CA1127101A

CA1127101A - Process and product for the preservation of green roughages and humid by-products of the agricultural and food industries

Info

Publication number: CA1127101A
Application number: CA345,395A
Authority: CA
Inventors: Louis Ostre
Original assignee: Ceva SA
Current assignee: Ceva SA
Priority date: 1979-02-12
Filing date: 1980-02-11
Publication date: 1982-07-06
Also published as: AR219435A1; YU34980A; PL122629B1; AU537458B2; AU5541280A; GB2046567B; YU43215B; RO85921B; ATA74580A; IT8019844A0; GR74002B; HU185784B; LU82150A1; DE3005020A1; SE452244B; DD149015A6; NL8000876A; RO85921A; SE8001062L; IT1212401B

Abstract

Procédé pour la conservation des végétaux en vert par acidification lactique qui comprend l'adjonction à ces végétaux avant l'ensilage d'un facteur de dégradation des glucides supérieurs en glucides fermentescibles utilisables par les bactéries produisant la fermentation lactique. Ce facteur est constitué par un complexe enzymatique et/ou un complexe bactérien. Le complexe enzymatique comprend un complexe cellulolytique d'origine fongique associé ou non aux complexes enzymatiques connus dans l'art antérieur. Le complexe bactérien comprend des bactéries gram de la famille des Enterobacteriaceae associées ou non aux bactéries connues dans l'art antérieur et en particulier aux bactéries gram + qui fermentent l'amidon mais ne fermentent pas le maltose. Cette composition à base d'enzymes et/ou de bactéries, disposées sur support de céréales donne des résultats particulièrement interessants dans le cas des végétaux pauvres en glucides.Process for the conservation of plants in green by lactic acidification which comprises the addition to these plants before ensilage of a factor of degradation of the higher carbohydrates into fermentable carbohydrates usable by the bacteria producing lactic fermentation. This factor consists of an enzyme complex and / or a bacterial complex. The enzymatic complex comprises a cellulolytic complex of fungal origin associated or not with the enzymatic complexes known in the prior art. The bacterial complex comprises gram bacteria of the Enterobacteriaceae family associated or not with bacteria known in the prior art and in particular with gram + bacteria which ferment starch but do not ferment maltose. This composition based on enzymes and / or bacteria, arranged on a cereal support gives particularly interesting results in the case of plants low in carbohydrates.

Description

Llinvention concerne un procédé améLioré pour la conserva-tion et la valorisation de véyétaux fr~is, afin de permettre leur consommation sous une forme appétente au fur et à mesure des besoins, ultérieurement à leur date de récolte, elle concerne également une composition pour la réalisation du procédé.
Etant donné l'importance du problème posé par la conservation des végétaux en vert7 de nombreux travaux de recherche ont été
consacrés à la réalisation de cette technique qui présente un certain nombre de difficultés.
L'ensilage repose sur le principe de la conservation de végétaux frais, pendant une période plus ou moins longue, dans une enceinte close et étanche, en ~ilieu acide, dans le but d'empêcher le développement des c~ermes putréEiants alcalinisants et gazogènes, ces germes ne se développant pas en milleu acide.
La réalisation d'un bon ensilage est difficile et elle se heurte à de nombreux obstacles, les principaux étant la formation de produits de fermentation c1angereux pour la santé des animaux, voire des humains qui consomment la viande et les produits laitiers.
I,e mécanisrne recherché est le suivant: permettre aux bactéries lactiques contenues dans le milieu de produire de l'acide lactique à partir de sucres solubles disponibles, de telles sorte que le milieu puisse descendre à un pH voisin de 4.
Mais il arrive bien souvent que les végétaux à ensiler ne conte-nant pas suffisamment de sucres ermentescibles, la proliféra-tion des seules bactéries lactiques contenues dans le milieu est insuffisante, le pH ne descend pas assez rapidement à 4, et les bactéries but~riques et anaérobi~ues se développent, transformant les sucres résiduels en acides butyrique et acétique, en gaz carbonique et en h~drogène; les protéines sont dégradées au stade d'ammoniaque et d'autres métabolites.

~79Lq~L

Diverses solutions ont eté apportées à ces inconvénients.
En particulier, iI est colinu d'effe~tuer une acidiEication chi-mique par addition d'acides divers. ~lais ces procédés ne sont pas sans danger. Il est également connu d'effectuer une acidi-fication biologique par addition de bactéries très ylucidolytiques.
Mais cette acidiEication biologiqu~ est difficile dans sa réalisation.
On a décrit également des procédés dans lesquels on ajoute dans le silo une matière première riche en glucides, par exemple des mélasses. Les résultats obtenus sont irréguliers et le procédé couteux.
Dans le brevet francais 2.361.~2~, il est décrit un procédé
de conservation et valorisation de végétaux en vert par acidiEi-cation lactique, qui comprend lladjonction à ces végétaux, avant l'ensilage, de bactéries capables de provoquer la fermentation lactique, ainsi que l'addition d'un facteur de dégradation de glucides supérieurs en sucres fermentescibles1 utilisables par les bactéries produisant la fermentation lactique. Ce facteur de dégradation est constitué par des bactéries gram -~ qui fermentent l'amidon, le glucose, le mannitol, le rahmnose, le saccharose, l'amygdaline, l'arabinose et ne fermentent pas le maltose, l'inositol le sorbitol; ces bactéries sont VP ~ ;

-oxydase ~ ; catalase ~ ; nitrates ~ ;urée - ; citrates - ;
indole - ; ~2S - . Ce facteur de dégradation peut éyalement compEendre une ou plusieurs en~ymes susceptibles de scinder des polysaccharides, notamment les amidons, les pentosanes et autres polysaccharides complexes en sucres fermentescibles. En parti-culier, selon ce brevet on peut ajouter au fourrage un complexe hemicellulolytique d'origine fongique possédant comme activite principale une activité galactomannanasique et des ~ctivités secondaires comme étant des xylanases, amylases, pectinases et 1~2~

une amylase pour assurer la formation de maltose nécessaire à la production de l'acide lacti~ue par les bactéries.
Le brevet français 2.390.908 constitue un perfectionnement au brevet 2.361.~28. Tandis ~ue l'amylase utilisée dans le brevet français 2.361.82~ est une exoamylase d'orlgine fongique qui ne dégrade pas totalement l'amidon, l'amylase utilisée dans le brevet The invention relates to an improved process for the preservation tion and the valuation of véyétaux fr ~ is, to allow their consumption in an appetizing form as and when needs, after their harvest date, it concerns also a composition for carrying out the process.
Given the importance of the conservation problem plants in green7 many research studies have been devoted to the realization of this technique which presents a number of difficulties.
Silage is based on the principle of conservation of fresh plants, for a longer or shorter period, in a closed and sealed enclosure, in ~ acid area, for the purpose to prevent the development of rotten alkalizing cerms and gas generators, these germs do not develop in acidic milleu.
Achieving good silage is difficult and it collides many obstacles, the main ones being the formation of dangerous fermentation products for animal health, even humans who eat meat and products dairy.
I, the mechanism sought is as follows: allow lactic acid bacteria contained in the medium to produce lactic acid from available soluble sugars, such that the medium can drop to a pH close to 4.
But it very often happens that the plants to be ensiled do not contain not having enough erasable sugars, the proliferation tion of the only lactic acid bacteria contained in the medium is insufficient, the pH does not drop quickly enough to 4, and the purpose bacteria and anaerobic bacteria develop, transforming residual sugars in butyric and acetic acids, in gases carbonic and h ~ drogenic; proteins are degraded at the stage ammonia and other metabolites.

