CA1127101A - Procede et produit pour la conservation de vegetaux en vert et de sous-produits humides des industries agro-alimentaires - Google Patents

Abstract

Procédé pour la conservation des végétaux en vert par acidification lactique qui comprend l'adjonction à ces végétaux avant l'ensilage d'un facteur de dégradation des glucides supérieurs en glucides fermentescibles utilisables par les bactéries produisant la fermentation lactique. Ce facteur est constitué par un complexe enzymatique et/ou un complexe bactérien. Le complexe enzymatique comprend un complexe cellulolytique d'origine fongique associé ou non aux complexes enzymatiques connus dans l'art antérieur. Le complexe bactérien comprend des bactéries gram de la famille des Enterobacteriaceae associées ou non aux bactéries connues dans l'art antérieur et en particulier aux bactéries gram + qui fermentent l'amidon mais ne fermentent pas le maltose. Cette composition à base d'enzymes et/ou de bactéries, disposées sur support de céréales donne des résultats particulièrement interessants dans le cas des végétaux pauvres en glucides.

Description

Llinvention concerne un procédé améLioré pour la conserva-tion et la valorisation de véyétaux fr~is, afin de permettre leur consommation sous une forme appétente au fur et à mesure des besoins, ultérieurement à leur date de récolte, elle concerne également une composition pour la réalisation du procédé.
Etant donné l'importance du problème posé par la conservation des végétaux en vert7 de nombreux travaux de recherche ont été
consacrés à la réalisation de cette technique qui présente un certain nombre de difficultés.
L'ensilage repose sur le principe de la conservation de végétaux frais, pendant une période plus ou moins longue, dans une enceinte close et étanche, en ~ilieu acide, dans le but d'empêcher le développement des c~ermes putréEiants alcalinisants et gazogènes, ces germes ne se développant pas en milleu acide.
La réalisation d'un bon ensilage est difficile et elle se heurte à de nombreux obstacles, les principaux étant la formation de produits de fermentation c1angereux pour la santé des animaux, voire des humains qui consomment la viande et les produits laitiers.
I,e mécanisrne recherché est le suivant: permettre aux bactéries lactiques contenues dans le milieu de produire de l'acide lactique à partir de sucres solubles disponibles, de telles sorte que le milieu puisse descendre à un pH voisin de 4.
Mais il arrive bien souvent que les végétaux à ensiler ne conte-nant pas suffisamment de sucres ermentescibles, la proliféra-tion des seules bactéries lactiques contenues dans le milieu est insuffisante, le pH ne descend pas assez rapidement à 4, et les bactéries but~riques et anaérobi~ues se développent, transformant les sucres résiduels en acides butyrique et acétique, en gaz carbonique et en h~drogène; les protéines sont dégradées au stade d'ammoniaque et d'autres métabolites.

~79Lq~L

Diverses solutions ont eté apportées à ces inconvénients.
En particulier, iI est colinu d'effe~tuer une acidiEication chi-mique par addition d'acides divers. ~lais ces procédés ne sont pas sans danger. Il est également connu d'effectuer une acidi-fication biologique par addition de bactéries très ylucidolytiques.
Mais cette acidiEication biologiqu~ est difficile dans sa réalisation.
On a décrit également des procédés dans lesquels on ajoute dans le silo une matière première riche en glucides, par exemple des mélasses. Les résultats obtenus sont irréguliers et le procédé couteux.
Dans le brevet francais 2.361.~2~, il est décrit un procédé
de conservation et valorisation de végétaux en vert par acidiEi-cation lactique, qui comprend lladjonction à ces végétaux, avant l'ensilage, de bactéries capables de provoquer la fermentation lactique, ainsi que l'addition d'un facteur de dégradation de glucides supérieurs en sucres fermentescibles1 utilisables par les bactéries produisant la fermentation lactique. Ce facteur de dégradation est constitué par des bactéries gram -~ qui fermentent l'amidon, le glucose, le mannitol, le rahmnose, le saccharose, l'amygdaline, l'arabinose et ne fermentent pas le maltose, l'inositol le sorbitol; ces bactéries sont VP ~ ;

-oxydase ~ ; catalase ~ ; nitrates ~ ;urée - ; citrates - ;
indole - ; ~2S - . Ce facteur de dégradation peut éyalement compEendre une ou plusieurs en~ymes susceptibles de scinder des polysaccharides, notamment les amidons, les pentosanes et autres polysaccharides complexes en sucres fermentescibles. En parti-culier, selon ce brevet on peut ajouter au fourrage un complexe hemicellulolytique d'origine fongique possédant comme activite principale une activité galactomannanasique et des ~ctivités secondaires comme étant des xylanases, amylases, pectinases et 1~2~

une amylase pour assurer la formation de maltose nécessaire à la production de l'acide lacti~ue par les bactéries.
Le brevet français 2.390.908 constitue un perfectionnement au brevet 2.361.~28. Tandis ~ue l'amylase utilisée dans le brevet français 2.361.82~ est une exoamylase d'orlgine fongique qui ne dégrade pas totalement l'amidon, l'amylase utilisée dans le brevet

