DE2857166C2

DE2857166C2 -

Info

Publication number: DE2857166C2
Application number: DE2857166T
Authority: DE
Inventors: Patrick Eynsham Oxon Gb Mattock
Original assignee: UK Atomic Energy Authority
Current assignee: UK Atomic Energy Authority
Priority date: 1977-11-17
Filing date: 1978-11-10
Publication date: 1988-05-11
Also published as: WO1979000299A1; GB2023662B; GB2023662A; US4250008A; DE2857166T1; SE448343B; SE7906137L

Description

Die Erfindung betrifft die Reinigung Faktor VIII-haltiger Lösungen, wie z. B. Blutplasma, mittels kontinuierlicher präparativer Elektrophorese.

Faktor VIII ist der antihaemophile Faktor im Blut. Seine tat sächliche Struktur ist derzeit unbekannt, es wird jedoch ver mutet, daß er ein komplexes Protein mit hohem Molekularge wicht oder möglicherweise mit einem solchen Protein asso ziiert ist. An seiner Extraktion z. B. aus Blutplasma besteht großes Interesse, so daß er zur Behandlung von an Haemophilie erkrankter Patienten verwendet werden kann. Faktor VIII ist jedoch instabil, was bisher zu Schwierigkeiten bei seiner Extraktion führte. Es stehen zwar Verfahren zu seiner Extrak tion zur Verfügung, so z. B. ein Cryopräcipitationsverfahren; der Nachteil desselben liegt jedoch in seiner geringen Faktor VIII-Ausbeute (z. B. etwa 40%) aus dem ursprünglichen Plasma, ferner in der Gewinnung eines verdünnten Produkts, das wegen des großen Volumens, das zur Erzielung ausreichender Dosen benötigt wird, bei der Verabreichung an den Patienten zu Schwierigkeiten führt. Das verdünnte Produkt kann, wenn gewünscht, weiter gereinigt und zu einer konzentrierten Form des Faktors VIII gefriergetrocknet werden, was jedoch zu einem weiteren Verlust an Faktor VIII-Aktivität führt.

Die Anwendung eines kontinuierlichen Elektrophoreseverfahrens zur Abtren nung der Gerinnungsproteine und des fibrinolytischen Enzymsystems wird von J. H. Lewis et al in J. Clin. Invest. 37, 1323 (1958) beschrieben. In diesem Verfahren wird als Trägermaterial Filterpapier und als Puffer ein Barbitalpuffer mit pH 8,6 verwendet. Die Ergebnisse zeigen jedoch, daß eine befriedigende Abtrennung von Faktor VIII vom Rest der Plasmaproteine mittels dieses Verfahrens nicht erreicht wird.

Weiterhin ist aus der GB-PS 14 31 888 eine Vorrichtung zur Durchführung des kontinuierlichen Elektrophoreseverfahrens bekannt. Diese Druckschrift enthält jedoch außer der konstruktiven Ausgestaltung der Vorrichtung keinerlei Hinweise für eine erfolgreiche Faktor VIII Isolierung, insbe sondere keinerlei Hinweise auf vorteilhafte Verfahrensparameter, wie zum Beispiel den pH-Wert.

Es wurde nunmehr ein Verfahren zur Extraktion des Faktors VIII aus Blutplasma und anderen Faktor VIII-haltigen Lösun gen, wie teilweise gereinigtem Blutplasma, entwickelt, das im wesentlichen die genannten Probleme überwindet. Zu dem erfindungsgemäßen Verfahren gehört die Anwendung von konti nuierlicher präparativer Elektrophorese für die Faktor VIII- Extraktion.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Faktor VIII aus einer Faktor-VIII-haltigen wäßrigen Lösung mit kontrollierter Ionenstärke, bei dem man

