DE2857166T1

DE2857166T1 - Purification of factor viii

Info

Publication number: DE2857166T1
Application number: DE782857166T
Authority: DE
Inventors: P Mattock
Original assignee: UK Atomic Energy Authority
Current assignee: UK Atomic Energy Authority
Priority date: 1977-11-17
Filing date: 1978-11-10
Publication date: 1980-12-04
Also published as: GB2023662A; WO1979000299A1; GB2023662B; US4250008A; DE2857166C2; SE7906137L; SE448343B

Description

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft die Reinigung Faktor. Vlll-haltiger Lösungen, wie z.B. Blutplasma, mittels kontinuierlicher präparativer Elektrophorese.

Faktor VIII ist der antihaemophile Faktor im Blut. Seine tatsächliche Struktur ist derzeit unbekannt, es wird jedoch vermutet, daß er ein komplexes Protein mit hohem Molekulargewicht oder möglicherweise mit einem solchen Protein assoziiert ist. An seiner Extraktion z.B. aus Blutplasma besteht großes Interesse, so daß er zur Behandlung von an Haemophilie erkrankten Patienten verwendet werden kann. Faktor VIII ist jedoch instabil, was bisher zu Schwierigkeiten bei seiner Extraktion führte. Es stehen zwar Verfahren zu seiner Extraktion zur Verfügung, so z.B. ein Cryopräcipitationsverfahren; der Nachteil desselben liegt jedoch in einer geringen . Faktor VIII-Ausbeute (z.B. etwa 40%) aus dem ursprünglichen Plasma, ferner in der Gewinnung eines verdünnten Produkts, das wegen des großen Volumens, das zur Erzielung ausreichender Dosen benötigt wird, bei der Verabreichung an den Patienten zu Schwierigkeiten führt. Das verdünnte Produkt kann, wenn gewünscht, weiter gereinigt und zu einer konzentrierten Form des Faktors VIII gefriergetrocknet werden, was jedoch zu einem weiteren Verlust an Faktor VIII-Aktivität führt.

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Es wurde nunmehr ein Verfahren zur Extraktion des Faktors VIII aus Blutplasma und anderen Faktor Vlll-haltigen Lösungen, wie teilweise gereinigtem Blutplasma, entwickelt, das im wesentlichen die genannten Probleme überwindet. Zu dem erfindungsgemäßen Verfahren gehört die Anwendung von kontinuierlicher präparativer Elektrophorese für die Faktor VJII-Extraktion.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung einer Faktor Vlll-haltigen wässrigen Lösung, das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet wird:

1. Die Ionenstärke der Lösung wird soweit verringert, daß die Lösung einer Elektrophorese unterzogen werden kann;

2. Der pH der Lösung wird auf einen Bereich eingestellt, in dem die Stabilität des Faktors VIII nicht nachteilig beeinflußt wird;

3. Das Produkt aus Schritt 2 wird einer kontinuierlichen Elektrophorese unterzogen, indem die Lösung als wandernde Lösung in eine zweite wässrige Lösung eingeleitet wird, die laminar in einer ringförmigen Trennkammer als Trägerlösung für die wandernde Lösung fließt und mittels eines Gradienten der Winkelgeschwindigkeit stabilisiert wird, und indem ferner ein konstantes elektrisches Feld über das erhaltene Gemisch angelegt wird, so daß eine Relativbewegung der Faktor VIII-Komponente der wandernden Lösung

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im Verhältnis zu den anderen Hauptkomponenten der Lösung erzeugt wird, und zwar senkrecht zur Fließrichtung der Schicht;
4. Die abgetrennte Faktor VIII-Komponente wird gesammelt.

Wenn gewünscht, kann die abgetrennte Faktor VIII-Komponente, die sich in wässriger Lösung befindet, weiter gereinigt werden, so z.B. durch Gefriertrocknen, erneute Auflösung in Wasser, Einstellung von pH 7 und Entfernung unlöslicher Stoffe, oder, vorzugsweise, durch Konzentrieren vor dem Gefriertrocknen mit Hilfe eines Hohlfaserkonzentrators. In bestimmten Beispielen wurde eine Gesamtausbeute von mindestens 60% aus dem ursprünglichen Plasma mit 14-facher Anreicherung gegenüber dem ursprünglichen Plasma erzielt. Ferner wurde gefunden, daß das Endprodukt praktisch kein Fibrinogen enthält; die Hauptverunreinigung besteht aus Albumin, von dem jedoch angenommen wird, daß es wenig Wirkung auf Faktor VIII hat.

