DE2919127A1 - Mittel zur verringerung des phenylalaningehalts - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE

WUESTHOFF - ν. PECHMANN - BEHRENS - GOET2

professional representatives before the european patent office agrees pres l'office europeen des brevets

D7..-ING. PRANZ WUESTHOFF DH. PHIL. FREDA WUESTHOFF (1927-I9J6} DIPL.-ING. GERHARD PULS (1952-1971) DIPL.-CHEM. DR. E. FREIHERR VON PECHMANN DR.-ING. DIETER BEHRENS DIPL.-ING.; DIPL.-VIRTSCH.-ING. RUPERT GOETZ

D-8000 MÜNCHEN 90 SCHWEIGERSTRASSE 2 telefon: (089) 66 20 ji telegramm: protectpatent telex: j24 070

Patentanmeldung IA-52 262

Anmelder: SHAMPROGETTI S.p.A.

Gorso Venezia 16, Mailand, Italien

Titel:

Mittel zur Verringerung des Plienylalaningehalta

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PATENTANWÄLTE

WUESTHOFF - ν. PECHMANN - BEHRENS - GOETZ

PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE MANDATAIRES AGREES PRES !.'OFFICE EUROPEEN DES BREVETS

JJR.-ING. FRANZ WUESTHOFF DS. PHIL. FREDA -WUESTHOFF (1927-I9J6) DIPL.-ING. GERHARD PULS (19JZ-1971) DIPL.-CHEM. DR. E. FREIHERR VON PECHMANN DR.-ING. DIETER BEHRENS DIPL.-ING.; DIPL.-WIRTSCH.-ING. RUPERT GOETZ

H 27

D-8000 MÜNCHEN 90 SCHWEIGERSTRASSE 2

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telex: j24070

Unser Zeichen: 1A-52 262

Beschreibun

Die Erfindung betrifft ein Mittel das imstande ist, den Gehalt an Phenylalanin im Blut zu verringern oder die Phenylalanin-Konzentration in einem phenylalaninhaltigen Medium zu verringern.

Es ist "bekannt, daß Phenylalanin eine essentielle Aminosäure ist. Diese Aminosäure spielt jedoch nicht nur eine Rolle "bei der Synthese von Proteinen, sondern sie ist auch zusammen mit Tyrosin die Grundsubstanz für die Synthese von Brenzcatechinaminen, Adrenalin, Schilddrüsenhormonen (Trijod- und Tetrajodthyrosin) und dem physiologischen Pigment: Melanin.

Die erste Stufe für die Bildung dieser Substanzen ist die Oxidation von Phenylalanin und Tyrosin, die in der Leber durch die Einwirkung von Phenylalanin-hydroxylase stattfindet.

Die Blockierung dieser enzymatischen Reaktion führt zu einer Ansammlung von Phenylalanin im Blut. Dadurch v/ird ein alternativer katabolischer Weg eingeschlagen, der nach Transaminierung von Phenylalanin zu Phenylbrenztraubensäure zu Phenylessigsäure führt, die durch die Harnwege ausgeschie-

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den wird.

Eine derartige metabolische Blockierung ist in der Medizin als Phenylketonurie oder Phenylbrenztraubensäurekrankheit oder auch als Föllingsche Krankheit bekannt. Dabei handelt es sich um eine angeborene, erbliche Krankheit, die einfach rezessiv vererbt wird und die ohne Unterschied beide Geschlechter befällt, insbesondere in nordeuropäischen Ländern. Sie führt zu einer Verzögerung der geistigen Entwicklung, zu Krämpfen, Exzemen und fehlerhafter Hautpigmentierung.

Ein zu hoher Gehalt an Phenylalanin verändert andererseits den Metabolismus sowohl von Tryptophan als auch Tyrosin.

Die Oxidation von Tryptophan wird gehindert unter gleichzeitiger Aufspaltung des Indolringes und Bildung von Formylkynurein/, Hydroxylierung zu 5-Hydroxytryptophan und Decarboxylierung dieser Verbindung zu 5-Hydroxytryptamin.

Tryptophan muß so einen weiteren metabolischen Weg zur Verfügung haben, der die Ausscheidung von Indolbrenztraubensäure, Indolmilchsäure und Indolessigsäure durch die Harnwege in Mengen umfaßt, die zwanzigmal höher liegen als bei gesunden Personen.

Ein Überschuß an Phenylalanin hemmt die Tyrosinase und damit die Bildung von Melanin.

Phenylbrenztraubensäure hemmt andererseits mindestens teilweise die Oxidation von Tyrosin zu Gentisinsäure und die Bildung von Brenzkatechinami nen aufgrund der Hemmung der Dopa-decarboxylase.

geistigen Störungen Die Pathogenese der / ist vermutlich weniger einer

direkten toxischen Wirkung von Phenylalanin auf den zerebralen Metabolismus zuzuschreiben, als der verminderten Pro-

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duktion von neurohumoralen Substanzen, die für eine normale Entwicklung der Hirnfuktionen wichtig sind, wie Serotonin und Brenzcatechinamine.

