DE2908848A1

DE2908848A1 - Verfahren zur herstellung von cephamycin c auf mikrobiologischem wege

Info

Publication number: DE2908848A1
Application number: DE19792908848
Authority: DE
Inventors: Yoshimi Kawamura; Kouichi Matsumoto; Jun Ichi Shoji
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1978-03-07
Filing date: 1979-03-07
Publication date: 1979-09-13
Also published as: JPS54119094A; FR2419323A1; IT7967489A0; CA1108075A; US4256835A; SE7902005L; GB2017686B; GB2017686A

Description

Die Erfindung betrifft ein "Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Cephamycin C durch Züchten eines dieses Antibiotikum bildenden Stammes Streptomyces todorominensis in einem entsprechenden Nährmedium und anschliessendes Gewinnen des Cephamycin C aus der Gärbrühe.

Cephamycin C gehört zur Gruppe der Cephalosporine mit antimikrobieller Aktivität gegen gram-positive und gram-negative Bakterien. Die chemische Bezeichnung von Cephamycin C ist 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoylO3q7methyl-7-methoxy-3~eephem-4--carbonsäure. Cephamycin C zeichnet sich bei geringer Toxizität durch eine starke Aktivität gegen gram-negative Bakterien sowie gegen ß-Lactamase bildende Proteus—Stämme aus. Bezüglich weiterer Einzelheiten wird auf J.A.C.S., Bd. 93 (1971)» S. 2308 bis 2310 sowie auf Antimicrob. Ag. Chemother., Bd. 2 (1972), S. 122 bis I31, 132 bis 135, 281 bis 286 und 287 bis 290 verwiesen. Aufgrund seiner ausgeprägten antibiotischen Eigenschaften eignet sich Cephamycin C als Wirkstoff für die Human- und

Veterinärmedizin. 30

Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von Cephamycin C zur Verfügung zu stellen.

Erfindungsgemäss wird Cephamycin C hergestellt, indem man

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einen bisher nicht beschriebenen, aus einer Bodenprobe Isolierten und zunächst als Streptomyces PA-30177 bezeichneten MilcroorgairLsmenstamm unter kontrollierten Bedingungen züchtet» Dieser Stamm wurde als Streptomyces todoromlnensis sp„ noir. bezeichnet» Subkulturen dieses Stammes sind beim Fermentation Research Institute unter der Hr. I¹EBM-P 4366 und In der Bakteriensammlung der American Type Culture Collection unter der Hr. 3Ί4-89 hinterlegt.

Der Stamm Streptomyces PA-30177 weist folgende Eigenschaften

aufs

1. Morphologische Eigenschaften

Das Wachstum auf Bennett-Agar bei 28°C ist gut» Bei 50 und 1O°G lässt sich jedoch kein Wachstum feststellen. Auf diesem Medium bilden sich gelblich-graue Lufthyphen«, Das vegetative Myzel ist braungefärbt. Es wird kein lösliches Pigment gebildet«

An den Lufthyphen bilden sich Konidien* Die sporentragenden Hyphen sind spiralförmig« Die Oberfläche der Eonidien erweist sich unter dem Elektronenmikroskop als glatt«

2. Physiologische Eigenschaften

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Die nachstehend angegebenen Kohlenhydrate werden bei Zusatz zum synthetischen Agar gemäss Pridham und Gottlieb, das keine weiteren Kohlenstoff quellen enthält, leicht verwertet: Arablnose, Xylose, Glucose, Fructose, Mannit, Melibiose, Galactose, Lactose, Mannose, Maltose, Inosit, Bhamnose und Glycerin» Saccharose, Eaffinose und Sorbit fördern das Wachstum nicht»

5. Eulturei^enschaften

In Tabelle I findet sich eine ausführliche Beschreibung der Kultureigenschaften des Stammes bei Züchtung auf einer

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Anzahl von Medien, die im allgemeinen zur Untersuchung von Stämmen der Gattung Streptomyces verwendet werden. Die Medien werden durch. Ausstrich angeimpft. Für die Züchtung wird jeweils 14- Tage bei 28⁰C inkubiert.

Streptomyces PA-30177 bildet kein melanoides Pigment. Milch wird koaguliert und peptonisiert. Die Behandlung von Stärke-Agar-Kultüren mit Jodlösung gemäss Lugol zeigt, dass der Stamm eine diastatische Wirkung aufweist. Gelatine wird schwach verflüssigt« In bezug auf die Tyrosinase-Aktivität verhält sich der Stamm negativ.