2.390.90~ est une amylase d'origine bactérienne~ Cette enzyme (endoamylase) agit sur les amidons liquéfiés et produit princi-palement de l'~-D maltose, et un peu d~ glucose, et agit dans un domaine de pH compris entre 5 et 8. Le brevet français 2.390.908 décrit également l'utilisation d'amyloglucosidase, qui a une action beaucoup plus poussée vis à vis des chalnes d'amylose et d'amylopectine pour l'obtention d'~-D glucose. La composition enzymatique selon ce brevet comprend également un complexe hemi-cellulolytique d'origine fonyique qui ayit sur les constituarlts polysacchariques des membranes cellulaires et les dextrines, dans des zones de pH compris entre 5,5 et 2.
La présente invention a pour objet un procédé et une compo-sition améliorés pour l'ensilage des végétaux, l'amélioration 2~ portant à la fois sur la composition enzymatique, et sur la composition bactérienne. L,a composition enzymatique est caractérisée en ce qu'elle contient, en plus des enzymes précédemment utilisées, un complexe cellulolytique ou cellulase capable de scinder les liaisons béta (1-~3) et (1-~4) des poly~
saccharides non attaquées par la composition enzymatique précédente.
Il s'agit d'un complexe cellulolytique d'origille ~ongique qui dégrade la cellulose naturelle et les autres polysaccharides contenus dans les membranes cellulaires~
Cette enzyme agit dans une zone de pH comprise entre 2 et 5.
Il existe un phénomène de synergie entre le complexe cel:Lulolytique `et le complexe hemicellulolytique pour dégrader les structures végétales.
Du fait de l'environnement de la cellulose dans le végétal, son hydrolyse nécessite plusieurs enzymes ou une seule remplissant plusieurs fonctions qui sont:
- l'hydrolyse des zones amorphes, - le gonflement des réglons cristallines et la rupture des liaisons hydrogènes pour donner des molécules lineaires, - l'hydrolyse de la cellobiose en glucose, la transglucosylation des di et oligosaccharides ainsi que la rupture des liaisons irrégulières de ].a cellulose et de ses produits primaires d'hydrolyse.
Le complexe cellulolytique a été choisi en fonction des critères ci-dessus et après un grand nornbre d'essais sur divers végétaux.
Une cellulase est définie par son activité exprimée en unités internationales par yramme de produit, une unité internationale (U.I.) étant la quantité d'enzyme qui libère en sucre réducteur l'équivalent d'une micromole de glucose par minute, sur un sub-strat cellulosique donné.
Les activités varient en fonction du subtrant utilisé:- si on teste l'activité sur de la poudre de papier Whatman CC 31 on obtient l'activité Cl;
- si on teste l'activité sur de la carboxyméthylcellulose on obtient l'activité Cx.
Le complexe utilisé selon l'invention possède une très haute activité cellulolytique ainsi que des activités secondaires du type hemicelluloly-tique. Le haut pouvoir cel].ulolytique se tra-suit par de très fortes activités Cl et Cx et par une activité
de cellobiase (béta-glucosidase) L'activité du complexe enzymatique Cl, déEini suivant les 7~

hypothèses, COMme étant composé d'une activité Cx à laquelle est additionné un facteur inconnu, traduit plus particulièrement un pouvoir de solubilisation de la cellulose.
Cl est capable de déyrader la cellulose native (cellulose cristalline de degré de polymérisation DP ~ 3.500 unités de glucose) en cellulose amorphe.
L'activité du complexe enzymatique Cx traduit plus parti-culièrement le pouvoir réducteur des endo et exoylucanases. Ces enzymes agissent principalement sur les fibres de cellulose dans les zones de faible cristallinité et découpent les longs enchaine-ments de glucose en unités plus petites.
L.'activité de :La béta-glucosidase traduit une ac-tion sur les unités de cellobiose obtenues après l'action de Cx.
Ces cliE~érentes activites ne peuvent pas être prises séparé-ment~ Il existe un mécanisme de synergie entre Cl et Cx pour la dégradation de ces homopolyméres. Les mécanismes enzymatiques Cl et Cx aboutissent à la production de cellobiose; celle-ci est ensuite hydrolysée par une béta-glucosidase pour donner deux unités de glucose.
Les réactions cl'hydrolyse de la cellulose semblent se décom-poser selon le schéma suivant:
Cl Cellulose Native ~ Cellulose réactive Cx hydrolytique Cellulose réactive - > Cellobiose béta-ylucosidase hydrolytique Cellobiose - ; ~ 2 molécules de ylucose Le complexe C1 solubilise la cellulose cristalline ~degré
de polymérisa-tion (DP) supérieur à 3.500 monomères de ylucose~
et produit de la cellulose réactive (cellulose amorphe).