~ 79Lq ~ L

Various solutions have been made to these drawbacks.
In particular, it is colinu of effect ~ kill a acidiEication chi-mique by addition of various acids. ~ but these processes are not not without danger. It is also known to carry out an acidi-biological fication by addition of very ylucidolytic bacteria.
But this biological acidification is difficult in its production.
Methods have also been described in which in the silo a raw material rich in carbohydrates, for example molasses. The results obtained are irregular and the expensive process.
In the French patent 2,361. ~ 2 ~, a process is described.
of conservation and enhancement of green plants by acidiEi-lactic cation, which includes the addition to these plants, before silage, bacteria capable of causing fermentation lactic acid, as well as the addition of a degradation factor higher carbohydrates in fermentable sugars1 usable by bacteria producing lactic fermentation. This factor of degradation is constituted by gram - ~ bacteria which ferment starch, glucose, mannitol, rahmnose, sucrose, amygdalin, arabinose and do not ferment the maltose, inositol sorbitol; these bacteria are VP ~;

-oxidase ~; catalase ~; nitrates ~; urea -; citrates -;
indole -; ~ 2S -. This degradation factor can also understand one or more en ~ ymes likely to split polysaccharides, especially starches, pentosans and others complex polysaccharides into fermentable sugars. In part-culier, according to this patent a complex can be added to the fodder hemicellulolytic of fungal origin having as activity main galactomannanasic activity and ~ ctivities secondary as xylanases, amylases, pectinases and 1 ~ 2 ~

an amylase to ensure the formation of maltose necessary for the production of lactic acid by bacteria.
French patent 2,390,908 constitutes an improvement to patent 2,361. ~ 28. While the amylase used in the patent French 2,361.82 ~ is an exoamylase of fungal origin which does not not completely degrade starch, the amylase used in the patent

2.390.90~ est une amylase d'origine bactérienne~ Cette enzyme (endoamylase) agit sur les amidons liquéfiés et produit princi-palement de l'~-D maltose, et un peu d~ glucose, et agit dans un domaine de pH compris entre 5 et 8. Le brevet français 2.390.908 décrit également l'utilisation d'amyloglucosidase, qui a une action beaucoup plus poussée vis à vis des chalnes d'amylose et d'amylopectine pour l'obtention d'~-D glucose. La composition enzymatique selon ce brevet comprend également un complexe hemi-cellulolytique d'origine fonyique qui ayit sur les constituarlts polysacchariques des membranes cellulaires et les dextrines, dans des zones de pH compris entre 5,5 et 2.
La présente invention a pour objet un procédé et une compo-sition améliorés pour l'ensilage des végétaux, l'amélioration 2~ portant à la fois sur la composition enzymatique, et sur la composition bactérienne. L,a composition enzymatique est caractérisée en ce qu'elle contient, en plus des enzymes précédemment utilisées, un complexe cellulolytique ou cellulase capable de scinder les liaisons béta (1-~3) et (1-~4) des poly~
saccharides non attaquées par la composition enzymatique précédente.
Il s'agit d'un complexe cellulolytique d'origille ~ongique qui dégrade la cellulose naturelle et les autres polysaccharides contenus dans les membranes cellulaires~
Cette enzyme agit dans une zone de pH comprise entre 2 et 5.
Il existe un phénomène de synergie entre le complexe cel:Lulolytique `et le complexe hemicellulolytique pour dégrader les structures végétales.
Du fait de l'environnement de la cellulose dans le végétal, son hydrolyse nécessite plusieurs enzymes ou une seule remplissant plusieurs fonctions qui sont:
- l'hydrolyse des zones amorphes, - le gonflement des réglons cristallines et la rupture des liaisons hydrogènes pour donner des molécules lineaires, - l'hydrolyse de la cellobiose en glucose, la transglucosylation des di et oligosaccharides ainsi que la rupture des liaisons irrégulières de ].a cellulose et de ses produits primaires d'hydrolyse.
Le complexe cellulolytique a été choisi en fonction des critères ci-dessus et après un grand nornbre d'essais sur divers végétaux.
Une cellulase est définie par son activité exprimée en unités internationales par yramme de produit, une unité internationale (U.I.) étant la quantité d'enzyme qui libère en sucre réducteur l'équivalent d'une micromole de glucose par minute, sur un sub-strat cellulosique donné.
Les activités varient en fonction du subtrant utilisé:- si on teste l'activité sur de la poudre de papier Whatman CC 31 on obtient l'activité Cl;
- si on teste l'activité sur de la carboxyméthylcellulose on obtient l'activité Cx.
Le complexe utilisé selon l'invention possède une très haute activité cellulolytique ainsi que des activités secondaires du type hemicelluloly-tique. Le haut pouvoir cel].ulolytique se tra-suit par de très fortes activités Cl et Cx et par une activité
de cellobiase (béta-glucosidase) L'activité du complexe enzymatique Cl, déEini suivant les 7~

hypothèses, COMme étant composé d'une activité Cx à laquelle est additionné un facteur inconnu, traduit plus particulièrement un pouvoir de solubilisation de la cellulose.
Cl est capable de déyrader la cellulose native (cellulose cristalline de degré de polymérisation DP ~ 3.500 unités de glucose) en cellulose amorphe.
L'activité du complexe enzymatique Cx traduit plus parti-culièrement le pouvoir réducteur des endo et exoylucanases. Ces enzymes agissent principalement sur les fibres de cellulose dans les zones de faible cristallinité et découpent les longs enchaine-ments de glucose en unités plus petites.
L.'activité de :La béta-glucosidase traduit une ac-tion sur les unités de cellobiose obtenues après l'action de Cx.
Ces cliE~érentes activites ne peuvent pas être prises séparé-ment~ Il existe un mécanisme de synergie entre Cl et Cx pour la dégradation de ces homopolyméres. Les mécanismes enzymatiques Cl et Cx aboutissent à la production de cellobiose; celle-ci est ensuite hydrolysée par une béta-glucosidase pour donner deux unités de glucose.
Les réactions cl'hydrolyse de la cellulose semblent se décom-poser selon le schéma suivant:
Cl Cellulose Native ~ Cellulose réactive Cx hydrolytique Cellulose réactive - > Cellobiose béta-ylucosidase hydrolytique Cellobiose - ; ~ 2 molécules de ylucose Le complexe C1 solubilise la cellulose cristalline ~degré
de polymérisa-tion (DP) supérieur à 3.500 monomères de ylucose~
et produit de la cellulose réactive (cellulose amorphe).