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CD O CO 00 CaJ

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ω οι	8	gut	cn ο	οι	Tabelle I	von Streptomyces	ο cn-*	I vn I
		gut	Kultureigenschaften	lösliches Pigment
		gut	Luftmyzel und Sp orenfärbung	keines	PA-30177
Medium Wachstum	gut	hell braunstichig- grau	keines	rückseitige Färbung
Saccharose-Nitrat- Agar gut	massig	hell braunstichig- grau	keines	blass gelbstichig braun
Glucose-Aspara- gin-Agar	gut	hell braunstichig- grau	keines	blass gelbstichig braun	CD O OO
Glycerin-Aspara- gin-Agar	gut	gelbstichig-grau	keines	blass gelbstichig braun	OO -P*
anorganische SaI- ze-Stärke-Agar	gut	hell brauxLstichig- grau	keines	blass gelbstichig braun	CD
Tyrosin-Agar		kein Luftmyzel	gelblich-braun	blass gelbstichig braun
Nähragar	hell braunstichig- grau	keines	blass gelbstichig-braun
Hefeextrakt-Malz- extrakt-Agar	graustichig-gelb- braun	keines	gelbstichig-braun
Hafermehl-Agar	gelbstichig-grau		blass braun
Berme tt-Agar		braun

Aus den vorstehenden Befunden ergibt sich, dass der untersuchte Stamm zur Gattung Streptomyces gehört. Bei einem Yergleich dieses Stammes in bezug auf morphologische und physiologische Eigenschaften sowie in bezug auf Züchtungseigenschaften mit vielen bekannten Spezies von Streptomyces ergibt sich als nächstverwandte Spezies Streptomyces argenteolus; vgl. Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl., (1974), S. 771 bis 773 und International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 18 (I968), S. 295 bis 296. Der Standardstamm von St. argenteolus KCC S-0623 = ISP 5226 = ATCC 11009 (= 23882) ergibt bei einem Vergleich mit dem erfindungsgemäss verwendeten Stamm PA-30177 die folgenden wichtigen Unterschiede:

(1) Das Luftmyzel von St. PA-30177 ist gelblich gefärbt. Die Färbung gehört zu einer gelben Ifarbreihe auf Stärke-Agar-Medium mit anorganischen Salzen und auf Bennett-Agar-Medium. Das Luftmyzel von St. argenteolus ist hell braunstichig-graugefärbt. Diese Färbung lässt sich in eine graue Ifarbreihe einordnen. Auf Berme tt-Agar-Medium ist das vegetative Myzel von St. PA-30177 braun, während das von St. argenteolus graustichig-schwarzgefärbt ist.

(2) St. PA-30177 wächst unter guter Verwertung von MeIibiose und Inosit, während St. argenteolus keines dieser beiden Kohlenhydrate vollständig verwertet. Das Wachstum von St. argenteolus in Gegenwart von Glycerin und Ehamnose ist beträchtlich, während St. PA-30177 in Gegenwart dieser Kohlenhydrate nur ein sehr geringes Wachstum zeigt.

(3) Bei 14-tägiger Züchtung bei 37°C zeigt St. PA-30177 ein gutes Wachstum, während St. argenteolus überhaupt nicht wächst. Im Gegensatz dazu zeigt St. PA-30177 bei 10⁰C kein Wachstum, wogegen St. argenteolus ein recht gutes Wachstum

zeigt.

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Somit unterscheidet sich. St. argenteolus deutlich, vom erfindungsgemäss eingesetzten Stamm St. PA-30177·

Es sind melxrere Stämme bekannt, die Cephamycin C bilden. Beispiele hierfür sind Streptomyees lactamdurans (GB-PS 1 321 4-12), Streptomyces wadaymensis (HL-PS 7308948), Streptomyces jumonjinensis 3008 (BE-PS 804-34-1), Streptomyces P6621 (JA-OS 110097). Die Beschreibungen dieser Stämme werden mit den vorstehenden Eigenschaften verglichen. Es ergibt sich., dass sich diese Stämme in ihren mikrobiologischen Eigenschaften klar vom erfindungsgemäss verwendeten Stamm unterscheiden.

Die vorstehende Untersuchung zeigt, dass Streptomyces PA-30177 eine < neue , Spezies ist. ; Der Stamm wird als Streptomyces todorominensis sp. nov. bezeichnet. Wie bereits erwähnt, wurde dieser Stamm bei der ATCC unter der Kr. 31489 hinterlegt.