Die bisherige Behandlung besteht lediglich in einer Diät. Es wird eine phenylalaninarme Diät angewandt, bei der der Gehalt an Phenylalanin im allgemeinen unter 10 bis 30 mg/kg und Tag gehalten v/erden muß. Zu diesem Zwecke werden Proteinhydrolisate mit einem geringen prozentualen Phenylalaningehalt angewandt.

Einige Autoren vermuten, daß die Ausschaltung von Phenylalanin die Entwicklung von Leukämiezellen verringern kann. Es wäre theoretisch möglich, den Phenylalaningehalt im Blut zu verringern. Tatsächlich gibt es ein Enzym, die Phenylalaninammoniakljas^ die Phenylalanin zu Zimtsäure und Ammoniak umwandelt. Es ist jedoch leider nicht möglich, ein derartiges Enzym direkt in den Blutkreislauf einzuführen, da dieses Enzym einen stark antigenen Charakter besitzt, der nach ein oder zwei Verabreichungen zu einer schnellen Ausschaltung des Enzyms führt (s. z.B. R.R. Fritz, D.S. Hodgins und CW. Abell in J. of Biol. Chem. Bd. 251, S. 4646, 1976). Diese Autoren haben das Enzym an Versuchstiere verabreicht und es hat sich gezeigt, daß die bei der ersten Verabreichung erzielten Halbwertzeiten (22 Stunden) bei anschließenden Verabreichungen wesentlich kürzer werden. Gleichzeitig wird das Vorhandensein eines Antikörpers, der für dieses Enzym spezifisch ist, beobachtet.

Es hat sich nun gezeigt, daß es möglich ist, das Enzym im Blutkreislauf von Patienten auzunutzen, die an Phenylketonurie leiden, ohne daß das Enzym-Abstoßungs-Phänomen beobachtet wird aufgrund einer langen Verweildauer des

* Phenylalanin-aminolyase

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Enzyms im Blutkreislauf.

Das Enzym wurde entsprechend dem in der IT-PS 836 462 angegebenen Verfahren in porösen Fasern aus Cellulosetriacetat immobilisiert, die durch Zusatz eines die Plättchenaggregation verhindernden Mittels wie 4,5-Diphenyl-2-bis(2-hydroxyähtyl)aminoaxazol zu der polymeren Phase biologisch verträglich gemacht worden sind. Auf diese Weise erhält man ein Mittel, das es erlaubt, die Konzentration an Phenylalanin, die im Blut vorhanden ist zu regulieren, ohne den Proteinkatalysator (in freier Form) in direkten Kontakt mit dem Blut zu bringen.

Außerdem werden durch das hohe Verhältnis von Oberfläche zu Volumen die Diffusionswirkungen weitgehend verringert, d.h. die Schnelligkeit, mit der das Substrat an die Katalysatorstellen gelangt (erhöht).

Das so hergestellte Material ist biologisch verträglich, d.h. es kann angewatadt v/erden, ohne daß Probleme wie eine Plättöhenadhäsion, Bildung von Thromben o.a. auftreten.

Schließlich kann das Produkt zur Behandlung von Proteinhydrolysaten angewandt werden, die als Wahrungsmittel verwendet werden, um den Phenylalaningehalt auf einen Bereich zu verringern, wie er bei Patienten mit Phenylketonurie toleriert werden kann.

Bisher umfaßte die Herstellung von Nahrungsmitteln, die für Patienten mit Phenylketonurie geeignet sind, mühsame chromatographische Trennungsstufen von Proteinhydrolysaten und die anschließende Rekonstituierung eines entsprechenden proportionalen Gemisches, von dem das Phenylalanin ausgeschlossen ist. Im Gegensatz dazu ist es erfin-

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dungsgemäß möglich, Phenylalanin von Proteinhydrolysaten durch einfache Behandlung dieser Hydrolysate mit den oben erv/ähnten Fasern zu entfernen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutertι

Beispiel 1

Zu einer Lösung aus 20 g Cellulosetriacetat und 7 g 4,5-Diphenyl-2-bis(2-hydroxyäthyl)aminooxazol in 930 ml Methylenchlorid wurden bei 2 C 140 ml einer Lösung von Phenylalaninammoniaklyase in einem Trispuffer (0,05 m HCl, pH 7,5) enthaltend 30 %' Glycerin, gegeben. Die Enzymlösung war erhalten worden durch Extraktion des Enzyms von Rhodotorula glutinis und Reinigung durch Ausfällen mit Proteminsulfat, Ammoniumsulfat und Natriumeitrat bis auf eine spezifische Aktivität van 2,1 /uMol/min mg Protein.

