CS214795B2 - Method of sinking the surface of phenylalanine in water mediums - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu snížení .hladiny . fenylalaninu ve vodných médiích, které fenylalanin obsahují.

Vynález bude v následující části popisu vysvětlen na krvi, která je také jedním z vodných médií, které může případně fenylalaniu. obsahovat.

Je známo, že fenylalanin je jedna ze základních aminokyselin. Tato aminokyselina vedle funkce, kterou má při .syntéze bílkovin, představuje také společně s tyrosinem základní surovinu pro syntézu kathekolaminu, .adrenalinu, thyroidních hormonů .(trijod- a tetrajodtyrosin) a fyziologického .pigmentu melaminu.

Počátečním stupněm tvorby těchto látek je oxidace fenylalaninu a tyrosinu; k této oxidaci .dochází v játrech účinkem fenylalanin-hydroxylázy.

V případě, že je tato enzymatická reakce blokována, dochází k hromadění fenylalaninu v krvi.

V tomto případě potom dochází k odstraňování fenylalaninu z krve alternativní katabolickou cestou, při které se po transaminaci fenylalaninu na .kyselinu pyrohroznovou dále dochází ke kyselině fenyloctové, která .opouští organismus .společně s močí.

Přebytek fenylalaninu v krvi zase naopak modifikuje metabolismus tryptofanu -.a tyrosinu.

Dochází .k inhibici tryptofanu, odštěpení indolového kruhu .za vzniku formýlkynureinu, hydroxylace na 5-hyd.roxytryptofan .a dekarboxylace 5-hydroxyitryp.tof.anu ' . na .5-hyd.r.oxytryptamin.

Tryptofan musí být potom odbouráván pomocným metabolickým mechanismem, jehož finálními produkty jsou kyselina indolpyrohroznová, kyselina .indolmléčná .a kyselina indoloctová, které opouští organismus společně .s močí, ve které jsou potom . obsaženy v množství, které se rovná dvacetinásobku jejich normální koncentrace.

Přebytek .fenylalaninu také inhibuje enzymatické štěpení tyrosinu, v důsledku . čehož Je omezena tvorba melaminu.

Kyselina fcnylpyrohroznová ' zase' . -inhibuje (alespoň částečně) oxidaci tyrosinu na kyselinu gentisovou a .tvorbu .kathekolaminu v .důsledku inhibice účinku dopadekarbOxylázy.

Podle některých autorů by eliminace fenylalaninu z krve měla mít za následek ome' zení vývoje leukemických buněk. Teoreticky je možné redukovat hladinu fenylalaninu v krvi, neboť je znám enzym, .nazývaný fenylalan.inamo.niuinlyza, který je schopen konvertovat fenylalanin na . kyselinu skořicovou a amoniak. Bohužel není možné .zavést ten214795 to enzym přímo do . krve vzhledem k jeho výrazně antigennímu charakteru, což má za následek, že po jednou nebo dvou přidáních tohoto enzymu do i krve dochází k rychlé inaktivaci tohoto enzymu v krvi.

V této spojitosti je možné uvést například článek autorů R. R. Fritse, D. S. Hodginse a C. W. i Abella v J. of Biol. Chem., sv. 251, str. 4646 (1976). Tito autoři zjistili, že poločas rozkladu, který byl v případě prvého přidání roven 22 hodinám, se při následujících podáních podstatně zkrátil.

Předmětem vynálezu je způsob snížení hladiny fenylalaninu ve vodných médiích, které fenylalanin obsahují, reakcí s fenylalaninamoniumlyázou, jehož podstata spočívá v tom, že se uvedené médium uvede ve styk s porézními vlákny na bázi acetátu celulózy, v jejichž pórech je fyzikálně inkorporovaná fenylalaninamoniumlyázá.

Uvedený enzym se přitom imobilizuje metodou, . popsanou · v italském patentovém spisu -836 -462 .v . porézních vláknech z triacetátu celulózy, které se učiní případně biokompatibilní přidáním činidla inhibujícího agregaci krevních částic, jakým je například

4,5-difényl-2-bis (2-hydroxyethyl) aminooxazol. -k -uvedené polymerní fázi. Tímto způsobem - -se· získá prostředek, který umožňuje nastavit - požadovanou koncentraci fenylalaninu,· který je přítomen v uvedeném vodném médiu.

Kromě · toho vysoká hodnota poměru povrch/objem snižuje na minimum difúzní jevy, tj·''' rychlost přístupu substrátu ke katalyticky- účinným centrům. .

Způsob podle vynálezu je možné také použít například pro zpracování bílkovinných hydrolyzátů, které jsou určeny jako potrava pro pacienty postižené fenylketonurií, za účelem snížení koncentrace fenylalaninu . v těchto hydrolyzátech do té míry, která je nezbytná pro účinné léčení uvedené nemoci.