Schritt 1 des erfindungsgemäßen Verfahrens muß ausgeführt werden, damit Schritt 3 durchgeführt werden kann. In Schritt können eine Reihe von Verfahren, wie Gelfiltration und Dialyse verwendet werden. Dialyse wird bevorzugt, da sie einfach ist und keinen erkennbaren Verlust an Faktor VIII-Aktivität in Faktor Vlll-haltigen Lösungen wie Blutplasma verursacht.

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In einigen Fällen muß das Produkt aus Schritt 1 verdünnt werden, bevor es in den nachfolgenden Schritten 2 und 3 verwendet werden kann, so daß die Proteinkonzentration auf einen für die durchzuführende Elektrophorese geeigneten Spiegel abgesenkt wird. .

Schritt 3 wird am besten gemäß der in GB-PS 1 186 181 (entspricht US-PS 3 616 453) enthaltenen allgemeinen Beschreibung durchgeführt; dort werden ein Verfahren und eine Vorrichtung beschrieben, bei denen die Stabilisierung der Ströme in der kontinuierlichen Elektrophorese mittels eines Gradienten der Winkelgeschwindigkeit bewirkt wird. In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann daher die Fraktionierung in einer ringförmigen Trennkammer zwischen einem zentralen stationären Zylinder (einem Stator) und einem äußeren rotierenden Zylinder (einem Rotor) erfolgen, was zu einem Gradienten der Winkelgeschwindigkeit über die ringförmige Kammer und zu laminarem Fluß bei hohem Durchlaß führt. Das konstante elektrische Feld wird dann über die ringförmige Kammer angelegt, um die Relativbewegung der Faktor VIII-Komponente der wandernden Lösung zu erzeugen. Verbesserungen und/oder Modifikationen der in GB-PS 1. 186 184 beschriebenen Vorrichtung sind in den GB-PSen 1 431 887 und 1 431 888 (entspricht US-PS 3 844 926) dargestellt.

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Der pH der wandernden Lösung in Schritt 3 kann in dem Bereich von 6 bis 9 liegen, obwohl im allgemeinen der Bereich von 7 bis 8,5 bevorzugt wird. Die Einstellung des pH des Produkts aus Schritt 1 in Schritt 2 erfolgt am besten mit einer geeigneten Pufferlösung. Der pH muß wegen seiner Wirkung auf die Stabilität des Faktors VIII in Schritt 2 eingestellt werden. Faktor VIII ist bei pH 7 stabil, die Stabilität nimmt jedoch ab, wenn sich der pH von 7 entfernt. Ist jedoch die Verweildauer der wandernden Lösung unter den Bedingungen des Schrittes 3 kurz, dann ist es möglich, den Schritt auch bei von pH 7 entfernten Werten durchzuführen. Ferner ist zu berücksichtigen, daß bei in der Nähe von 7 liegenden pH-Werten mehr elektrische Energie benötigt wird, um eine bestimmte Mobilität einer Komponente der wandernden Lösung zu erzeugen, was durch ihre Nettoladung bedingt wird; dies kann zu einer Erhitzung führen, die die Stabilität des Faktors VIII beeinflußt. Unter Berücksichtigung dieser gegensätzlichen Anforderungen wird ein pH 7,5 der wandernden Lösung besonders bevorzugt. Ferner wird eine elektrische Leitfähigkeit der wandernden Lösung in einem Berach von 0,7 5 bis 1,0 mScm bei 20 ⁰C bevorzugt.

Schritt 4 kann entsprechend der in den GB-PSen 1 4 31 887 und 1 431 888 gegebenen Beschreibung durchgeführt werden. Wird das erfindungsgemäße Verfahren entsprechend diesen Spezifikationen ausgeführt, dann verläuft die Wanderrichtung

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der wandernden Lösung zentrifugal, und sie wird deshalb auf der Innenseite des Trägerlösungsstroms eingeleitet. Aufgrund der Rotorwirkung ist die Fließrichtung im allgemeinen nach oben gerichtet und spiralförmig. Die abgetrennten Komponenten können dann mit einem in dem Stator untergebrachten und aus einer Reihe paralleler Labyrinthplatten mit Abstandsstücken bestehenden Abzugssystem gesammelt werden. Eine bestimmte abgetrennte Komponente kann dann durch eine oder mehrere bestimmte Labyrinthplatten passieren und von dort aus in ein oder mehrere Sammelröhrchen geleitet werden.

