DE2919127C2

DE2919127C2 - Mittel zur Verringerung des Phenylalaningehalts

Info

Publication number: DE2919127C2
Application number: DE2919127A
Authority: DE
Inventors: Francesco Bartoli; Roberto Gianna; Walter San Donato Milanese Marconi; Franco Morisi; Giuseppina Roma Spotorno
Original assignee: Anic SpA
Current assignee: Anic SpA
Priority date: 1978-05-12
Filing date: 1979-05-11
Publication date: 1982-10-21
Also published as: GB2020668A; HU181954B; IL57251A; LU81242A1; AU521742B2; US4248704A; IL57251A0; CA1130206A; DK182479A; CS214795B2; BE876204A; FR2425246B1; NL7903789A; GB2020668B; AU4689579A; DE2919127A1; DD143730A5; IT1096208B; ZA792249B; IT7823336A0

Description

Es ist bekannt, daß Phenylalanin eine essentielle Aminosäure ist. Diese Aminosäure spielt jedoch nicht nur eine Rolle bei der Synthese von Proteinen, sondern sie ist auch zusammen mit Tyrosin die Grundsubstanz für die Synthese von Brenzcatechinaminen, Adrenalin, Schilddrusenhormonen (Trijod- und Tetrajodthyrosin) und dem physiologischen Pigment Melanin..

Die erste Stufe für die Bildung dieser Substanzen ist die Oxidation von Phenylalanin und Tyrosin, die in der Leber durch die Einwirkung von Phenylalaninhydroxylase stattfindet.

Die Blockierung dieser enzymatischen Reaktion führt zu einer Ansammlung von Phenylalanin im Blut. Dadurch wird ein alternativer katabolischer Weg eingeschlagen, der nach Transaminierung von Phenylalanin zu Phenylbrenztraubensäure zu Phenylessigsäure führt, die durch die Hamwege ausgeschieden wird.

Eine derartige metabolische Blockierung ist in der Medizin als Phenylketonurie oder Phenylbrenztraubensäurekrankheit oder auch als Föllingsche Krankheit bekannt. Dabei handelt es sich um eine angeborene, erbliche Krankheit, die einfach rezessiv vererbt wird und die ohne Unterschied beide Geschlechter befällt, insbesondere in nordeuropäischen Ländern. Sie führt zu einer Verzögerung der geistigen Entwicklung, zu Krämpfen, Exzemen und fehlerhafter Hautpigmentierung.

Ein zu hoher Gehalt an Phenylalanin verändert andererseits den Metabolismus sowohl von Tryptophan als auch Tyrosin.

Die Oxidation von Tryptophan wird gehindert unter gleichzeitiger Aufspaltung des Indolringes und Bildung von Formylkynurein bzw. Hydroxylierung zu 5-Hydroxytryptophan und Decarboxylierung dieser Verbindung zu 5-Hydroxytryptamin.

Tryptophan muß so einen weiteren metabolischen Weg zur Verfügung haben, der die Ausscheidung von Indolbrenztraubensäure, Indolmilchsäure und Indolessigsäure durch die Harnwege in Mengen umfaßt, die zwanzigmal höher liegen als bei gesunden Personen.

Ein Überschuh an Phenylalanin hemmt die Tyrosinase und damit die Bildung von Melanin.

Phenylbrenztraubensäure hemmt andererseits mindestens teilweise die Oxidation von Tyrosin zu Gentisinsäure und die Bildung von Brenzkatechinaminen aufgrund der Hemmung der Dopa-decarboxylase.

Die Pathogenese der geistigen Störungen ist vermutlich weniger einer direkten toxischen Wirkung von Phenylalanin auf den zerebralen Metabolismus zuzuschreiben, als der verminderten Produktion von neurohumoralen Substanzen, die für eine normale Entwicklung der Hirnfunktionen wichtig sind, wie Serotonin und Brenzcatechinamine.

Die bisherige Behandlung besteht lediglich in einer

Diät. Es wird eine phenyialaninarme Diät angewandt, bei dar der Gehalt an Phenylalanin im allgemeinen unter 10 bis 30 mg/kg und Tag gehalten werden muß. Zu diesem Zwecke werden Proteinhydroüsate mit einem gsringen prozentualen Phenylaianingehalt angewandt.