1~7~

Sous ~'action dù complexe enzymatique Cx (endo et exoglu-canases) les chaines de cellulose réactive sont découpées, soi~
à l'intérieur et-au hasard dans le cas des endo-glucanases, soit à partir des extrémités non réductrices dans le cas d~s exoglu-canases.
L'ensembl~ de ces réactions donne des unités de cellobiose.
Ces unités de cellobiose sont hydrolysées par une béta-glu-cosldàse pour donner deux molécules de glucose.
Dans le cas des cellulases fongiques selon l'invention, le complexe enzymatique C1 et Cx est capable d'hydrolyser la cellu lose native insoluble, en glucose.
Les cellulases se:Lon l'invention ont été choisies, non~
seulement en Eonction des critères généraux indiqués ci-dessus, mais également en tenant compte du milieu d'ensilage qui est particulier, en fonction du comportement polysaccharolytique de ces cellulases.
Ce comportement polysaccharolytique a été déterminé sur deux types de substrats:
a) - des substrats purs;
b) - des substrats déshydratés.
C~S DES SUBSTRATS PURS:
On a dé'terminé l'activité des cellulases A, B, C, Dr E, F, sur divers substrats à une concentration donnée dans un milieu tampon acétate 10 lM.
L'activité est testée selon les normes habituelles, c'est-à-dire à pH 4,8, a 50C, après 20 minutes d'hydrolyse. Le pouvoir réducteur est dëterminé en utilisant la technique à
l'hexaferrocyanure~

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~7~

CAS DES SUBSTRATS DESHYDRATES:
On a également déter~liné l'activité des enzymes A, B, C, D, E et F sur divers substrats végétaux déshydratés.
L'activité a été testée aux pH 3,3 - 4,8 - 5,8, à 30 C après une hydrol~se de 24 heures. Le pouvoir réducteur a été déter-miné en utilisant la technique à l'acide dinitro-salic~lique.

\ Substrats _ ~ _ Pulpes _ _ _ \ testés Luzerne Ra~-grass Ma~s de Paille ~ellulases \ betteraves testées \ _ _ pH ACTIVITE (UI/g) 2,390.90 ~ is an amylase of bacterial origin ~ This enzyme (endoamylase) acts on liquefied starches and main product palation of ~ -D maltose, and some glucose, and acts in a pH range between 5 and 8. The French patent 2,390,908 also describes the use of amyloglucosidase, which has a much more intense action with respect to amylose chalnes and amylopectin to obtain ~ -D glucose. The composition enzymatic according to this patent also includes a hemi- complex cellulolytic of fonyic origin which has on the constituarlts polysaccharides of cell membranes and dextrins, in pH zones between 5.5 and 2.
The subject of the present invention is a method and a composition.
sition improved for plant silage, improving 2 ~ relating both to the enzymatic composition and to the bacterial composition. The enzyme composition is characterized in that it contains, in addition to enzymes previously used, a cellulolytic complex or cellulase able to split the beta bonds (1- ~ 3) and (1- ~ 4) of poly ~
saccharides not attacked by the enzyme composition former.
It is a cellulolytic complex of origin ~ ongic which degrades natural cellulose and other polysaccharides contained in cell membranes ~
This enzyme acts in a pH zone between 2 and 5.
There is a phenomenon of synergy between the cel complex: Lulolytic `and the hemicellulolytic complex to degrade structures vegetable.
Due to the cellulose environment in the plant, its hydrolysis requires several enzymes or only one filling several functions which are:
- hydrolysis of amorphous zones, - the swelling of the crystalline regions and the rupture of hydrogen bonds to give linear molecules, - the hydrolysis of cellobiose into glucose, the transglucosylation of di and oligosaccharides as well as the rupture of the irregular bonds of] .a cellulose and its primary hydrolysis products.
The cellulolytic complex was chosen according to the above criteria and after a large number of tests on various plants.
A cellulase is defined by its activity expressed in units international by product yram, an international unit (IU) being the amount of enzyme that releases reducing sugar the equivalent of one micromole of glucose per minute, on a sub-given cellulosic stratum.
The activities vary depending on the subtrant used: - if the activity is tested on Whatman CC 31 paper powder the Cl activity is obtained;
- if we test the activity on carboxymethylcellulose we obtains the activity Cx.
The complex used according to the invention has a very high cellulolytic activity as well as secondary activities of hemicelluloly-tick type. The high cel] .ulolytic power is follows by very strong Cl and Cx activities and by an activity cellobiase (beta-glucosidase) The activity of the enzyme complex Cl, deEini according to the 7 ~

hypotheses, AS being composed of an activity Cx to which is added an unknown factor, more particularly translates a cellulose dissolving power.
Cl is capable of dehydrating native cellulose (cellulose crystalline degree of polymerization DP ~ 3,500 units of glucose) into amorphous cellulose.
The activity of the Cx enzyme complex is more specific especially the reducing power of endo and exoylucanases. These enzymes mainly act on cellulose fibers in areas of low crystallinity and cut long chains glucose units in smaller units.
L. activity of: Beta-glucosidase translates an action on the cellobiose units obtained after the action of Cx.
These cliE ~ erent activities cannot be taken separately.
ment ~ There is a synergistic mechanism between Cl and Cx for the degradation of these homopolymers. Enzymatic mechanisms Cl and Cx result in the production of cellobiose; this one is then hydrolyzed with beta-glucosidase to give two glucose units.
Cellulose hydrolysis reactions appear to decay install according to the following diagram:
Cl Native Cellulose ~ Reactive Cellulose Hydrolytic Cx Reactive cellulose -> Cellobiose beta-ylucosidase hydrolytic Cellobiose -; ~ 2 molecules of ylucose C1 complex solubilizes crystalline cellulose ~ degree polymerization (DP) greater than 3,500 ylucose monomers ~
and produces reactive cellulose (amorphous cellulose).

1 ~ 7 ~

Under the action of the Cx enzyme complex (endo and exoglu-canases) the reactive cellulose chains are cut, itself ~
inside and-randomly in the case of endo-glucanases, either from the non-reducing ends in the case of exoglu- s canases.
All of these reactions give units of cellobiose.
These cellobiose units are hydrolyzed by beta-glu-cosldàse to give two molecules of glucose.
In the case of fungal cellulases according to the invention, the C1 and Cx enzyme complex is capable of hydrolyzing the cell lose native insoluble, in glucose.
The cellulases themselves: according to the invention have been chosen, not ~
only in accordance with the general criteria indicated above, but also taking into account the silage medium which is particular, depending on the polysaccharolytic behavior of these cellulases.
This polysaccharolytic behavior was determined on two types of substrates:
a) - pure substrates;
b) - dehydrated substrates.
C ~ S PURE SUBSTRATES:
We have determined the activity of cellulases A, B, C, Dr E, F, on various substrates at a given concentration in a medium 10 μM acetate buffer.
The activity is tested according to the usual standards, ie at pH 4.8, at 50C, after 20 minutes of hydrolysis. The reducing power is determined using the hexaferrocyanide ~

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~ 7 ~

DEHYDRATED SUBSTRATES:
We also deter ~ linear activity of enzymes A, B, C, D, E and F on various dehydrated plant substrates.
The activity was tested at pH 3.3 - 4.8 - 5.8, at 30 C after 24 hours hydrol ~. The reducing power has been determined mined using the dinitro-salic acid technique.