1~7~

Sous ~'action dù complexe enzymatique Cx (endo et exoglu-canases) les chaines de cellulose réactive sont découpées, soi~
à l'intérieur et-au hasard dans le cas des endo-glucanases, soit à partir des extrémités non réductrices dans le cas d~s exoglu-canases.
L'ensembl~ de ces réactions donne des unités de cellobiose.
Ces unités de cellobiose sont hydrolysées par une béta-glu-cosldàse pour donner deux molécules de glucose.
Dans le cas des cellulases fongiques selon l'invention, le complexe enzymatique C1 et Cx est capable d'hydrolyser la cellu lose native insoluble, en glucose.
Les cellulases se:Lon l'invention ont été choisies, non~
seulement en Eonction des critères généraux indiqués ci-dessus, mais également en tenant compte du milieu d'ensilage qui est particulier, en fonction du comportement polysaccharolytique de ces cellulases.
Ce comportement polysaccharolytique a été déterminé sur deux types de substrats:
a) - des substrats purs;
b) - des substrats déshydratés.
C~S DES SUBSTRATS PURS:
On a dé'terminé l'activité des cellulases A, B, C, Dr E, F, sur divers substrats à une concentration donnée dans un milieu tampon acétate 10 lM.
L'activité est testée selon les normes habituelles, c'est-à-dire à pH 4,8, a 50C, après 20 minutes d'hydrolyse. Le pouvoir réducteur est dëterminé en utilisant la technique à
l'hexaferrocyanure~

. _ . . . _ _ _ . . . , _ _ . _ _ . _ _ . _ ~ . _ _ _ _ _ _ . . _ _ . .

c 'n ~ ~ o ~ ~ o o o a~ ~ ~ ~r o o~ ~ ~r o ~ In (r) ~f, ~1 ~1 o 0~o a~ _ _ _ .
~:1 n ~ ~ o ~ o o o ~1 t~ H ~n O ~r ~I
I~S ~ ~ t~ r-l ~ r-l _ _ _ . _ a) .
O ~
- rl ~J ~ 1:7' Q ~) O ~ ~1 ~) O O O O
(~ r-l H 1~1 t~
I¢ (~S O
t~l _ _ _ aJ o~
~: ~
~ In ~ ,_1 ~ ~1 ,_~ 11~ O
r-l (~I H I~i r-l r-l ~1 O O
X o :~ In ~D ~ In ~D ~1 _ _ __ _ aJ
rl \ ~
In ~ ~O ~ ~ In In O
U t~l H In ~ r l 11'~ ~
. ~ O~ ~ ~1 (~) ~ ~ ~ ~0 _ _ __ _ O ~ q' o ~ o o ~D
~ o\o ~ _~ ~1' ~o cn q~ o ~D
~ H X d~ ~D . cr~ ~ Il') D
U ~1 _ ~O Il~ r-l ~O CO I_ _ . _ _ `~ ~ . .
~ ~. o\o ~_~ O ~ ~ ~ ~ O
rl 5~ H ~1 O r-l ~C) In I_ U~
(;~ ~1 D ~ . ~ (`I ~ c~

. _ __ _ _ _ ~CO /,_ E~ U '~
~ ~ rl U~ .1 ) / z ~ c . m u a ~ rL, / ~ I
.

~7~

CAS DES SUBSTRATS DESHYDRATES:
On a également déter~liné l'activité des enzymes A, B, C, D, E et F sur divers substrats végétaux déshydratés.
L'activité a été testée aux pH 3,3 - 4,8 - 5,8, à 30 C après une hydrol~se de 24 heures. Le pouvoir réducteur a été déter-miné en utilisant la technique à l'acide dinitro-salic~lique.

\ Substrats _ ~ _ Pulpes _ _ _ \ testés Luzerne Ra~-grass Ma~s de Paille ~ellulases \ betteraves testées \ _ _ pH ACTIVITE (UI/g)

3,3 2~10 223~ 1560 1810 1560 A 4,8 2440 2560 2080 1530 1690 5,~ 1560 2220 1690 1500 1530 ~ _ ~ ,_. ~ .
3,8 1560 1670 1530 1220 1390 B 4,8 1280 2060 1670 1220 1500 5,~ 890 16~0 1940 ~90 1280 . __ _ _ 3,8 1280 1530 1390 1110 1~10 C 4,8 1280 1750 1530 1110 1290 5,8 940 1560 1170 720 1110 . ~
3,8 1390 1440 1~70 127~ 1167 D 4 r ~ 1190 2060 1390 1111 1306 5,~ 890 1720 1530 972 1223 , .. . I __ 3,8 611 llg0 1111 556 694 E 4,8 972 1528 1250 0 694 5,8 0 1167 1278 0 694 . _ _ _ _ _ 3,~1306 1306 500 69~ 556 F 4,8 889 972 1222 610 444 5,3 750 1000 560 550 332 `` ~ 7~

L'anal~se de ces di~é~ents comportements a permis de déterminer llactivité du complexe cellulol~tique à utiliser selon l'invention dans l'ensilage:
On a ainsi trouvé que la cellulase ou le complexe celluloly-tique à ajouter dans le procédé selon l'invention au végétal frais ensilP doit correspondre à une activité Cl de 50 à 0,005 U.I., et une activité Cx de 500 à 0,05 U.I., pour 100 g de végétal, ces activités étant déterrninées à pH 4,8, à 50C, après 20 minutes d'hydrolyse.
En outre, la cellulase choisie doit conserver une activité
importante même aprè~ un long séjour clans le silo.
Il a été démontré, expPrimentalement, que dans des conditions se rapprochant de celles de l'ensilage, le complexe cellulolytique doit conserver, après 10 jours, au moins 30 % de son activité
initiale.