(i) die elektrische Leitfähigkeit der Lösung in dem Bereich von 0,75 bis 1,0 mScm^-1 bei 20°C einstellt;
(ii) die Lösung einer kontinuierlichen Elektrophorese unterwirft, indem man die Lösung als wandernde Lösung in eine zweite wäßrige Lösung, die laminar in einer ringförmigen Trennkammer als Trägerlösung für die wandernde Lösung fließt und mittels eines Gradienten der Winkel geschwindigkeit stabilisiert wird, zuführt, und indem man ein kon stantes elektrisches Feld über das erhaltene Gemisch anlegt, um eine unterschiedliche Wanderung der Faktor-VIII-Komponente aus der wandernden Lösung im Verhältnis zu den anderen Hauptkomponenten senkrecht zur Fließrichtung der Schicht zu erzeugen, und
(iii) die abgetrennte Faktor-VIII-Komponente sammelt, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Faktor VIII enthaltenden Lösung, die der Behandlung der Stufe (ii) unterworfen wird, auf 7,5 einstellt.

Wenn gewünscht, kann die abgetrennte Faktor VIII-Komponente, die sich in wäßriger Lösung befindet, weiter gereinigt wer den, so z. B. durch Gefriertrocknen, erneute Auflösung in Was ser, Einstellung von pH 7 und Entfernung unlöslicher Stoffe, oder, vorzugsweise, durch Konzentrieren vor dem Gefriertrock nen mit Hilfe eines Hohlfaserkonzentrators. In bestimmten Bei spielen wurde eine Gesamtausbeute von mindestens 60% aus dem ursprünglichen Plasma mit 14facher Anreicherung gegenüber dem ursprünglichen Plasma erzielt. Ferner wurde gefunden, daß das Endprodukt praktisch kein Fibrinogen enthält; die Haupt verunreinigung besteht aus Albumin, von dem jedoch angenommen wird, daß es wenig Wirkung auf Faktor VIII hat.

Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens muß ausgeführt werden, damit Schritt (ii) durchgeführt werden kann. In Schritt (i) können eine Reihe von Verfahren, wie Gelfiltration und Dialy se verwendet werden. Dialyse wird bevorzugt, da sie einfach ist und keinen erkennbaren Verlust an Faktor VIII-Aktivität in Faktor VIII-haltigen Lösungen wie Blutplasma verursacht.

In einigen Fällen muß das Produkt aus Schritt (i) verdünnt wer den, bevor es im nachfolgenden Schritt (ii) verwen det werden kann, so daß die Proteinkonzentration auf einen für die durchzuführende Elektrophorese geeigneten Spiegel abgedeckt wird.

Schritt (ii) wird am besten gemäß der in GB-PS 11 86 184 (entspricht US-PS 36 16 453) enthaltenen allgemeinen Beschrei bung durchgeführt; dort werden ein Verfahren und eine Vorrich tung beschrieben, bei denen die Stabilisierung der Ströme in der kontinuierlichen Elektrophorese mittels eines Gradienten der Winkelgeschwindigkeit bewirkt wird. In dem erfindungsge mäßen Verfahren kann daher die Fraktionierung in einer ring förmigen Trennkammer zwischen einem zentralen stationären Zy linder (einem Stator) und einem äußeren rotierenden Zylinder (einem Rotor) erfolgen, was zu einem Gradienten der Winkelge schwindigkeit über die ringförmige Kammer und zu laminarem Fluß bei hohem Durchlaß führt. Das konstante elektrische Feld wird dann über die ringförmige Kammer angelegt, um die Rela tivbewegung der Faktor VIII-Komponente der wandernden Lösung zu erzeugen. Verbesserungen und/oder Modifikationen der in GB-PS 11 86 184 beschriebenen Vorrichtung sind in den GB-PS 14 31 887 und 14 31 888 (entspricht US-PS 38 44 926) darge stellt.