\ Substrates _ ~ _ Pulps _ _ _ \ tested Luzerne Ra ~ -grass Ma ~ s de Paille ~ ellulases \ beets tested \ _ _ ACTIVITY pH (IU / g)

3,3 2~10 223~ 1560 1810 1560 A 4,8 2440 2560 2080 1530 1690 5,~ 1560 2220 1690 1500 1530 ~ _ ~ ,_. ~ .
3,8 1560 1670 1530 1220 1390 B 4,8 1280 2060 1670 1220 1500 5,~ 890 16~0 1940 ~90 1280 . __ _ _ 3,8 1280 1530 1390 1110 1~10 C 4,8 1280 1750 1530 1110 1290 5,8 940 1560 1170 720 1110 . ~
3,8 1390 1440 1~70 127~ 1167 D 4 r ~ 1190 2060 1390 1111 1306 5,~ 890 1720 1530 972 1223 , .. . I __ 3,8 611 llg0 1111 556 694 E 4,8 972 1528 1250 0 694 5,8 0 1167 1278 0 694 . _ _ _ _ _ 3,~1306 1306 500 69~ 556 F 4,8 889 972 1222 610 444 5,3 750 1000 560 550 332 `` ~ 7~

L'anal~se de ces di~é~ents comportements a permis de déterminer llactivité du complexe cellulol~tique à utiliser selon l'invention dans l'ensilage:
On a ainsi trouvé que la cellulase ou le complexe celluloly-tique à ajouter dans le procédé selon l'invention au végétal frais ensilP doit correspondre à une activité Cl de 50 à 0,005 U.I., et une activité Cx de 500 à 0,05 U.I., pour 100 g de végétal, ces activités étant déterrninées à pH 4,8, à 50C, après 20 minutes d'hydrolyse.
En outre, la cellulase choisie doit conserver une activité
importante même aprè~ un long séjour clans le silo.
Il a été démontré, expPrimentalement, que dans des conditions se rapprochant de celles de l'ensilage, le complexe cellulolytique doit conserver, après 10 jours, au moins 30 % de son activité
initiale.

. _ . _ .
Temps de conservation .

en jours 0 5 10 lS 20 _ .
pH 4 8 100%97% 61% 26% 3%
__ __ , _ .
. pH 5,8 100~856 58~ 27% 0~
,.~ . .
La vitesse de clégradation enzymatique de la structure végé-tale est fonction de l'élimination du glucose; ce déplacement d'équilibre enzymatique est obtenu en utilisant des bactéries à
haut pouvoir fermentaire; l'acidifica-tion du milieu est très rapide. Lorsque la masse véyétale est stabilisée, la prolifé-ration bactérienne ainsi que la production d'acide lactique sont stoppées, contrairement à l'activité cellulolytique cle la cellu-lase qui se prolonge plus de 10 jours.
Cet-te activité par la production et l'accumulation cle glu-Z'7~

cose qu'elle engendre au sein de l'ensilage, va augmenter la valeur nutritive du végétal ensiJe.
La composition enzymatique utilisée dans le procédé.selon l'invention comprend donc une cellulase ou un complexe celluloly-tique présentant les caractéristiques ci--dessus, associé aux enzymes décri~es.dans le BF 2.390.908 c'est-à-dire une:amylase fongi~ue, une amylase bactérienne, une amyloglucosidase et un complexe hemicellulolytique.
Ces enz~mes présentes dans la compositi'on ont ainsi une action complémentaire de par leur activité sur les glucides,'des pLus complexe jusqu'aux plus simples, dans des zones de pH ui - pourraient al~er de'7 à 2. Les maxima d'activité pour chaque enzyme se relaient au ur et à mesure de liabaissement du pH, le-~uel ne descend pas au-dessous de pH 3,5 dans le silo, et da~s des intervalles de température variant de 10 à 30C compatibles avec les conditions du silo.
La composition bactérienne selon l'.invention est caractérlsée' par l'utilisation de nouvelLes souches bactériennes utilisables ' dans l''ensilage des végétaux, ces souches pouvant etre utilisées seules ou en mélange avec les souches bactériennes et/ou les enzymes décrits dans l'art antérieur et dans cette présente invention. 'Cette nouvelle composition conduit à des résultats d'ensilage très améliorés. Les nouvelles souches.bactériennes selon la présente invention sont des bactéries gram-; elles appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae, au Groupe Erwinia ou Pectobacterium, au groupe Herbicola; elles sont dé-nommées Enterobacter agglomerans (cLassi~ication Bergey's Manual of Bacteriology, eight edition).
Le tableau ci-après donne les caractéristiques de telle6 bactéries: ~ ~- --~~

TABLEAIJ I

Enterobacter Ag ~omerans (souche déposée le 11.2.80 à l'Institut Pasteur sou5 le No. I-114) Gram - Arabinose Utilisation malonate + Maltose Glucose -~ Trehalose Phenylalamine desaminase - Xylose ONPG ~ Amidon +
Indole - Oxydase H2S - Gélatine -~
LDC - Amygdaline -~
ODC - Mélibiose Uréase - V.P. -~
Saccharose -~ Rhamnose -Arginine dihydrolase Salicine Adonitol - ~, Isositol Sorbitol - ~ ., La mise en oeuvre de ces nouvelles souches de bactéries pour l'ensilage des végétauxr seuls ou en association avec d'autres souches bacterie~ es et/ou enz~ymes, s'efEectue selon les modalités décrites dans l'art antérieur. Les bactéries peuvent être culti-vées sur un support nutritif comprenant des farines de céréales.
La composition à lntroduire dans le silo comprend un mélanye des ;~
bactéries nécessaires déposée,s sur support soluble ou non, avec le mélange des enzymes préconisées dans la présente invention.
Une forme préférée de l'invention consiste à mettre les enzymes et les bactéries sur un support de céréales (blé, orge, orge germé) de préférence sous forme finemen-t broyée.
Une autre forme préférée de l'invention consiste à mette les bactéries et les enzymes sur un suppor-t du type amidon prégélatiné, ~ 11 --:~2'~

maltohexose, etc..., support qui est ~acilement soluble dans l'eau froide.
L'amidon et les autres polysaccharides contenus dans les supports s'ajoutent aux glucides des végétaux et augmentent ainsi la valeur nutritive de l'ensilage. La composition comprenant le mélange de bactéries supportées et le complexe enzymatique déposé ou non sur support de céréales, peut comporter des propor-tions di~férentes de chacun de ces constituants; ce mélange sec renferme une quantité de l'ordre de 100.000 à 1 million de cocci et 100.000 à 1 million de bacilLes/g.
Les quan-tités de cellulase, de complexe hemicellulolytique, d'amylase et d'amyloglucosidase peuvent être variables; elles sont calculées en fonction de la nature du fourrage à traiter.
La quantité de cellulase à ajouter au végétal Erais ensilé
doit correspondre à une activité Cl de 50 à 0,005 U.I. pour 100 g de végétal; elle ~oit donc être de 2 à 2.10 ~ en poids du végétal ~rais dans le cas d'une cellulase titrant 250 ~.I./~. Les pro portions des autres enzymes sont en-tre 0,05 et 0,20 ~ en poids du végétal, d'amylases bactériennes titrant 250 unités/g; entre 0,10 et 0,20 ~ en poids du végétal, d'amylases fongiques titrant 50.000 unités PS 50/g; entre 0,10 et 0,70 ~ en poids du végétal, d'amyloglucosidase titrant 200 unités AG/g; entre 0,OS et 0,20 ~
en poids du végétal, de complexe hemicellulolytique titrant 35.000 U.I./g.
Lorsque les enzymes sont déposées sur support de céréales selon la ~orme préférée de l'invention, le produit à incorporer dans l'ensilage peut contenir 1 kg d'enzymes pour 9 kg de support environ. Dans le cas d'un suppor~ soluble, les rapports de con-centration de l'enzyme par rapport au support changent et peuvent varier de 1/1,5 à 1/4.
Cette incorporation de cellulase dans le suppor-t va au~menter "