Die Aktivität der Lösung betrug 113 Einheiten/ml.

Durch Rühren wurde eine Emulsion erhalten, die dann unter Stickstoffdruck durch eine Spinndüse in ein Koagulationsbad aus Toluol exdrudiert wurde. In. dem Toluolbad entstand durch Koagulation des Polymers eine Faser, die auf Trommeln aufgenommen und zur Entfernung des Lösungsmittels mit Stickstoff behandelt wurde.

2 g der Faser wurden dann als Wickel in ein Nylonrohr mit einem Innendurchmesser von 7 mm und einer Länge von 500 mn eingebracht. Die Wände des Nylonrohrs waren vorher, nach dem in der DE-OS 28 33 072 beschriebenen Verfahren behandelt worden, um sie nicht-thrombogen zu machen.

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Ein zweiter enzymatischer Reaktionskörper wurde wie oben angegeben hergestellt.

Die beiden Reaktionskörper wurden .

Ln Serie miteinander verbunden und in ein System eingesetzt, das aus einem Reservoir, das thermostatisch auf 37°C gehalten wurde und einer peristaltischen Pumpe und natürlich den beiden Reaktionskörpern bestand» In das Reservoir

-i ßepeben
wurden 400 ml ^lut,7d§s mit Natriumeitrat versetzt war und 0,7 /UMol Phenylalanin/ml enthielt.

Das Blut wurde mit- einer Geschwindigkeit von 4 ml/sec durch die ReaktionsKörper geleitet. Die Bestimmung des Phenylalaningehalts im Blut wurde in bestimmten Zeitabständen durchgeführt. Die dabei erhaltenen Werte sind in der folgenden Tabelle angegeben:

Zeit. (Minuten)	Phenylalanin ( /UMol/ml)
0	0,70
15	0,55
30	0,42
60	0,23
90	0,07

Diese Tabelle zeigt, daß unter den angewandten Bedingungen Phenylalanin Jn ungefähr 90 Min aus dem Blut entfernt wird. Der Versuch wurde 6 mal mit den gleichen Reaktionskörpern wiederholt und die gesamte Entfernung von Phenylalanin wurde jeweils in 90 Min erreicht.

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Beispiel 2 .

Zwei enzymatische Reaktionskörper wurden wie in Beispiel 1 hergestellt und in Serie für einen Blutkreislauf außerhalb des Körpers angewandt, indem Blut aus der Oberschenkelarterie entnommen und nach Durchfluß durch die enzymatischen Reaktionskörper in die Oberschenkelvene eingeleitet wurde. Vor dem Durchgang durch die Reaktionskörper waren 0,1 /uMol/ml Phenylalanin in dem Blut enthalten. Nach 120 min war der Gehalt an Phenylalanin nahezu 0.

Beispiel 5

Eine Faser war entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden, wobei jedoch kein die Plättchenanlagerung verhinderndes Mittel zugesetzt worden war.

5g Faser wurden in ein thermostatisch reguliertes, rohrförmiges Gefäß mit einem Durchmesser von 40 mm und einer Höhe von 220 mm gegeben. In das Reaktionsgefäß wurde ein Caseinhydrolysat in einer Konzentration von 0,4 % in Phosphatpuffer (0,01 m, pH 7,5} mit einer Geschwindigkeit von 600 ml/h eingeleitet: die Konzentration an Phenylalanin betrug 0,62 /UMol/ml und diejenige an Tyrosin 0,45 /uMol/ml.

Bei der aus der Säule austretenden Flüssigkeit betrug xmzentration an Phenylalanin 0,04 Konzentration an Tyrosin 0,05 yuMol/ml.

die Konzentration an Phenylalanin 0,04 /UMol/ml und die

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Claims (3)

Patentansprüche

1. Kittel zur Verringerung des Phenylalaningehalts im Blut oder anderen phenylalaninhaltigen Medien, dadurch gekennzeichnet , daß Phenylalaninanjnori-üyase in porösen Fasern aus Cellulosetriacetat eingeschlossen ist, die biologisch verträglich gemacht worden sind.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die E'asern durch Zugabe eines die Plättchenaggregation verhindernden Mittels biologisch verträglich gemacht worden sind.

3. Verfahren zur Verringerung des Phenylalaningehalts im Blut oder einem anderen Phenylalanin enthaltenden Medium, dadurch gekennzeichnet , daß man das Blut oder das Medium mit einem Mittel zusammenbringt, bestehend aus dem Enzym Phenylalaninaminolyase, das in porösen Fasern aus Cellulosetriacetat eingeschlossen ist, die biologisch . verträglich,gemacht worden sind.

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