Die Erfindung betrifft ferner mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Faktor VIII.

In den folgenden Beispielen werden die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung beschrieben.

Beispiel 1

Frisches, gefrorenes menschliches Blutplasma (250 ml) wurde rasch aufgetaut und über Nacht gegen eine wässrige Tris-Citratlösung (10 1, pH 7,0, Leitfähigkeit 0,75 mScm"¹) bei 4 ⁰C dialysiert, um die Salzkonzentration des Plasmas zu verringern. Das dialysierte Plasma wurde dann etwa 1,5 fach mit einer wässrigen Tris-Citratlösung verdünnt, so daß man ein Produkt mit pH 7,5 und einer elektrischen Leitfähigkeit

von 1,0 mScm bei 20 ⁰C erhielt.

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Das obige Produkt, die wandernde Lösung, wurde dann auf 2 0 ⁰C erwärmt und einer Elektrophorese unterzogen. Es wurde dazu eine kontinuierliche Elektrophorese-Trennvorrichtung der Art verwendet, wie sie allgemein in den GB-PSen 1 431 887 und 1 431 888 beschrieben ist. Die Vorrichtung hatte 29 Auslaßöffnungen, einen Statorradius von 40 mm, einen Rotorradius von 45 mm, was einen ringförmigen Spalt von 5 mm ergab, sowie 304 mm lange Elektroden. Eine Trägerlösung mit 2 °.C, die aus einer wässrigen Tris-Citratlösung bestand (pH 7,5, elektrische Leitfähigkeit 0,75 mScm bei 20 ⁰C) wurde mit einer Geschwindigkeit von 500 ml/min durch den ringförmigen Spalt nach oben geführt, und der Fluß wurde durch Rotieren des Rotors stabilisiert. Die wandernde Lösung wurde mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min in den ringförmigen Spalt eingeleitet. Die Elektrophorese wurde mit 35A und 27V durchgeführt, was zu einem Temperaturanstieg der Trägerlösung um 20 ⁰C, d.h. von 2 ⁰C auf 2 2 ⁰C, führte. Als Elektrolyse wurden Ammoniumacetat (1 mol/1, pH 7,5) für die Kathode und ein Gemisch (pH 7,5) aus gleichen Mengen Ammoniumeitrat (0,2 mol/1) und Ammoniumphosphat (0,15 mol/1) für die Anode verwendet. Abgetrennte Komponenten mit Faktor VIII-Aktivität, beurteilt mit einem Einstufen-Testverfahren, wurden gesammelt, und diejenigen, die etwa 75% der gesamten Faktor VIII-Gerinnungsaktivität enthielten (sie stammten aus 4 bis 5 der Auslässe) wurden vereinigt, gefriergetrocknet

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und bei -25 ⁰C aufbewahrt. Das verwendete Einstufen-Testverfahren ist im American Journal of Chemical Pathology, Band 61, Nr. 2, Februar 197·+: "Reassesment of a Non-Haemophilic Reagent for Factor VIII (AHF) Determination" von de Arigula & Frommel beschrieben.

Das obige gefriergetrocknete Produkt wurde erneut in destilliertem Wasser gelöst, und zwar in 1/30 des bei der Elektrophorese erhaltenen Volumens, so daß man eine Konzentration von etwa 15 mg/ml Protein erhielt; der pH wurde mit verdünnter Ammoniaklösung auf 7 eingestellt, und unlösliches Material wurde durch 15 min Zentrifugieren mit 15 000 U/min entfernt. Ein weiterer wie oben beschriebener Einstufentest ergab, daß etwa 80% der Faktor VIII-Aktivität der vereinigten Komponenten gewonnen worden war. Die Gesamtausbeute aus dem ursprünglichen Plasma betrug also mindestens 60%, mit 14-fa- · eher Anreicherung gegenüber dem ursprünglichen Plasma, bezogen auf die Proteinkonzentration.