la q~antité de sucres fermentescibles disponibles, ce qui induira une production d'acide lactique plus importante et plus rapide.
La protéine vésétale sera ainsi mieux conservée. D'autre part, la valeur nutritive du milieu n'en sera qu'augmentée.
Afin d'illustrer l'intérêt d'un complexe cellulolytique, et de bactéries de la famille des Enterobacteriaceae, des essais ont été réalisés en micro-silos et en mini-silosO Les différents paramètres de conservation sont étud-iés ainsi que ceux traduisant la structure végétale.
1 ssais_realises en m ro-s:ilos Une première série d'expériences a été réalisée au laboratoire en micro-silos.
Ces expérimentations ont été efEectuées au mois de mai, sur de la luzerne: les micro-silos ont une capacité de 1 kg. La luzerne était hachée finement puis ensilée en suivant le proto-cole expérimental ci-après.
A - Une série de micro-silos fut traitée en utilisant l'additif de conservation dont la formule générale est la suivante:.
support céréalier 90 %
prémélanye 10 %
le prémélange étant constitué par:
- un complexe bactérien (5 bactéries lactiques sur support de lactose), - un complexe enzymatique comprenant:
. une amylase d'origine fongique;
. une amylase d'origine bactérienne;
. une amyloglucosidase;
. un complexe hemicellulolytique dlorigine fongique possédant comme activité principale une activité galactomannanasique;
- un suppor-t riche en énergie: orge finement moulue ~ lactosérum;
et les complexes bactérien et enzymatique entrant chacun pour ' ~27~

1 % dans la composi-tion du premélange.
L'additif de conservation fut additionné à la luzerne au taux de 2 % ~le taux d'incorporation du prémélange étant donc de 0,2 %) et on y ajoutait également 1 % d'orge.
B - Une série de micro-silos fut traitée avec le même additif de conservation qu'en A, mais en y ajoutant une cellulase d'origine fongique (provenant de Trichoderma viride) présentant une activité
Cl de 250 unités/g et une activité Cx de 2.500 unités/g (activités déterminées à pH 4,~, à 50C, pour un temps de réaction de 20 minutes) le taux d'incorporation de cette cellulase était de 2g/T
~soit 2.10 % en poids) par rapport au végétal frais (essai B) et de 200g/T (soit 0,02%) par rapport au végétal Erais (essai B').
C - Une série de rnicro si.los témoins:
- une sér:ie de micro-silos de luzerne ne contenant aucun conservateur: T = O.
Après 100 jours d'ensilage, les micro-silos étaient ouverts, les paramètres suivants furent suivis: pH, acide lactique, NH3/N :
total. Les résultats sont donnés dans le tableau suivant:

pH Acide lactique NH3/N tota].
. _ en g/kg MS _ _ _ _. ~ .

..... ~ .i. - Témoln T = O 5,66 26 g ~s,l5 .
Luzerne ~ 0,2 % de prémélange (A) 4,13 143,68 16,33 .

Luzerne ~ 0,2 "6 de prémélange -~ 4,32 144,75 16,20 cellulase d'origine fongique 2 g/T (B) _ ~__ _ . _ _ Luzerne ~ 0,2 % de prémélange + 3,73 169,47 15,02 cellulase d'origine fongique 200g/T (B') . .
_. _ .

; : , , , ~

7~

~ .
On constate que l'adjonction d'une cellulase au complexe bactéries + enzymes selon le brevet 2.390.908 a pour résultat ~ne amélloration des performances .de l'addit.if de conservation. On obtient une meilleure conservation du végétal qui se traduit, si l'on compare A e.t B' par: :
- une dLminution du pH: 4,13 3,73 (diminution de 10-%
- une augmentation de la production d'acide lactique de 15 ~
- une~diminution de 8 ~ du rapport NH3/N total; ce fait traduit une meilleure conservation de la protéine végétale, conséquence : d'une adicification rapide du milieu.
2 - Essals réalisés en mini-silos Ces essais ont été e~fectués pendant le mois de juin sur de . la luzerne dans des mini~silos d'une capacité de 150 kg.
La luzerne était hachée finement, puis soumise à l'ensilage en suivant le protocole expérimental ci-dessous.
A - Une série de mini-silos fut traitée en utilisant le même .~.
- additif de conservation que pour les micro-silos en A, la dose d'incorporation étant de 0,2 ~ de prémélange.
B - Une série de mini-silos fut traitée en utilisant la formule et la dose indiquées en A à laquelle on a additionné.la même cellulase d'origine fongique a la dose de 2 g/T.
Après 10,0 jours d'ensilage, les mini-silos sont ouverts,__ __ l'analyse des ensilages a conduit aux résultats.suivants:~
. . ____ . .. . _ _ , . _ _ I .. _ _ . . _.. . ,.. ... ; .

~ .~7~

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~'7~
., Les résultats ci-dessus démontrent plelnement l'intérêt de l'addition d'une cellulase au complexe bactéries ~ enzymes décrites dans le breve-t 2.390.908.
Cette addition produit:
- un pH plus faible 3,94 contre ~,20 (moins 6 %) - une quantité plus importanke d'acide lactique (plus 29,53 ~) - la partie protéique de l'ensilage est;bien mieux conservée lorsque l'on supplémente par une cellulase; ceci est confirmé
par l'analyse. On a dans ce ~as:
ln - un rapport N113/N total plus faible (moins 27,6 %) - un taux protéique plus élevé (plus 6 ~) - un taux d'azote ammoniacal plus faihle (moins 20,1 ~) Cette plus grande vitesse d'acidification peut s'expliquer par le fait que les bactéries vont disposer plus rapidement d'une masse irnportante de sucres Eern~entescibles facilement~ transor-~ables en acide lackique. Dans cette disponibilité, on retrouve l'efEet de la cellulase introduite dans le milieu.
Dans les exemples qui suivent, le mélange sur support selon le procédé de la présente invention est constitué par le complexe décrit dans le brevet Erançais 2.361.828 et/ou le brevet 2.390.908, le complexe enzymatique décrit dans :la présente invention, auq~el on ajoute des bacilles gram-, de la famille des Enterobacteriaceae, genre Erwinia ou Pectobacterium, groupe Herbicola, le taux d'incorporation de ces bacilles dans le mélange correspond à 105 à 106 bacilles/g.
EXEMPLES
Des essais ont été effectués dans des silos de ~ m3 de ; capaci-té sur du dactyle LuciEer récolté en juin, en début d'épiaison. Le fourrage finement haché est soumis à stockage dans 3.3 2 ~ 10 223 ~ 1560 1810 1560 A 4.8 2440 2560 2080 1530 1690 5, ~ 1560 2220 1690 1500 1530 ~ _ ~, _. ~.
3.8 1560 1670 1530 1220 1390 B 4.8 1280 2060 1670 1220 1500 5, ~ 890 16 ~ 0 1940 ~ 90 1280 . __ _ _ 3.8 1280 1530 1390 1110 1 ~ 10 C 4.8 1280 1750 1530 1110 1290 5.8 940 1560 1170 720 1110 . ~
3.8 1390 1440 1 ~ 70 127 ~ 1167 D 4 r ~ 1190 2060 1390 1111 1306 5, ~ 890 1720 1530 972 1223 , ... I __ 3.8 611 llg0 1111 556 694 E 4.8 972 1528 1250 0 694 5.8 0 1,167 1,278 0 694 . _ _ _ _ _ 3, ~ 1306 1306 500 69 ~ 556 F 4.8 889 972 1222 610 444 5.3 750 1000 560 550 332 `` ~ 7 ~