Erfindungsgemäss können auch natürliche und künstliche Mutanten dieses Stamms oder Varianten davon, die zur Spezies Streptomyces todorominensis gehören, verwendet werden, sofern sie das Antibiotikum Cephamycin C bilden und keine klaren Unterschiede zu St. todorominensis zeigen. Die künst-

liehe Mutantenerzeugung kann durch übliche Verfahren erreicht werden, beispielsweise durch Bestrahlung mit BSntgen- oder UV-Strahlen, oder durch Behandlung mit Stickstofflost, 4—Bitrochinolin-N-oxid, N-Methyl-N · -nitro-U-nitrosoguanidin oder anderenmutagenenSubstanzen.

Cephamycin C wird durch Züchtung eines Stammes von St. todorominensis gebildet. Das Verfahren zur Herstellung von Cephamycin C wird nachstehend erläutert.

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Der Cephamycin C-bildende Stamm von St. todorominensis wird in einem geeigneten Nährmedium -unter aeroben Bedingungen gezüchtet. Die Züchtungsbedingungen und die Zusammensetzung des Mediums entsprechen den üblichen Richtlinien

⁵ bei der Herstellung von Antibiotika.

Die Zusammensetzung des Mediums kann sehr stark variieren. Wesentlich ist ein Gehalt an einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und anorganischen Bestandteilen. Gegebenenfalls können Vitamine und Vitaminvorläufer zugesetzt werden. Beispiele für entsprechende Kohlenstoffquellen sind Glucose, Saccharose, Stärke, Dextrin, Glycerin, Melassen und organische Säuren. Diese Produkte können allein oder im Gemisch untereinander eingesetzt werden. Beispiele für entsprechende Stickstoffquellen sind Sogabohnenmehl, Maisquellflüssigkeit, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Baumwollsamenmehl, Pepton, Weizenkeime, Ammoniumsulfat und/oder Ammoniumnitrat. Beispiele für anorganische Bestandteile sind Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kobaltchlorid und Kaliumphosphat. Diese anorganischen Bestandteile werden dem Medium ge nach Bedarf zugesetzt. Zur großtechnischen Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens werden flüssige Medien bevorzugt. Die

Züchtung kann etwa 20 bis etwa 200 Stunden auf die für die 25

Herstellung von Antibiotika übliche Weise erfolgen. Aerobe Submersbedingungen werden für die grosstechnische Herstellung bevorzugt, wobei Züchtungszeiten von etwa 20 bis etwa 100 Stunden eingehalten werden.

Der pH-Wert des Mediums kann auf etwa 5,5 bis etwa 8,5 eingestellt werden. Das Medium kann mit einer puffernden Substanz, wie Calciumcarbonat, versetzt werden, wenn der pH-Wert während der Züchtung abweicht.

Die Züchtungstemperatur kann etwa 20 bis etwa 40⁰C und

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vorzugsweise etwa 28 bis etwa 32°C betragen. !Falls eine übermässige Schaumbildung auftritt, kann das Züchtungsmedium vor oder während der Züchtung mit Antischaummittel versetzt werden, beispielsweise mit pflanzlichen Ölen, ^ Schmalzöl oder Propylenglykol. Bach beendeter Züchtung kann das Cephamycin C aus der Gärbrühe nach an sich üblichen Verfahren gewonnen werden. Hierzu können übliche Verfahren angewendet werden, beispielsweise Filtration, Zentrifugation, Adsorption und Desorption an Ionenaustauscherharzen, Chromatographie mit verschiedenen aktiven Adsorptionsmitteln und Extraktion mit entsprechenden organischen Lösungsmitteln. Die Verfahren werden in geeigneter Weise kombiniert, um eine wirksame Isolation von Cephamycin C su erreichen. Da das Gephamycin C aus dem liltrat gewonnen wird, wird bei grosstechnischer Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens ein Adsorptionsverfahren bevorzugt. Beispielsweise wird die Gärbrühe in Gegenwart einer IPiltrierhilfe filtriert und das Ifiltrat an einem entsprechenden Adsorptionsmittel, wie Aktivkohle, Diatomeenerde, Kieselgel und verschiedene Ionenaustauscherharze, adsorbiert. Die Elution wird mit einem entsprechenden Lösungsmittel, wie Wasser, Kochsalzlösung, Aceton, Chloroform, Äthanol oder Butanol, durchgeführt. Zur Gewinnung von gereinigtem Cephamycin C kann das Ad-

sorptionsverfahren wiederholt werden.

Das auf diese Weise erhaltene rohe Cephamycin C kann gegebenenfalls nach entsprechenden Verfahren weiter gereinigt werden, beispielsweise durch Umfällung, Chromatographie oder andere der vorstehend für die Isolation beschriebenen Verfahren.