Einige Autoren vermuten, daß die Ausschaltung von Phenylalanin die Entwicklung von Leukämiezellen verringern kann. Es wäre theoretisch möglich, den Phenyb.laningehalt im Blut zu verringern. Tatsächlich gibt es ein Enzym, die Phenylalaninammoniaklyase, die Phenylalanin zu Zimtsäure und Ammoniak umwandelt. Es ist jedoch leider nicht möglich, «in derartiges Enzym direkt in den Blutkreislauf einzuführen, da dieses Enzym einen stark antigenen Charakter besitzt, der nach ein oder zwei Verabreichungen zu einer schnellen Ausschaltung des Enzyms führt (s. z. B. R. R. Fritz, D. S. Hodgins und C. W. Abell in J. of Biol. Chem. Bd. 251, S. 4646, 1976). Diese Autoren haben das Enzym an Versuchstiere verabreicht und es hat sich gezeigt, daß die bei der ersten Verabreichung erzielten Halbwertzeiten (22 Stunden) bei anschließenden Verabreichungen wesentlicher kürzer werden. Gleichzeitig wird das Vorhandensein eines Antikörpers, der für dieses Enzym spezifisch ist, beobachtet.

Aus der IT-PS 836 462 ist es bekannt, Enzyme in porösen Fasern wie Cellulosetriacetat zu immobilisieren. In der DE-OS 28 12 174 wird vorgeschlagen, Fasern wie Cellulosetriacetat durch Zusatz eines die Plättchenaggregation verhindernden Mittels, wie 4,5-Diphenyl-2-bis(2-hydroxy-äthyl)aminooxazol zu der polymeren Phase biologisch verträglich zu machen.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Mittel zu entwickeln, mit dessen Hilfe es möglich ist, den Phenylalaningehalt im Blut zu verringern ohne daß das Enzym-Abstoßungs-Phänomen auftritt, d. h. ohne daß Antikörper gegen das Enzym Phenylalaninammoniaklyase gebildet werden. Außerdem sollte dieses Mittel auch anwendbar sein, um den Phenylalaningehalt in Lebensmitteln zu verringern.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein biologisch verträgliches Mittel zur Verringerung des Phenylalaningehalts im Blut oder in phenylalaninhaltigen Lebensmitteln, enthaltend als Wirkstoff Phenylalaninammoniaklyase, die in biologisch verträglich gemachten Cellulosetriacetatfasern immobilisert ist.

Mit Hilfe dieses Mittels ist es möglich den Phenylalaningehalt im Blut zu verringern, ohne daß das Enzym in freier Form mit dem Blut in Berührung kommt. Durch das hohe Verhältnis von Oberfläche zu Volumen wird die Diffusionswirkung weitgehend verringert. Bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Mittels werden Probleme wie Adhäsion der Blutplättchen, Bildung von Thromben und ähnliches verhindert.

Schließlich kann das Produkt zur Behandlung von Proteinhydrolysaten angewandt werden, die als Nahrungsmittel verwendet werden, um den Phenylalaningehalt auf einen Bereich zu verringern, wie er bei Patienten mit Phenylketonurie toleriert werden kann.

Bisher umfaßte die Herstellung von Nahrungsmitteln, die für Patienten mit Phenylketcnurie geeignet sind, mühsame chromatographische Trennungsstufen von Proteinhydrolysaten und die anschließende Rekonstituierung eines entsprechenden proportionalen Gemisches, von dem das Phenylalanin ausgeschlossen

ist. Im Gegensatz dazu ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Mittels möglich, Phenylalanin von Proteinhydrolv&aten durch einfache Behandlung dieser Hydrolysate mit den oben erwähnten Fasern zu entfernen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Zu einer Lösung aus 20 g Cellulosetriacetat und 7 g 4,5-Diphenyl-2-bis(2-hydroxyäthyl)aniinooxazol in 930 ml Methylenchlorid wurden bei 2° C140 ml einer Lösung von Phenylalaninammoniaklyase in einem Trispuffer (0,05 m HCl, pH 7,5) enthaltend 30% Glycerin, gegeben. Die Enzymlösung war erhalten worden durch Extraktion des Enzyms von Rhodotorula glutinis und Reinigung durch Ausfällen mit Protaminsulfat, Ammoniumsulfat und Natriumeitrat bis auf eine spezifische Aktivität von 2,1 μΜοΙ/min mg Protein.