The analysis of these different behaviors made it possible to determine the activity of the cellulol ~ tick complex to be used according to the invention in silage:
It has thus been found that the cellulase or the celluloly-tick to be added in the process according to the invention to the fresh plant ensilP must correspond to a Cl activity of 50 to 0.005 IU, and a Cx activity of 500 to 0.05 IU, per 100 g of plant, these activities being determined at pH 4.8, at 50C, after 20 minutes hydrolysis.
In addition, the selected cellulase must retain activity important even after a long stay in the silo.
It has been shown, experimentally, that under conditions approaching those of silage, the cellulolytic complex must keep, after 10 days, at least 30% of its activity initial.

. _. _.
Storage time.

in days 0 5 10 lS 20 _.
pH 4 8 100% 97% 61% 26% 3%
__ __, _.
. pH 5.8 100 ~ 856 58 ~ 27% 0 ~
,. ~. .
The rate of enzymatic clustering of the plant structure tale is a function of the elimination of glucose; this displacement of enzyme balance is achieved by using bacteria to high fermentation power; the acidification of the medium is very fast. When the body mass is stabilized, the proliferation bacterial ration as well as lactic acid production are stopped, unlike the cellulolytic activity of the cell lase which lasts more than 10 days.
This activity through the production and accumulation of glu-Z'7 ~

that it generates within the silage, will increase the nutritional value of the whole plant.
The enzyme composition used in the process.
the invention therefore comprises a cellulase or a celluloly-tick with the above characteristics, associated with enzymes described ~ es. in the BF 2,390,908 i.e. a: amylase fungal, a bacterial amylase, an amyloglucosidase and a hemicellulolytic complex.
These enzymes present in the composition thus have a complementary action through their activity on carbohydrates, MOST complex to the simplest, in pH zones ui - could range from 7 to 2. The maximum activity for each enzyme take turns with ur and as the pH drops, the-~ uel does not drop below pH 3.5 in the silo, and da ~ s compatible temperature ranges from 10 to 30C
with the silo conditions.
The bacterial composition according to the invention is characterized.
by the use of new, usable bacterial strains' in plant silage, these strains can be used alone or mixed with the bacterial strains and / or enzymes described in the prior art and in this present invention. 'This new composition leads to results much improved silage. New bacterial strains according to the present invention are gram- bacteria; they belong to the Enterobacteriaceae family, to the Group Erwinia or Pectobacterium, to the Herbicola group; they are de-called Enterobacter agglomerans (cLassi ~ ication Bergey's Manual of Bacteriology, eight edition).
The table below gives the characteristics of such6 bacteria: ~ ~ - - ~~

TABLEAIJ I

Enterobacter Ag ~ omerans (strain deposited on 11.2.80 at the Institute Pastor sou5 No. I-114) Gram - Arabinose Malonate + Maltose use Glucose - ~ Trehalose Phenylalamine desaminase - Xylose ONPG ~ Starch +
Indole - Oxidase H2S - Gelatin - ~
LDC - Amygdalin - ~
ODC - Melibiosis Urease - VP - ~
Sucrose - ~ Rhamnose -Arginine dihydrolase Salicin Adonitol - ~, Isositol Sorbitol - ~., The implementation of these new strains of bacteria for plant silage alone or in combination with others strains of bacteria and / or enzymes, is carried out according to the procedures described in the prior art. Bacteria can be grown vées on a nutritious support comprising cereal flours.
The composition to be introduced into the silo comprises a melanyin of; ~
necessary bacteria deposited, s on a soluble support or not, with the mixture of enzymes recommended in the present invention.
A preferred form of the invention consists in putting the enzymes and bacteria on a grain carrier (wheat, barley, germinated barley) preferably in finely ground form.
Another preferred form of the invention consists in putting the bacteria and enzymes on a pregelatin starch-type suppor-t, ~ 11 -: ~ 2 '~

maltohexose, etc ..., support which is ~ readily soluble in cold water.
The starch and other polysaccharides contained in carriers add to plant carbohydrates and thus increase the nutritional value of the silage. The composition including the mixture of supported bacteria and the enzyme complex whether or not deposited on a cereal support, may contain di ~ different from each of these constituents; this dry mix contains a quantity of the order of 100,000 to 1 million cocci and 100,000 to 1 million bacilli / g.
Quantities of cellulase, hemicellulolytic complex, amylase and amyloglucosidase can be variable; they are calculated according to the nature of the forage to be treated.
The amount of cellulase to add to the plant must correspond to a Cl activity of 50 to 0.005 IU per 100 g vegetable; it ~ must therefore be 2 to 2.10 ~ by weight of the vegetable ~ rais in the case of a cellulase grading 250 ~ .I. / ~. Professionals portions of the other enzymes are between 0.05 and 0.20 ~ by weight vegetable, of bacterial amylases grading 250 units / g; between 0.10 and 0.20 ~ by weight of the plant, of fungal amylases titrating 50,000 PS 50 units / g; between 0.10 and 0.70 ~ by weight of the vegetable, amyloglucosidase grading 200 AG units / g; between 0, OS and 0.20 ~
by weight of the plant, of hemicellulolytic complex grading 35,000 IU / g.
When the enzymes are deposited on a cereal support according to the preferred elm of the invention, the product to be incorporated in the silage can contain 1 kg of enzymes for 9 kg of support about. In the case of a soluble suppor ~, the con-centering of the enzyme in relation to the support changes and can vary from 1 / 1.5 to 1/4.
This incorporation of cellulase in the suppor-t goes to lie ~

"

the quantity of fermentable sugars available, which will induce higher and faster lactic acid production.
The bladder protein will thus be better preserved. On the other hand, the nutritional value of the environment will only be increased.
In order to illustrate the interest of a cellulolytic complex, and of bacteria from the Enterobacteriaceae family, trials have been made in micro-silos and mini-silosO The different conservation parameters are studied as well as those reflecting the plant structure.
1 ssais_realises en m ro-s: ilos A first series of experiments was carried out in the laboratory in micro-silos.
These experiments were carried out in May, on alfalfa: micro-silos have a capacity of 1 kg. The alfalfa was finely chopped and then ensiled following the proto-experimental school below.
A - A series of micro-silos was treated using the additive The general formula is as follows :.
cereal support 90%
premelanye 10%
the premix consisting of:
- a bacterial complex (5 lactic acid bacteria on lactose), - an enzymatic complex comprising:
. an amylase of fungal origin;
. an amylase of bacterial origin;
. an amyloglucosidase;
. a hemicellulolytic complex of fungal origin having as main activity a galactomannanasic activity;
- an energy-rich suppor: finely ground barley ~ whey;
and the bacterial and enzymatic complexes each entering for '' ~ 27 ~

