamnose, Saccharose, Amygdalin und/oder Arabinose bewirken, jedoch zur Fermentierung von Maltose, Inosit

oder Sorbit nicht befähigt sind. 25

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BAD ORSGiNAL