. _ . _ .
Temps de conservation .

en jours 0 5 10 lS 20 _ .
pH 4 8 100%97% 61% 26% 3%
__ __ , _ .
. pH 5,8 100~856 58~ 27% 0~
,.~ . .
La vitesse de clégradation enzymatique de la structure végé-tale est fonction de l'élimination du glucose; ce déplacement d'équilibre enzymatique est obtenu en utilisant des bactéries à
haut pouvoir fermentaire; l'acidifica-tion du milieu est très rapide. Lorsque la masse véyétale est stabilisée, la prolifé-ration bactérienne ainsi que la production d'acide lactique sont stoppées, contrairement à l'activité cellulolytique cle la cellu-lase qui se prolonge plus de 10 jours.
Cet-te activité par la production et l'accumulation cle glu-Z'7~

cose qu'elle engendre au sein de l'ensilage, va augmenter la valeur nutritive du végétal ensiJe.
La composition enzymatique utilisée dans le procédé.selon l'invention comprend donc une cellulase ou un complexe celluloly-tique présentant les caractéristiques ci--dessus, associé aux enzymes décri~es.dans le BF 2.390.908 c'est-à-dire une:amylase fongi~ue, une amylase bactérienne, une amyloglucosidase et un complexe hemicellulolytique.
Ces enz~mes présentes dans la compositi'on ont ainsi une action complémentaire de par leur activité sur les glucides,'des pLus complexe jusqu'aux plus simples, dans des zones de pH ui - pourraient al~er de'7 à 2. Les maxima d'activité pour chaque enzyme se relaient au ur et à mesure de liabaissement du pH, le-~uel ne descend pas au-dessous de pH 3,5 dans le silo, et da~s des intervalles de température variant de 10 à 30C compatibles avec les conditions du silo.
La composition bactérienne selon l'.invention est caractérlsée' par l'utilisation de nouvelLes souches bactériennes utilisables ' dans l''ensilage des végétaux, ces souches pouvant etre utilisées seules ou en mélange avec les souches bactériennes et/ou les enzymes décrits dans l'art antérieur et dans cette présente invention. 'Cette nouvelle composition conduit à des résultats d'ensilage très améliorés. Les nouvelles souches.bactériennes selon la présente invention sont des bactéries gram-; elles appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae, au Groupe Erwinia ou Pectobacterium, au groupe Herbicola; elles sont dé-nommées Enterobacter agglomerans (cLassi~ication Bergey's Manual of Bacteriology, eight edition).
Le tableau ci-après donne les caractéristiques de telle6 bactéries: ~ ~- --~~

TABLEAIJ I

Enterobacter Ag ~omerans (souche déposée le 11.2.80 à l'Institut Pasteur sou5 le No. I-114) Gram - Arabinose Utilisation malonate + Maltose Glucose -~ Trehalose Phenylalamine desaminase - Xylose ONPG ~ Amidon +
Indole - Oxydase H2S - Gélatine -~
LDC - Amygdaline -~
ODC - Mélibiose Uréase - V.P. -~
Saccharose -~ Rhamnose -Arginine dihydrolase Salicine Adonitol - ~, Isositol Sorbitol - ~ ., La mise en oeuvre de ces nouvelles souches de bactéries pour l'ensilage des végétauxr seuls ou en association avec d'autres souches bacterie~ es et/ou enz~ymes, s'efEectue selon les modalités décrites dans l'art antérieur. Les bactéries peuvent être culti-vées sur un support nutritif comprenant des farines de céréales.
La composition à lntroduire dans le silo comprend un mélanye des ;~
bactéries nécessaires déposée,s sur support soluble ou non, avec le mélange des enzymes préconisées dans la présente invention.
Une forme préférée de l'invention consiste à mettre les enzymes et les bactéries sur un support de céréales (blé, orge, orge germé) de préférence sous forme finemen-t broyée.
Une autre forme préférée de l'invention consiste à mette les bactéries et les enzymes sur un suppor-t du type amidon prégélatiné, ~ 11 --:~2'~

maltohexose, etc..., support qui est ~acilement soluble dans l'eau froide.
L'amidon et les autres polysaccharides contenus dans les supports s'ajoutent aux glucides des végétaux et augmentent ainsi la valeur nutritive de l'ensilage. La composition comprenant le mélange de bactéries supportées et le complexe enzymatique déposé ou non sur support de céréales, peut comporter des propor-tions di~férentes de chacun de ces constituants; ce mélange sec renferme une quantité de l'ordre de 100.000 à 1 million de cocci et 100.000 à 1 million de bacilLes/g.
Les quan-tités de cellulase, de complexe hemicellulolytique, d'amylase et d'amyloglucosidase peuvent être variables; elles sont calculées en fonction de la nature du fourrage à traiter.
La quantité de cellulase à ajouter au végétal Erais ensilé
doit correspondre à une activité Cl de 50 à 0,005 U.I. pour 100 g de végétal; elle ~oit donc être de 2 à 2.10 ~ en poids du végétal ~rais dans le cas d'une cellulase titrant 250 ~.I./~. Les pro portions des autres enzymes sont en-tre 0,05 et 0,20 ~ en poids du végétal, d'amylases bactériennes titrant 250 unités/g; entre 0,10 et 0,20 ~ en poids du végétal, d'amylases fongiques titrant 50.000 unités PS 50/g; entre 0,10 et 0,70 ~ en poids du végétal, d'amyloglucosidase titrant 200 unités AG/g; entre 0,OS et 0,20 ~
en poids du végétal, de complexe hemicellulolytique titrant 35.000 U.I./g.
Lorsque les enzymes sont déposées sur support de céréales selon la ~orme préférée de l'invention, le produit à incorporer dans l'ensilage peut contenir 1 kg d'enzymes pour 9 kg de support environ. Dans le cas d'un suppor~ soluble, les rapports de con-centration de l'enzyme par rapport au support changent et peuvent varier de 1/1,5 à 1/4.
Cette incorporation de cellulase dans le suppor-t va au~menter "