1% in the composition of the premix.
The preservative was added to the alfalfa at rate of 2% ~ the rate of incorporation of the premix therefore being 0.2%) and 1% barley was also added.
B - A series of micro-silos was treated with the same additive of conservation as in A, but adding an original cellulase fungal (from Trichoderma viride) with activity Cl of 250 units / g and a Cx activity of 2,500 units / g (activities determined at pH 4, ~, at 50C, for a reaction time of 20 minutes) the incorporation rate of this cellulase was 2g / T
~ or 2.10% by weight) relative to the fresh vegetable (test B) and 200g / T (0.02%) compared to the plant Erais (test B ').
C - A series of micro si.los witnesses:
- a ser: ie of alfalfa micro-silos containing no preservative: T = O.
After 100 days of silage, the micro-silos were open, the following parameters were followed: pH, lactic acid, NH3 / N:
total. The results are given in the following table:

pH Lactic acid NH3 / N tota].
. _ in g / kg DM _ _ _ _. ~.

..... ~ .i. - Témoln T = O 5.66 26 g ~ s, l5.
Alfalfa ~ 0.2% of premix (A) 4.13 143.68 16.33.

Alfalfa ~ 0.2 "6 from premix - ~ 4.32 144.75 16.20 original cellulase fungal 2 g / T (B) _ ~ __ _. _ _ Alfalfa ~ 0.2% of premix + 3.73 169.47 15.02 original cellulase fungal 200g / T (B '). .
_. _ .

; :,,, ~

7 ~

~.
We see that the addition of a cellulase to the complex bacteria + enzymes according to patent 2,390,908 results ~ ne performance improvement. of the conservation additive. We obtains a better conservation of the plant which results, if we compare A and B 'by::
- a decrease in pH: 4.13 3.73 (decrease of 10-%
- an increase in the production of lactic acid by 15 ~
- a ~ decrease of 8 ~ in the total NH3 / N ratio; this translated fact better conservation of vegetable protein, consequence : rapid addiction of the environment.
2 - Tests carried out in mini-silos These tests were carried out during the month of June on . alfalfa in mini ~ silos with a capacity of 150 kg.
The alfalfa was finely chopped, then subjected to silage following the experimental protocol below.
A - A series of mini-silos was treated using the same. ~.
- conservation additive only for micro-silos in A, the dose of incorporation being 0.2 ~ premix.
B - A series of mini-silos was processed using the formula and the dose indicated in A to which the same was added.
cellulase of fungal origin at a dose of 2 g / T.
After 10.0 days of silage, the mini-silos are open, __ __ the analysis of the silages led to the following results: ~
. . ____. ... _ _,. _ _ I .. _ _. . _ ... , .. ...; .

~. ~ 7 ~

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.

~ '7 ~
., The above results fully demonstrate the interest of the addition of a cellulase to the bacteria ~ enzymes complex described in patent 2,390,908.
This addition produces:
- a lower pH 3.94 against ~, 20 (minus 6%) - a larger quantity of lactic acid (more 29.53 ~) - the protein part of the silage is; much better preserved when supplementing with a cellulase; this is confirmed by analysis. We have in this ~ as:
ln - a lower total N113 / N ratio (minus 27.6%) - a higher protein level (plus 6 ~) - a lower ammoniacal nitrogen level (minus 20.1 ~) This higher rate of acidification can be explained by the fact that bacteria will have a faster significant mass of Eern sugars ~ easily entangled ~ trans-~ lacking in lackic acid. In this availability, we find the effect of the cellulase introduced into the medium.
In the examples which follow, the mixture on a support according to the process of the present invention consists of the complex described in the French patent 2,361,828 and / or the patent 2,390,908, the enzyme complex described in: the present invention, to which we add bacilli gram-, from the family of Enterobacteriaceae, genus Erwinia or Pectobacterium, group Herbicola, the rate of incorporation of these bacilli in the mixture corresponds to 105 to 106 bacilli / g.
EXAMPLES
Tests were carried out in silos of ~ m3 of ; capacity on LuciEer cocksfoot harvested in June, early heading. Finely chopped forage is stored in

4 conditions:

A: ensilage sans traitement . . . .

~ 7~

B: ensilage réalisé avec 4 litres d'acide formique/tonne, à la manière connue de l'art antérieur C: ensilage réalisé avec le prémélange dont la composition - est donnée dans les brevets Erançais 2.361.~28 et 2.390.908: ensilage additionné de 7 kg de la culture de 7 bactéries sur support dont les caractéristiques sont indiquées dans le brevet fran~ais 2.361.828, page 7, N l à 7, et d'enzymes: dose d'incorpora-tion lO kg/tonne.
D: ensilage réalisé avec le prémélange suivant C auquel sont ra~butés des bacilles selon l'invention: bactéries gram~, de la famille des Enterobacteriaceae du genre Erwinia ou Pectobacterium, du groupe Herbicola dénomm~es I,nterobacter agglomerans. Dose d'incorporation du complexe lO Icg/T.
Après 90 à lO0 jours, les différents ensilages sont ouverts, et les analyses des végétaux sont effectués. Elles conduisent aux résultats ci-après (Tableau II).

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~) (~1 -1-) Q ~I -1-) r-¦ ~--Q r-¦
I (I~ ~ ~ ~ ~
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La comparaison des résultats permet de constater que le mélange suivant les brevets rançais 2.36:L.828 et 2~390~908 apportait déjà une amélioration dans la conservation de l'ensilage, ceci se traduisant par:
- un abaissement du pH qui passait de 5,28 à 4,02 -- une teneur en acide lactique plus élevée qui passait de 23 à 90 g/kg de MS
- une meilleure protection p.rotéique qui se traduit par une diminution du ràpport N-NH3 qui passait de 17,76 à 14 :
N total et du rapport N soluble qui passait de 63,80 à 48,10 Ce mélange présentait l'avantage de ne donner lieu à aucune formation d'acide propionique et d'acide butyrique.
Le mélange suivant la présente invention apporte une amélioration supplémentaire se traduisant par:
- un abaissement du pH qui passe de 4,02 à 3,70 - une teneur en acide lactique plus élevée qui passe de 90 g à 112 g/kg de MS
- une meilleure protection protéique qui se traduit par une diminution du rapport N-NH3/N total. Celui-ci passe de 14 à 8 et du rapport N soluble/N total, Celui-ci passe de 48,10 à 44.
Ce mélange présente l'avantage de ne donner lieu à aucune fermentation dlacide propionique et d'acide butyrique.
Les digestibilité et l'ingestibilité de ces ensilages ont été mesurées sur des moutons; après les divers traitements, il a été trouvé:
B: traitement à l'acide formique; 0,64 UF/kg C: traitement suivant les brevets français 2.361.828 et ~ :
2.390.908 : 0,74 UF/kg D: traitement suivant l'invention: 0,82 UF/kg Le bilan azoté sur animaux en croissance conduit à des .~ - 20 -résultats montrant l'intérêt des traitements avec des produits d'ensilage selon la présente-invention comme on peut le voir dans le tableau III~

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La rétention azo-tée dans le cas de la présente invention -est plus que doublée par rapport à celle q~e l'on obtient après trai~ement à l acide formique ~ V

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A: silage without treatment . . . .