Die Einstellung des pH-Wertes des Produkts aus Schritt (i) vor Schritt (ii) erfolgt am besten mit einer geeigneten Pufferlösung. Der pH-Wert muß wegen seiner Wir kung auf die Stabilität des Faktors VIII vor Schritt (ii) einge stellt werden. Faktor VIII ist bei pH 7 stabil, die Stabili tät nimmt jedoch ab, wenn sich der pH von 7 entfernt. Ist jedoch die Verweildauer der wandernden Lösung unter den Be dingungen des Schrittes (ii) kurz, dann ist es möglich, den Schritt auch bei von pH 7 entfernten Werten durchzuführen. Ferner ist zu berücksichtigen, daß bei in der Nähe von 7 liegenden pH-Werten mehr elektrische Energie benötigt wird, um eine bestimmte Mobilität einer Komponente der wandernden Lösung zu erzeugen, was durch ihre Nettoladung bedingt wird; dies kann zu einer Erhitzung führen, die die Stabilität des Faktors VIII beeinflußt. Unter Berücksichtigung dieser gegen sätzlichen Anforderungen wird erfindungsgemäß ein pH 7,5 der wandern den Lösung verwendet. Ferner wird eine elektrische Leit fähigkeit der wandernden Lösung in einem Bereich von 0,75 bis 1,0 mScm^-1 bei 20°C verwendet.

Schritt (ii) kann entsprechend der in den GB-PS 14 31 887 und 14 31 888 gegebenen Beschreibung durchgeführt werden. Wird das erfindungsgemäße Verfahren entsprechend diesen Spe zifikationen ausgeführt, dann verläuft die Wanderrichtung der wandernden Lösung zentrifugal, und sie wird deshalb auf der Innenseite des Trägerlösungsstroms eingeleitet. Auf grund der Rotorwirkung ist die Fließrichtung im allgemeinen nach oben gerichtet und spiralförmig. Die abgetrennten Kom ponenten können dann mit einem in dem Stator untergebrach ten und aus einer Reihe paralleler Labyrinthplatten mit Ab standsstücken bestehenden Abzugssystem gesammelt werden. Eine bestimmte abgetrennte Komponente kann dann durch eine oder mehrere bestimmte Labyrinthplatten passieren und von dort aus in ein oder mehrere Sammelröhrchen geleitet werden.

Die Erfindung betrifft ferner mit dem erfindungsgemäßen Ver fahren gewonnenen Faktor VIII.

In den folgenden Beispielen werden die bevorzugten Ausführungs formen der Erfindung beschrieben.

Beispiel 1

Frisches, gefrorenes menschliches Blutplasma (250 ml) wurde rasch aufgetaut und über Nacht gegen eine wäßrige Tris- Citratlösung (10 l, pH 7,0, Leitfähigkeit 0,75 mScm^-1) bei 4°C dialysiert, um die Salzkonzentration des Plasmas zu verringern. Das dialysierte Plasma wurde dann etwa 1,5fach mit einer wäßrigen Tris-Citratlösung verdünnt, so daß man ein Produkt mit pH 7,5 und einer elektrischen Leitfähigkeit von 1,0 mScm^-1 bei 20°C erhielt.

Das obige Produkt, die wandernde Lösung, wurde dann auf 20°C erwärmt und einer Elektrophorese unterzogen. Es wurde dazu eine kontinuierliche Elektrophorese-Trennvorrichtung der Art verwendet, wie sie allgemein in den GB-PS 14 31 887 und 14 31 888 beschrieben ist. Die Vorrichtung hatte 29 Auslaßöffnungen, einen Statorradius von 40 mm, einen Rotorradius von 45 mm, was einen ringförmigen Spalt von 5 mm ergab, sowie 304 mm lange Elektroden. Eine Träger lösung mit 2°C, die aus einer wäßrigen Tris-Citratlösung bestand (pH 7,5, elektrische Leitfähigkeit 0,75 mScm^-1 bei 20°C) wurde mit einer Geschwindigkeit von 500 ml/min durch den ringförmigen Spalt nach oben geführt, und der Fluß wur de durch Rotieren des Rotors stabilisiert. Die wandernde Lö sung wurde mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min in den ringförmigen Spalt eingeleitet. Die Elektrophorese wurde mit 35 A und 27 V durchgeführt, was zu einem Temperaturanstieg der Trägerlösung um 20°C, d. h. von 2°C auf 22°C, führte. Als Elektrolyte wurden Ammoniumacetat (1 mol/l, pH 7,5) für die Kathode und ein Gemisch (pH 7,5) aus gleichen Mengen Ammoniumcitrat (0,2 mol/l) und Ammoniumphosphat (0,15 mol/l) für die Anode verwendet. Abgetrennte Komponenten mit Faktor VIII-Aktivität, beurteilt mit einem Einstufen-Testverfahren, wurden gesammelt, und diejenigen, die etwa 75% der gesamten Faktor VIII-Gerinnungsaktivität enthielten (sie stammten aus 4 bis 5 der Auslässe) wurden vereinigt, gefriergetrocknet und bei -25°C aufbewahrt. Das verwendete Einstufen-Testver fahren ist im American Journal of Chemical Pathology, Band 61, Nr. 2, Februar 1974: "Reassessment of a Non-Haemophilic Reagent for Factor VIII (AHF) Determination" von de Angula & Frommel beschrieben.