la q~antité de sucres fermentescibles disponibles, ce qui induira une production d'acide lactique plus importante et plus rapide.
La protéine vésétale sera ainsi mieux conservée. D'autre part, la valeur nutritive du milieu n'en sera qu'augmentée.
Afin d'illustrer l'intérêt d'un complexe cellulolytique, et de bactéries de la famille des Enterobacteriaceae, des essais ont été réalisés en micro-silos et en mini-silosO Les différents paramètres de conservation sont étud-iés ainsi que ceux traduisant la structure végétale.
1 ssais_realises en m ro-s:ilos Une première série d'expériences a été réalisée au laboratoire en micro-silos.
Ces expérimentations ont été efEectuées au mois de mai, sur de la luzerne: les micro-silos ont une capacité de 1 kg. La luzerne était hachée finement puis ensilée en suivant le proto-cole expérimental ci-après.
A - Une série de micro-silos fut traitée en utilisant l'additif de conservation dont la formule générale est la suivante:.
support céréalier 90 %
prémélanye 10 %
le prémélange étant constitué par:
- un complexe bactérien (5 bactéries lactiques sur support de lactose), - un complexe enzymatique comprenant:
. une amylase d'origine fongique;
. une amylase d'origine bactérienne;
. une amyloglucosidase;
. un complexe hemicellulolytique dlorigine fongique possédant comme activité principale une activité galactomannanasique;
- un suppor-t riche en énergie: orge finement moulue ~ lactosérum;
et les complexes bactérien et enzymatique entrant chacun pour ' ~27~

1 % dans la composi-tion du premélange.
L'additif de conservation fut additionné à la luzerne au taux de 2 % ~le taux d'incorporation du prémélange étant donc de 0,2 %) et on y ajoutait également 1 % d'orge.
B - Une série de micro-silos fut traitée avec le même additif de conservation qu'en A, mais en y ajoutant une cellulase d'origine fongique (provenant de Trichoderma viride) présentant une activité
Cl de 250 unités/g et une activité Cx de 2.500 unités/g (activités déterminées à pH 4,~, à 50C, pour un temps de réaction de 20 minutes) le taux d'incorporation de cette cellulase était de 2g/T
~soit 2.10 % en poids) par rapport au végétal frais (essai B) et de 200g/T (soit 0,02%) par rapport au végétal Erais (essai B').
C - Une série de rnicro si.los témoins:
- une sér:ie de micro-silos de luzerne ne contenant aucun conservateur: T = O.
Après 100 jours d'ensilage, les micro-silos étaient ouverts, les paramètres suivants furent suivis: pH, acide lactique, NH3/N :
total. Les résultats sont donnés dans le tableau suivant:

pH Acide lactique NH3/N tota].
. _ en g/kg MS _ _ _ _. ~ .

..... ~ .i. - Témoln T = O 5,66 26 g ~s,l5 .
Luzerne ~ 0,2 % de prémélange (A) 4,13 143,68 16,33 .

Luzerne ~ 0,2 "6 de prémélange -~ 4,32 144,75 16,20 cellulase d'origine fongique 2 g/T (B) _ ~__ _ . _ _ Luzerne ~ 0,2 % de prémélange + 3,73 169,47 15,02 cellulase d'origine fongique 200g/T (B') . .
_. _ .

; : , , , ~

7~

~ .
On constate que l'adjonction d'une cellulase au complexe bactéries + enzymes selon le brevet 2.390.908 a pour résultat ~ne amélloration des performances .de l'addit.if de conservation. On obtient une meilleure conservation du végétal qui se traduit, si l'on compare A e.t B' par: :
- une dLminution du pH: 4,13 3,73 (diminution de 10-%
- une augmentation de la production d'acide lactique de 15 ~
- une~diminution de 8 ~ du rapport NH3/N total; ce fait traduit une meilleure conservation de la protéine végétale, conséquence : d'une adicification rapide du milieu.
2 - Essals réalisés en mini-silos Ces essais ont été e~fectués pendant le mois de juin sur de . la luzerne dans des mini~silos d'une capacité de 150 kg.
La luzerne était hachée finement, puis soumise à l'ensilage en suivant le protocole expérimental ci-dessous.
A - Une série de mini-silos fut traitée en utilisant le même .~.
- additif de conservation que pour les micro-silos en A, la dose d'incorporation étant de 0,2 ~ de prémélange.
B - Une série de mini-silos fut traitée en utilisant la formule et la dose indiquées en A à laquelle on a additionné.la même cellulase d'origine fongique a la dose de 2 g/T.
Après 10,0 jours d'ensilage, les mini-silos sont ouverts,__ __ l'analyse des ensilages a conduit aux résultats.suivants:~
. . ____ . .. . _ _ , . _ _ I .. _ _ . . _.. . ,.. ... ; .