Das endgültige Produkt enthielt praktisch kein Fibrinogen; Albumin stellte die größte Verunreinigung dar. Ferner war mit Faktor VIII verbundenes Antigen vorhanden; das Verhältnis der Gerinnungsaktivität zum Antigen war etwa das gleiche wie im ursprünglichen Plasma. (Das Antigen ist das Protein, das mit der Faktor VIII-Gerinnungsaktivität assoziiert ist).

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Beispiel 2

Es wurde das Verfahren von Beispiel 1 wiederholt, jedoch wurden vor dem Gefriertrocknen die gesammelten Faktor VIII-haltigen Komponenten 10 bis 20 fach konzentriert, wozu ein Hohlf as erkonzentratpr' .(der Amicon Corp.) mit einem oberen Grenzwert bei einem Molekulargewicht von 10 000 verwendet wurde. Das erhaltene Konzentrat wurde dann vor dem Gefriertrocknen bei 4 ⁰C mindestens 2 h lang gegen 0,025 mol/1 Trisacetat mit pH 7,5 dialysiert. ^:

Das Produkt war nach Wiederauflösung in destilliertem Wasser, und zwar in etwa 1/30 des aus der Elektrophorese erhaltenen Volumens, bei 4 C drei bis vier Tage stabil; ferner wurde gefunden, daß die Ausbeute der Faktor VIII-Aktivität besser reproduzierbar war, als bei Anwendung des Verfahrens von Beispiel 1.

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Claims

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF DIPL.-ING. SCHWABE DR. DR. SANDMAIR PATENTANWÄLTE Postfach 860245 · 8000 München 86 LQO I IDO Anwalts-Akte: 30 238 _ A Λ -" Patentansprüche

1. Verfahren zur Reinigung einer Faktor Vlll-haltigen wäss- ■ --.-rigen Lösung, dadurchgeken η zeichnet, daß die folgenden Schritte ausgeführt werden: ;

1.1 Die Ionenstärke der Lösung wird soweit reduziert, daß

die Lösung einer Elektrophorese unterzogen werden *■

kann;

1.2 Der pH der Lösung wird auf einen Bereich eingestellt, in dem die Stabilität des Faktors VIII nicht nachteilig beeinflußt wird;

1.3 Das Produkt aus Schritt 1.2 wird einer kontinuierlichen Elektrophorese unterzogen, indem die Lösung als wandernde Lösung in eine zweite wässrige Lösung eingeleitet wird, die laminar in einer ringförmigen Trennkam- ^! mer als Trägerlösung für die wandernde Lösung fließt und mittels eines Gradienten der Winkelgeschwindigkeit stabilisiert wird, und indem ferner ein konstan- . \ tes elektrisches Feld über das erhaltene Gemisch ange- j

legt wird, so daß eine Relativbewegung der Faktor VIII- ;

Komponente der wandernden Lösung im Verhältnis zu den ,

anderen Hauptkomponenten der Lösung erzeugt wird, und

zwar senkrecht zur Fließrichtung der Schicht; '

030602/0019 "^/2 · ^:

Bankkonten: Hypd-Bank Manchen 4410122850 (BLZ 70020011) Swift Code: HYPO DE MM Btyec Vereinsbank Manchen 453100 (BLZ 70020270) Pottscheck Manchen 65343-808 (BLZ 70010080)

(089)988272 Teletrunme: - 988273 BEKOSTAPFPATENT Manchen 98S274 TELEX: 983310 0524560 BERO d

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1.4 Die abgetrennte Faktor VIII-Komponente wird gesammelt,

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet', daß der pH der Lösung in Schritt 1.2 so eingestellt wird, daß er im Bereich von 6 bis 9 liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß der pH-Bereich 7 bis 8,5 ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß der pH 7,5 ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die elektrische Leitfähigkeit der Lösung in Schritt 1.2 auf den Bereich von 0,75 bis 1,0 mScm"¹ bei 20 ⁰C eingestellt, wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die abgetrennte Faktor VIII-Komponente weiter gereinigt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die weitere Reinigung::durch Konzentration unter Verwendung eines Hohlfaserkonzentrators erfolgt, woran sich Gefriertrocknung anschließt.

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8. Faktor VIII, dadurch gekennzeichnet , daß er mit einem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellt wird. .._..-■

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