Das obige gefriergetrocknete Produkt wurde erneut in de stilliertem Wasser gelöst, und zwar in ¹/₃₀ des bei der Elek trophorese erhaltenen Volumens, so daß man eine Konzentration von etwa 15 mg/ml Protein erhielt; der pH-Wert wurde mit verdünn ter Ammoniaklösung auf 7 eingestellt, und unlösliches Mate rial wurde durch 15 min Zentrifugieren mit 15 000 U/min ent fernt. Ein weiterer, wie oben beschriebener Einstufentest, er gab, daß etwa 80% der Faktor VIII-Aktivität der vereinigten Komponenten gewonnen worden war. Die Gesamtausbeute aus dem ursprünglichen Plasma betrug also mindestens 60%, mit 14fa cher Anreicherung gegenüber dem ursprünglichen Plasma, be zogen auf die Proteinkonzentration.

Das endgültige Produkt enthielt praktisch kein Fibrinogen; Albumin stellte die größte Verunreinigung dar. Ferner war mit Faktor VIII verbundenes Antigen vorhanden; das Verhält nis der Gerinnungsaktivität zum Antigen war etwa das gleiche wie im ursprünglichen Plasma. (Das Antigen ist das Protein, das mit der Faktor VIII-Gerinnungsaktivität assoziiert ist.)

Beispiel 2

Es wurde das Verfahren von Beispiel 1 wiederholt, jedoch wurden vor dem Gefriertrocknen die gesammelten Faktor-VIII-haltigen Komponenten 10- bis 20fach konzentriert, wozu ein Hohlfaserkonzentrator (der Amicon Corp.) mit einem oberen Grenzwert bei einem Molekulargewicht von 10 000 verwendet wurde. Das erhaltene Konzentrat wurde dann vor dem Gefriertrocknen bei 4°C mindestens 2 h lang gegen 0,025 mol/l Trisacetat mit pH 7,5 dialysiert.

Das Produkt war nach Wiederauflösung in destilliertem Wasser, und zwar in etwa ¹/₃₀ des aus der Elektrophorese erhaltenen Volumens, bei 4°C drei bis vier Tage stabil; ferner wurde gefunden, daß die Ausbeute der Faktor-VIII-Aktivität besser reproduzierbar war, als bei Anwendung des Verfahrens von Beispiel 1.

Claims

Verfahren zur Reinigung von Faktor VIII aus einer Faktor-VIII-haltigen wäßrigen Lösung mit kontrollierter Ionenstärke, bei dem man
- (i) die elektrische Leitfähigkeit der Lösung in dem Bereich von 0,75 bis 1,0 mScm^-1 bei 20°C eingestellt;
- (ii) die Lösung einer kontinuierlichen Elektrophorese unterwirft, indem man die Lösung als wandernde Lösung in eine zweite wäßrige Lösung, die laminar in einer ringförmigen Trennkammer als Trägerlösung für die wandernde Lösung fließt und mittels eines Gradienten der Winkel geschwindigkeit stabilisiert wird, zuführt, und indem man ein kon stantes elektrisches Feld über das erhaltene Gemisch anlegt, um eine unterschiedliche Wanderung der Faktor-VIII-Komponente aus der wandernden Lösung im Verhältnis zu den anderen Hauptkomponenten senkrecht zur Fließrichtung der Schicht zu erzeugen, und
- (iii) die abgetrennte Faktor-VIII-Komponente sammelt, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Faktor VIII enthaltenden Lösung, die der Behandlung der Stufe (ii) unterworfen wird, auf 7,5 einstellt.