~ .~7~

~IJ ~ cn cs~ ~ o ~ r-l O
mO\o U~ ~ ~ .~ ~ ..
1~j_02) ~ ~ O (`~ ~r) O') ~ N r~lN ~~ N ~ ~ N ~

., _ _. .___ _ _ ~ . ~' r-l ~E~ .
-- Ll~ ~ ~ O O r~
u: ~r ~ I_ co . - ~ 0\o ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~
~r) r-l d~ O 1~ CO r-l ~t ~1 ~1 L(~ Ci~ r-l r-l t~l 'O .
' r-l U~
.
_ ----U~ ~ _ 0\ .~, . ~n .,,:. t~l ~ ~.~ :~
,~ , U~ ~ ~ . ~
~u~ ~ ~ tn ., tl~ ~ (V <I) ~ t~
rC ~ t~ t~ tJI r-l U v ~ r~ rl r~l v t~
~a) ~ ~, ~ l~s ~ ~
U~ ~ ~ ~1) V tJ~ rl a) ~ r-l 1~1 ~J r-l O
Z ~ ' E;
"1 ~ ~ ~ ~ O ~
Z ~ rl rl ~C ~ (IS
~ ~ 1~1 ~ ~ Z Z Z;
. __ ___ .
.

~'7~
., Les résultats ci-dessus démontrent plelnement l'intérêt de l'addition d'une cellulase au complexe bactéries ~ enzymes décrites dans le breve-t 2.390.908.
Cette addition produit:
- un pH plus faible 3,94 contre ~,20 (moins 6 %) - une quantité plus importanke d'acide lactique (plus 29,53 ~) - la partie protéique de l'ensilage est;bien mieux conservée lorsque l'on supplémente par une cellulase; ceci est confirmé
par l'analyse. On a dans ce ~as:
ln - un rapport N113/N total plus faible (moins 27,6 %) - un taux protéique plus élevé (plus 6 ~) - un taux d'azote ammoniacal plus faihle (moins 20,1 ~) Cette plus grande vitesse d'acidification peut s'expliquer par le fait que les bactéries vont disposer plus rapidement d'une masse irnportante de sucres Eern~entescibles facilement~ transor-~ables en acide lackique. Dans cette disponibilité, on retrouve l'efEet de la cellulase introduite dans le milieu.
Dans les exemples qui suivent, le mélange sur support selon le procédé de la présente invention est constitué par le complexe décrit dans le brevet Erançais 2.361.828 et/ou le brevet 2.390.908, le complexe enzymatique décrit dans :la présente invention, auq~el on ajoute des bacilles gram-, de la famille des Enterobacteriaceae, genre Erwinia ou Pectobacterium, groupe Herbicola, le taux d'incorporation de ces bacilles dans le mélange correspond à 105 à 106 bacilles/g.
EXEMPLES
Des essais ont été effectués dans des silos de ~ m3 de ; capaci-té sur du dactyle LuciEer récolté en juin, en début d'épiaison. Le fourrage finement haché est soumis à stockage dans

4 conditions:

A: ensilage sans traitement . . . .

~ 7~

B: ensilage réalisé avec 4 litres d'acide formique/tonne, à la manière connue de l'art antérieur C: ensilage réalisé avec le prémélange dont la composition - est donnée dans les brevets Erançais 2.361.~28 et 2.390.908: ensilage additionné de 7 kg de la culture de 7 bactéries sur support dont les caractéristiques sont indiquées dans le brevet fran~ais 2.361.828, page 7, N l à 7, et d'enzymes: dose d'incorpora-tion lO kg/tonne.
D: ensilage réalisé avec le prémélange suivant C auquel sont ra~butés des bacilles selon l'invention: bactéries gram~, de la famille des Enterobacteriaceae du genre Erwinia ou Pectobacterium, du groupe Herbicola dénomm~es I,nterobacter agglomerans. Dose d'incorporation du complexe lO Icg/T.
Après 90 à lO0 jours, les différents ensilages sont ouverts, et les analyses des végétaux sont effectués. Elles conduisent aux résultats ci-après (Tableau II).

/

/

.

:~
~ u~
.,, a U~ ~ h O O O
. :~ ~J .
Q
a) _ _ __ __ . . . .
.` ~
Y ~ ~D L~ O CO
-rl ~1' .
~ ~ ~ ~r c~
~ U ~I r-l r-l r-l Ul (U .__ . _ __.. ___ .. . .