Die Aktivität der Lösung betrug 113 Einheiten/ml.

Durch Rühren wurde eine Emulsion erhalten, die dann unter Stickstoffdruck durch eine Spinndüse in ein Koagulationsbad aus Toluol exdrudiert wurde. In dem Toluolbad entstand durch Koagulation des Polymers eine Faser, die auf Trommeln aufgenommen und zur Entfernung des Lösungsmittels mit Stickstoff behandelt wurde.

2 g der Faser wurden dann als Wickel in ein Nylonrohr mit einem Innendurchmesser von 7 mm und einer Länge von 500 mm eingebracht. Die Wände des Nylonrohrs waren vorher, nach dem in der DE-OS 2833072 beschriebenen Verfahren behandelt worden, um sie nicht-thrombogen zu machen.

Ein zweiter enzymatischer Reaktionskörper wurde wie oben angegeben hergestellt.

Die beiden Reaktionskörper wurden in Serie miteinander verbunden und in ein System eingesetzt, das aus einem Reservoir, das thermostatisch auf 37° C gehalten wurde und einer peristaltischen Pumpe und natürlich den beiden Reaktionskörpern bestartd. In das Reservoir wurden 400 ml Blut gegeben, das mit Natriumcitrat versetzt war und 0,7 μΜοΙ Phenylalanin/ml enthielt.

Das Blut wurde mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/sec durch die Reaktionskörper geleitet. Die Bestimmung des Phenylaianingehalts im Blut wurde in bestimmten Zeitabständen durchgeführt. Die dabei erhaltenen Werte sind in der folgenden Tabe'le angegeben:

Zeit (Minuten)	Phenylalanin (μΜοΙ/ml)
0	0,70
15	0,55
30	0,42
60	0,23
90	0,07

Diese Tabelle zeigt, daß unter den angewandten Bedingungen Phenylalain in ungefähr 90 min aus dem Blut entfernt wird. Der Versuch wurde 6mal mit den gleichen Reaktionskörpern wiederholt und die gesamte Entfernung von Phenylalanin wurde jeweils in 90 min erreicht.

Beispiel 2

Zwei enzymatische Reaktionskörper wurden wie in Beispiel 1 hergestellt und in Serie für einen Blutkreislauf außerhalb des Körpers angewandt, indem Blut aus der Oberschenkelarterie entnommen und nach ü Durchfluß durch die enzymatischen Reaktionskörper in die Oberschenkelvene eingeleitet wurde. Vor dem Durchgang durch die Reaktionskörpe.r waren 0,1 μΜοΙ/ml Phenylalanin in dem Blut enthalten. Nach 12& min war der Gehalt an Phenylalanin nahe-

Vi ZU 0.

Beispiel 3

Eine Faser war entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden, wobei jedoch kein die Plättchenanlagerung verhinderndes Mittel zugesetzt worden war.

5 g Faser wurden in ein thermostatisch reguliertes, rohrförmiges Gefäß mit einem Durchmesser von 40 mm und einer Höhe von 220 mm gegeben. In das ReaktionsgefäS wurde ein Caseinhydrolysat in einer •«ι Konzentration von 0,4% in Phosphatpuffer (0,01 m, pH 7,5) mit einer Geschwindigkeit von 600 ml/h eingeleitet: die Konzentration an Phenylalanin betrug 0,62 μΜοΙ/ml und diejenige an Tyrosin 0,45 μΜοΙ/ml. Bei der aus der Säule austretenden Flüssigkeit betrug die Konzentration an Phenylalanin 0,04 μΜοΙ/ml und die Konzentration an Tyrosin 0,05 μΜοΙ/ml.

Claims

Patentanspruch:

Biologisch verträgliches Mittel zur Verringerung des Phenylalaningehalts im Blut oder phenylalanin-haltigen Lebensmitteln, enthaltend als Wirkstoff Phenylalaninammooiaklyase, die in biologisch verträglich gemachten Cellulosetriacetatfasern immobilisiert ist.