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B: silage produced with 4 liters of formic acid / ton, in the manner known from the prior art C: ensilage made with the premix whose composition - is given in the French patents 2,361. ~ 28 and 2,390,908: silage added with 7 kg of the crop 7 bacteria on a support whose characteristics are indicated in the French patent ~ ais 2,361,828, page 7, N l to 7, and of enzymes: incorporation dose lO kg / ton.
D: ensilage made with the premix according to C to which are ra ~ abutments of bacilli according to the invention: bacteria gram ~, from the family Enterobacteriaceae of the genus Erwinia or Pectobacterium, from the Herbicola group called ~ es I, nterobacter agglomerans. Dose of incorporation of lO Icg / T complex.
After 90 to 10 days, the different silages are opened, and plant analyzes are performed. They drive to the results below (Table II).

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A comparison of the results shows that the mixture according to French patents 2.36: L.828 and 2 ~ 390 ~ 908 was already improving the conservation of silage, this resulting in:
- a lowering of the pH which went from 5.28 to 4.02 - a higher lactic acid content which went from 23 to 90 g / kg DM
- better prototeic protection which results in a decrease in the N-NH3 ratio from 17.76 to 14:
Total N
and the soluble N ratio which went from 63.80 to 48.10 This mixture had the advantage of not giving rise to any formation of propionic acid and butyric acid.
The mixture according to the present invention provides a additional improvement resulting in:
- a drop in pH from 4.02 to 3.70 - a higher lactic acid content which increases from 90 g at 112 g / kg DM
- better protein protection which results in a decrease in the total N-NH3 / N ratio. This one goes from 14 to 8 and the soluble N / total N ratio, this goes from 48.10 to 44.
This mixture has the advantage of not giving rise to any fermentation of propionic acid and butyric acid.
The digestibility and the ingestion of these silages have been measured on sheep; after the various treatments, he been found:
B: treatment with formic acid; 0.64 UF / kg C: treatment according to French patents 2,361,828 and ~:
2,390,908: 0.74 UF / kg D: treatment according to the invention: 0.82 UF / kg The nitrogen balance on growing animals leads to . ~ - 20 -results showing the value of treatments with products silage according to the present invention as can be seen in table III ~

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Azo-retention in the case of the present invention -is more than doubled compared to that q ~ e we obtain after formic acid treatment ~ V

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. - 23 ~

Claims

The embodiments of the invention, about which an exclusive right of property or privilege is claimed, are defined as follows:

1. Method of conservation and recovery of green plants by lactic acidification which includes the ad-junction with these plants before silage a factor of gradation of higher carbohydrates into fermentable carbohydrates usable by bacteria producing lake fermentation tick, this factor being constituted by a complex of enzymes and / or by a bacteria complex characterized in that the enzyme complex includes, associated with a fungal amylase, bacterial amylase, amyloglucosidase, hemicellulolytic complex of fungal origin having as main activity a galactomannanasic activity, a cellulase or cellulolytic complex of fungal origin, capable of degrading native cellulose into glucose and having C1 activity from 50 to 0.005 international units and a Cx activity of 500 to 0.05 international units per 100 g fresh vegetable and preserved under the conditions of silage at least 30% of this activity after 10 days, and in this that the bacterial complex includes, associated or not with a fungal amylase, to a bacterial amylase, to an amylo-glucosidase, to a hemicellylolytic complex of fungal origin gic having as main activity a galac- activity tomannanasic, gram bacteria that ferment starch but do not ferment family owned maltose Enterobacteriaceae, genus Erwinia or Pectobacterium, Herbicola group being called Enterobacter agglomerans No. I-114).

2. Method according to claim 1 characterized in that bacteria of the Enterobacteriaceae family are used in combination with bacteria known to the prior art capable of degrading higher carbohydrates, in fermentable carbohydrates.

3. Method according to one of claims 1 to 2, characterized in that bacteria of the Enterobacteriaceae family are used in combination with gram + bacteria which ferment starch, glucose, mannitol, rahmnose, sucrose, amygdalin, arabinose and do not ferment the maltose, inositol, sorbitol.

4. Method according to claim 1, characterized in that the enzyme mixture consists of:
2.10-4 to 2% cellulase grading 250 IU of C1 activity / g 0.05 to 0.20% bacterial amylase grading 250 units / g 0.10 to 0.20% fungal amylase grading 5,000 units PS 50 / g 0.10 to 0.70% of amyloylucosidase grading 200 AG units / g, 0.05 to 0.20% of hemicellulolytic complex titrating 35,000 IU / g the% being calculated by weight relative to the plant, ensiled.

5. Method according to one of claims 1 to 2, character-laughed at in that the enzymes are incorporated on a carrier cereals at a rate of approximately 1 kg of enzymes for 9 kg of support.

6. Method according to claim 1, characterized in that the bacteria are grown on a support comprising cereal flours.

7. Method according to one of claims 1 to 2, character-laughed at that bacteria and bacteria and enzymes are incorporated on a support of the cereal starch type, pregelatinated starch, malto-hexose, soluble in cold water, in the proportion of 1 kg of bacteria and enzymes for 1.5 to 4 kg of support.

8. Method according to one of claims 1, 4 or 6 charac-laughed at that the amounts of enzymes and bacterial culture with their support, in the dry state, added per tonne of plants to be ensiled are from 10 to 15 kg, this additive containing from 105 to 106 live germs per gram.

9. Composition for the conservation and enhancement of green plants which include strains of bacteria producing lactic acid, and a degradation factor of higher carbohydrates in fermentable carbohydrates, consisting of an enzyme complex and / or a bacteria complex, characterized in that the enzyme complex comprises associated or not to a fungal amylase, to a bacterial amylase, to an amyloglucosidase, to an original hemicellulolytic complex fungal having as main activity an activity galactomannanasic, a cellulase or cellulolytic complex of fungal origin, capable of degrading native cellulose into glucose and having a C1 activity of 50 to 0.005 international units and a Cx activity of 500 to 0.05 international units per 100 g of fresh vegetable and stored under the conditions of silage at least 30% of this activity after 10 days and in that the bacterial complex includes gram bacteria -which ferment starch but do not ferment maltose, belonging to the family of Enterobacteriaceae, genus Erwinia or Pectobacterium, group Herbicola, being called Enterobacter Agglomerates (No. I-114).

10. Composition according to claim 9 characterized in that that Gram - Enterobacteriaceae bacteria are associated with bacteria capable of breaking down higher carbohydrates into sugars fermentable, and in particular gram + bacteria which ferment starch, glucose, mannitol, rahmnose, sucrose, and amygdalin, arabinose, and do not ferment maltose, inositol, sorbitol.