. r r~ CO .
a ~:: (~a) ~ O _ t) O O r~l llS O O
~ (I) _ - ---I -t~l ~D :' '~J ~
C) ~)r-J O ~1 ~ ~J ~ ~ r-l r~l r-~
. _ __ _ -- - ---~
H r-l Q r-l O t~) O
~ ) ~ ~ C ) ~ r~l ~0 O ~ u~ ~ ~r æ ~D ~r ~r ~r .. E~
. ~ _ r-l .
~ ~1.1 ~D O
~ O t~ r-l ,, Z ~ ~ ~
I r- 1- ~ CO
O' D r-l r-l __ _ , . . ' .
,.~,~.,.. ~ . a In ~ O
X ~`1 O O I_ Q~ ~ ~ ~ ..
Ll~ d' ~ t~l _ _ .
l 1~
' 0 1 0~0 ~ @
. (I) I d~ ~ r~) ~r~
~1 1 ~ O U) ~ ~
I G) a1 r-l ~ r~ r~ U~
~a) I
I ~ ~ u~
t!S I r~ C . ~
~-,1 ~a) ~ ~ ~ ~ O~c ~ o (~1 1-1 ~:: h ~ h CO ~: r~ O ~ rl Pl r l a) O Q~ ~1 0 a) ~) ~ (1) -IJ
1 0 1~ E~ ~ E~ E~ ~ O ~
I ~) s ~ a) a) .l ~ (1) ~ 1 (1) I ~ J-) ~ ~) O O 1 (I) . ~1 ~ r~ ~> G~ r~ ~ + ~ 1~
1~) ~r~ (1~ ~ ~1 0 rl a) O ~ V h ~ . h ~
~) (~1 -1-) Q ~I -1-) r-¦ ~--Q r-¦
I (I~ ~ ~ ~ ~
__ ~ _ :L9 , Q~

La comparaison des résultats permet de constater que le mélange suivant les brevets rançais 2.36:L.828 et 2~390~908 apportait déjà une amélioration dans la conservation de l'ensilage, ceci se traduisant par:
- un abaissement du pH qui passait de 5,28 à 4,02 -- une teneur en acide lactique plus élevée qui passait de 23 à 90 g/kg de MS
- une meilleure protection p.rotéique qui se traduit par une diminution du ràpport N-NH3 qui passait de 17,76 à 14 :
N total et du rapport N soluble qui passait de 63,80 à 48,10 Ce mélange présentait l'avantage de ne donner lieu à aucune formation d'acide propionique et d'acide butyrique.
Le mélange suivant la présente invention apporte une amélioration supplémentaire se traduisant par:
- un abaissement du pH qui passe de 4,02 à 3,70 - une teneur en acide lactique plus élevée qui passe de 90 g à 112 g/kg de MS
- une meilleure protection protéique qui se traduit par une diminution du rapport N-NH3/N total. Celui-ci passe de 14 à 8 et du rapport N soluble/N total, Celui-ci passe de 48,10 à 44.
Ce mélange présente l'avantage de ne donner lieu à aucune fermentation dlacide propionique et d'acide butyrique.
Les digestibilité et l'ingestibilité de ces ensilages ont été mesurées sur des moutons; après les divers traitements, il a été trouvé:
B: traitement à l'acide formique; 0,64 UF/kg C: traitement suivant les brevets français 2.361.828 et ~ :
2.390.908 : 0,74 UF/kg D: traitement suivant l'invention: 0,82 UF/kg Le bilan azoté sur animaux en croissance conduit à des .~ - 20 -résultats montrant l'intérêt des traitements avec des produits d'ensilage selon la présente-invention comme on peut le voir dans le tableau III~

~27 _ ~ _ __ _ __ :~ ~aJ o co .
. aJ .~ o co ,~ ,~
Z _ ~ ,~ .... .. _ ., ~ ' \ o` ,~ ,~ ~ ::~
.. . .:.... .. . .~. ,.
aJ ~a~
, .~ ~ ~ ~
.' ~ ,~ ,~ Lf~ r~ 1-C Z,~ ~D In ~r ~r 3 _ . __ . ~ ~_~ ~r ~ lo~
~1 . t`
~aJ ... __ _ _ H r l ~ ~.
(~ .~::I` CO ~D C~
~ ~ ~CO ~ 0~
3 l ~o ~ ~ ~
_ . _ ._ _ . ,.
r~ O ~r ~_ ~r ~ I r~ I In _ _ _ __ ~a) ,~ ~ ,-~
,~co r~
.... ~,~ ~ ,~ ,., ,~
tn / . ~ ~ ,~

~ l a @ ~ ~
aJ / ~ ~1 Ql rl E~ I rd' 3-~ ~ :~
. ~ / ~aJ ~ o ~.~l~lJ ~ o ~ l ~ ~ 4~ ~ ~
/ M r~ a) a) L4'a aJ ~J
/ .~ ~ E~ aJ E~ E~ ~ ., / ~ ~, a)~ aJ ~ ,~ al aJ
/. a) ~ ~ o~o ~l ~ o ~ ~
/ (I) t (iJ (IS d' (a ~) ~ (~ rl / ~ o~ .1- ,~ o Q~aJ _ ' I ~ ~ . .' .
.. ...... _ _ . . _ .