Cephamycin C kann während des Isolationsverfahrens und auch nach der Isolation für therapeutische und pharmakologische Zwecke in die Salzform überführt werden.

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Beispiele für entsprechende Salze mit Säuren sind das Hydrochlorid, Sulfat, Oxalat und Succinat. Beispiele für Metallsalze sind das Natriumsalz sowie andere pharmako-

logiseh verträgliche Salze. 5

Das Antibiotikum Cephamycin C ist ein wertvoller Wirkstoff für die Human- und Veterinärmedizin, der das Wachstum von gram-positiven und gram-negativen pathogenen Mikroorganismen hemmt; vgl. Antimicrob. Ag. Chemother., Bd. 2 (1972), S. 122 ; "bis 151 und S. 287 Ms 290.

Das Antibiotikum Cephamycin C und dessen pharmakologisch verträgliche Salze können oral, subkutan, intravenös oder lokal in pharmakologisch üblichen Darreichungsformen an Menschen oder Tiere verabfolgt werden. Beispiele für entsprechende Verabfolgungsformen sind Injektionsflüssigkeiten, Flüssigkeiten, Suspensionen, Emulsionen, Salben oder Tabletten, die entsprechende Trägerstoffe, Stabilisatoren, Emulgatoren, Konservierungsmittel und/oder Netz— mittel zusammen mit einer therapeutisch wirksamen Wirkstoffmenge enthalten. Beispielsweise können Cephamycin- C und dessen pharmakologisch verträgliche Salze oral, subkutan, intravenös oder lokal an Menschen oder Haustiere in Dosen von 0,1 bis 100 mg/kg Körpergewicht/Tag je nach Empfindlichkeit der Bakterien und Je nach Zustand des Patienten verabfolgt werden.

Ferner eignet sich Cephamycin C als Ausgangsprodukt zur

Herstellung von Cefoxitin und von analogen Produkten. 30

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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Folgende Medien werden verwendet:

Medium A (Yoranzuchtmedium): Glucose 1 ,0 Prozent, H-Z-Amin Typ A (Scheffield Chemical Co., Ltd.) 0,5 Prozent, Hefeextrakt 0,2 Prozent, Fleischextrakt 0,1 Prozent, Agar 1,5 Prozent und Wasser (pH-Wert 7,0).

Medium B (Anzuchtmedium): Glucose 0,5 Prozent, lösliche Stärke 0,5 Prozent, Polypepton 0,5 Prozent, Fleischextrakt 0,5 Prozent, Hefeextrakt 0,25 Prozent, Natriumchlorid 0,25 Prozent und Wasser (pH-Wert 0,7).

Medium C (Herstellungsmedium): Sojabohnenmehl 1,5 Prozent, Maisquellflüssigkeit -1 ,0 Prozent, Glucose 2,0 Prozent, Glycerin 0,5 Prozent, Natriumchlorid 0,3 Prozent, Calcium-

carbonat 0,3 Prozent und Wasser (pH-Wert 7>0). 15

Eine erste Anzucht von Streptomyces todorominensis (FEEiM-P 4366, ATCC 31489) wird in Reagenzgläsern, die das vorstehend angegebene Medium A enthalten, durchgeführt. Die Anzuchtröhrchen werden 7 Tage bei 28⁰C inkubiert. Die Anzuchtkultur ^ wird in einem 2000 ml fassenden Erlenmeyer-Eolben mit einem Gehalt an 800 ml des vorstehend angegebenen Mediums B durchgeführt. Die Kolben werden jeweils mit der ersten Anzuchtkultur aus dem Reagenzglas beimpft. Sodann wird 48 Stunden

bei 28°C auf einer Drehschütte !vorrichtung inkubiert. 25

Ein 30 Liter fassender Behälter mit einem Gehalt an 18 Liter des Mediums C wird mit der erhaltenen Anzuchtbrühe beimpft. 8 ml Polypropylenglykol (P-2000) werden zugesetzt. Die Inkubation wird bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 18 Liter/min und einem Innendruck von 0,5 kg/cm bei einer Rührgeschwindigkeit von 200 bis 350 U/min 4 Tage bei 28 + 0,5⁰C durchgeführt.