Až dosud bylo třeba při přípravě uvedené stravy určené pro pacienty postižené fenylketonurií provádět zdlouhavou . chromatografickou · separaci bílkovinných hydrolyzátů na jednotlivé složky a následnou rekonstituci těchto složek již bez fenylalaninu k získání bílkovinného hydrolyzátů s původním poměrem jednotlivých složek. Naproti tomu umožňuje způsob podle vynálezu odstranit fenylalanin z bílkovinných hydrolyzátů pouhým stykem těchto hydrolyzátů s výše uvedenými vlákny z triacetátu celulózy, ve kterých je inkorporován enzym fenylalaninamoniumlyáza.

V následující části popisu bude podstata způsobu podle vynálezu blíže objasněna pomocí příkladů provedení.

P-Hkladl

K roztoku 20 g triacetátu celulózy a 7 g uvedeného kroužku vlákna zpracovány způsobem, který je popsán v belgickém patentovém spisu 869 323. Stejným způsobem se připraví .ještě jeden takový enzymatický reaktor.

Oba reaktory se potom zapojí do. systému sériově společně s termostaticky ' regulovaným zásobníkem a peristaltickým čerpadlem. Uvedený zásobník se naplní 400 ml krve, ke které byl přidán citran sodný a fenylalanin (0,7 μΐηοΐ/ml). Tato krev se potom nechá protékat reaktorem rychlostí 4 ml za sekundu. · Přitom se periodicky odebírají vzorky cirkulující krve za účelem stanovení hladiny fenylalaninu v krvi. Získané hodnoty jsou shrnuty v následující tabulce.

Cas (min) Hladina fenylalaninu (jmol/ml)

15 30 60 90

0,70

0,55 0,42 0,23 0,07 .

4,5-dHl-n-^li2^s- (2-hydroxyethyl )aminooxazolu v 930 ml methylenchloridu se · při teplotě 2 ^CC přidá 140 ml roztoku fenylalaninamoniumlyázy v tris-pufru (0,05 M HC1, pH 7,5), který rovněž obsahuje 30 % glycerinu. Uvedený enzymový roztok byl získán extrakcí kmene Rhodotorula glutinia a vyčištěním získaného extraktu protaminsulfátem, amoniumsulfátem a citranem sodným k dosažení specifické aktivity 2,1 ^mol/rnin. . mg proteinu. Roztok měl aktivitu 113 . jednotek na ml.

Mícháním uvedené směsi se získá emulze, která se potom pod tlakem plynného dusíku vytlačuje skrze zvlákňovací trysku, ponořenou do koagulační lázně, tvořené toluenem. Koagulací polymeru se v toluenové lázni vytvoří vlákno, které se navíjí na zásobní válec a na které se potom fouká dusík za účelem odehnání rozpouštědel. Dva gramy tohoto vlákna se upraví ve formě kroužku dovnitř nylonové trubice, která má vnitřní průměr 7 mm a délku 500 mm. Za účelem nethrombogeddí úpravy vnitřních stěn této trubice byly tyto stěny ještě před vložením

Z této tabulky je zřejmé, že za uvedených podmínek dochází k odstranění fedylalaninu za asi 90 minut. Tento' test byl opakován šestkrát za použití téhož reaktoru, přičemž ve všech případech bylo dosaženo celkového odstranění fedylaladidu během 90 minut.

Příklad 2

V tomto příkladu provedení se použije vlákna, které se připraví stejným způsobem jako v . příkladu provedení 1, přičemž se však ke směsi pro přípravu vlákna nepřidává v tomto případě prostředek inhibující agregaci krevních částic.

-gramů vlákna se vloží do termostaticky regulovaného válcovitého reaktoru, majícího vnitřní průměr 40 mm a výšku 220 mm.

Do tohoto reaktoru se potom přivádí 0,4% roztok kaseinového hydrolyzátu ve fosfátovém pufru (0,01 M, pH 7,5) rychlostí 600 ml za hodinu. Tento kaseinový hydrolysát obsahoval 0,62 jímol/ml fenylalaninu ^; a 0,45 μΐηοΐ/ml tyrosinu. Kaseinový hydrolysát, který opouštěl enzymatický reaktor, obsahoval 0,04 μΐηοΐ/ml fenylalaninu a 0,05 ^mol/ml tyrosinu.

Claims (1)

1. Způsob snížení hladiny fenylalaninu ve vodných médiích, které fenylalanin obsahují, reakcí s fenylalaninamoniumlyázou, . vyznačený tím, že se uvedené médium uvede ve styk s porézními vlákny na bázi acetátu celulózy, v jejichž perech je fyzikálně inkorporovaná fenylalaninamoniumlyáza.