- 22 - ~

~2'7~LQ~

La rétention azo-tée dans le cas de la présente invention -est plus que doublée par rapport à celle q~e l'on obtient après trai~ement à l acide formique ~ V

/

... . ~--^ /

. - 23 ~

Claims (10)

Les réalisations de l'invention, au sujet desquelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit:

1. Procédé de conservation et valorisation de végétaux en vert par acidification lactique qui comprend l'ad-jonction à ces végétaux avant l'ensilage d'un facteur de dé-gradation des glucides supérieurs en glucides fermentescibles utilisables par les bactéries produisant la fermentation lac-tique, ce facteur étant constitué par un complexe d'enzymes et/ou par un complexe de bactéries caractérisé en ce que le complexe enzymatique comprend, associé à une amylase fongique, à une amylase bactérienne, à une amyloglucosidase, à un complexe hémicellulolytique d'origine fongique possédant comme activité principale une activité galactomannanasique, une cellulase ou complexe cellulolytique d'origine fongique, capable de dégrader la cellulose native en glucose et ayant une activité C1 de 50 à 0,005 unités internationales et une activité Cx de 500 à 0,05 unités internationales pour 100 g de végétal frais et conserve dans les conditions de l'ensilage au moins 30% de cette activité au bout de 10 jours, et en ce que le complexe bactérien comprend, associé ou non à une amylase fongique, à une amylase bactérienne, à une amylo-glucosidase, à un complexe hemicellylolytique d'origine fon-gique possédant comme activité principale une activité galac-tomannanasique, des bactéries gram- qui fermentent l'amidon mais ne fermentent pas le maltose appartenant à la famille des Enterobacteriaceae, genre Erwinia ou Pectobacterium, groupe Herbicola étant dénommées Enterobacter agglomerans No. I-114).

2. Procédé selon la revendicaiton 1 caractérisé
en ce que les bactéries de la famille des Enterobacteriaceae sont utilisées en association avec des bactéries connues de l'art antérieur capables de dégrader les glucides supérieurs, en glucides fermentescibles.

3. Procédé selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé

en ce que les bactéries de la famille des Enterobacteriaceae sont utilisées en association avec des bactéries gram + qui fermentent l'amidon, le glucose, le mannitol, le rahmnose, le saccharose, l'amygdaline, l'arabinose et ne fermentent pas le maltose, l'inositol, le sorbitol.

4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange d'enzymes est constitué par:
2.10-4 à 2% de cellulase titrant 250 U.I. d'activité C1/g 0,05 à 0,20 % d'amylase bactérienne titrant 250 unités/g 0,10 à 0,20 % d'amylase fongique titrant 5.000 unités PS 50/g 0,10 à 0,70 % d'amyloylucosidase titrant 200 unités AG/g, 0,05 à 0,20 % de complexe hemicellulolytique titrant 35.000 U.I./g les % étant calculés en poids par rapport au végétal, ensilé.

5. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 2, caracté-risé en ce que les enzymes sont incorporées sur un support de céréales à raison d'environ 1 kg d'enzymes pour 9 kg de support.

6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les bactéries sont cultivées sur un support comprenant des farines de céréales.

7. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 2, caracté-risé en ce que les bactéries et les bactéries et les enzymes sont incorporées sur un support du type amidon de céréales, amidon prégélatiné, malto-hexose, soluble dans l'eau froide, dans la proportion de 1 kg de bactéries et d'enzymes pour 1,5 à
4 kg de support.

8. Procédé suivant l'une des revendications 1, 4 ou 6 caracté-risé en ce que les quantités d'enzymes et de culture bactérienne avec leur support, à l'état sec, ajoutées par tonne de végétaux à ensiler sont de 10 à 15 kg, cet additif renfermant de 105 à
106 de germes vivants par gramme.

9. Composition pour la conservation et la valorisation de végétaux en vert qui comprend des souches de bactéries produc-trices d'acide lactique, et un facteur de dégradation de glucides supérieurs en glucides fermentescibles, constitué par un complexe d'enzymes et/ou par un complexe de bactéries, caractérisé en ce que le complexe enzymatique comprend associé
ou non à une amylase fongique, à une amylase bactérienne, à
une amyloglucosidase, à un complexe hemicellulolytique d'origine fongique possédant comme activité principale une activité
galactomannanasique, une cellulase ou complexe cellulolytique d'origine fongique, capable de dégrader la cellulose native en glucose et ayant une activité C1 de 50 à 0,005 unités interna-tionales et une activité Cx de 500 à 0,05 unités internationales pour 100 g de végétal frais et conservé dans les conditions de l'ensilage au moins 30 % de cette activité au bout de 10 jours et en ce que le complexe bactérien comprend des bactéries gram -qui fermentent l'amidon mais ne fermentent pas le maltose, appartenant à la famille des Enterobacteriaceae, genre Erwinia ou Pectobacterium, groupe Herbicola, étant dénommées Enterobacter Agglomèrans (No. I-114).

10. Composition selon la revendication 9 caractérisé en ce que les bactéries gram - Enterobacteriaceae sont associées à des bactéries capables de dégrader les glucides supérieurs en sucres fermentescibles, et en particulier des bactéries gram + qui fermentent l'amidon, le glucose, le mannitol, le rahmnose, le saccharose, et l'amygdaline, l'arabinose, et ne fermentent pas le maltose, l'inositol, le sorbitol.