60 Liter Gärbrühe, die auf diese Weise erhalten worden sind, werden mit 4 η Salzsäure auf den pH-Wert 5,0 eingestellt und

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sodann mit 1,6 kg Filtrierhilfe (Hyflo Super CeI) filtriert. Das Pil trat wird mit 4 η Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 7»O eingestellt und hierauf an einem Aktivkohlebett (26 χ 14 cm) adsorbiert. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und sodann mit 50-prozentigem Aceton eluiert. Die Fraktionen, die bei einem mikrobiellen Hemmtest eine antibakterielle Aktivität aufweisen, werden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Entfernung des Acetons eingeengt. Das Konzentrat wird an 1200 ml BioRex-5 (Cl" -Form; BioRex Co., Ltd.) adsorbiert. Die Säule wird mit einer 4-prozentigen wässrigen Natriumchloridlösung eluiert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und an einem Aktivkohlebett (9₅5 x 48 cm) adsorbiert. Sodann wird die Säule mit V/asser gewaschen und mit 50-prozentigem Aceton eluiert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck zu einem öligen Sirup eingedampft. Der nach Zusatz von Aceton erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und zu einem rohen Pulver mit antibakterieller Aktivität getrocknet. Eine wässrige Lösung dieses Pulvers wird auf eine mit Sephadex G-10 (4 χ cm) gepackte Säule aufgesetzt. Die Säule wird mit Wasser elu^- iert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und an einem HP-20-Bett (Mitsubishi Kasei Kogyo Co., Ltd.) adsorbiert. Die Säule wird mit Wasser vom pH-Wert 2,0 gewaschen und sodann mit Wasser vom pH-Wert 7>0 eluiert. Die aktiven Fraktionen werden unter vermindertem Druck lyophilisiert. Man erhält 360 mg rohes Cephamycin C als amorphen Klumpen.

Das Rohprodukt (360 mg) wird an Kieselgel-Dünnschichtplatten der Abmessungen 20 χ 100 cm chromatographiert, wobei als Lauf mittel ein Gemisch aus Chloroform, Äthanol und Wasser (4:7: 2) verwendet wird. Die aktive Zone wird mit 50-prozentigem wässrigen Methanol eluiert. Die Eluate werden unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wird mit verdünnter Salzsäure auf den pH-Wert 3»0 eingestellt und an einer mit HP-20 gepackten Säule (100 ml) adsorbiert. Die

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Säule ist vorher mit einer 3-prozentigen Natriumchloridlösung vom pH-Wert 3,0 äquilibriert worden. Die Säule wird mit V/asser eluiert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt, mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 7,0 eingestellt und lyophilisiert. Man erhält 140 mg fast reines Natriumsalz von Cephamycin C.

Das Produkt wird in 2 ml Wasser gelöst und an einem Biogel P-2-Bett (1,6 χ 90 cm) (Bio-Rad tab.) chromatographiert. Die Säule wird mit Wasser mit einem Gehalt an 1 Prozent Butanol eluiert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Man erhält 100 mg Natriumsalz von Cephamycin C als farbloses Pulver.

Die physikalischen Eigenschaften des Natriumsalzes sind nachstehend angegeben:

(1) Elementaranalyse: 20

	C	,51	H	11	N	S	59	Na
ber.:	39	,50	4,76	11	,52	6,	38	4,73
gef.:	39	5,00	,44	6,	5,19

(2) UV-Absorptionsspektrum: 25

mu (aj °i_m)i 266 (173); 240 (142)

(3) IR-Absorptionsspektrum:

30 yJP^r cm"¹ 1770; 1710

(4) ^Λ H-IMR-Sp ektrum:

lTo ^{ppm 1} »50-2,10 (4H, m); 2,4? (2H, t-ähnlich);

² 3,31 (1H, d, 18); 3,53 (3H, s); 3,63 (1H,

d, 18); 3,73 (1H, t-ähnlich); 4,64 (1H,d_?

12,5)? ^,80 (1H, d, 12,5); 5,16 (1H, s).

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Die vorstehend wiedergegebenen Eigenschaften decken sich mit den Angaben in J.A.C.S., Bd. 93 (1971), S. 2308 bis 23IO sowie auch mit den Ergebnissen von direkten vergleichenden Untersuchungen mit einer authentischen Probe von

5 Cephamycin C.

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Claims

Patentansprüche

25· 1./Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Cephamycin C ""-""'' auf mikrobiologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, dass man den dieses Antibiotikum bildenden Stamm Streptomyces todorominensis ASCC 31489 in einem wässrigen Nährmedium bei Temperaturen von etwa 20 bis etwa 40°C etwa 20 bis etwa 100 Stunden unter aeroben oder Submersbedingungen züchtet und das angereicherte Antibiotikum aus der Gärbrühe isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Isolierung des Antibiotikums Cephamycin C unter Filtrieren der Gärbrühe und Adsorbieren des Filtrats mit einem entsprechenden Adsorb-

tionsmittel durchführt.
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