DE2820441B2

DE2820441B2 - Verfahren und Vorrichtung zum Bestimmen der Geschwindigkeit einer Enzymreaktion

Info

Publication number: DE2820441B2
Application number: DE2820441A
Authority: DE
Inventors: Kazuo Hachioji Tokio Hijikata (Japan)
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1977-05-10
Filing date: 1978-05-10
Publication date: 1979-12-20
Also published as: US4224405A; DE2820441A1; DE2820441C3; JPS53138797A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Bestimmen der Geschwindigkeit einer Enzymreaktion (Enzymaktivität), die insbesondere in Blut, durch eine chemische Umsetzung bestimmt wird.

Ein Enzym ist ein organischer, hochpolymerer Katalysator, der in biologischen Körpern anwesend ist und an nahezu jeder chemischen Reaktion teilnimmt, die innerhalb der biologischen Körper vor sich geht. Die in Blut enthaltene Enzymmenge kann nicht direkt bestimmt werden, sondern wird normalerweise durch ein Alternativverfahren testgestellt, bei dem abgenommenes Blut Koenzym zugemischt und die Extinktion des Koenzyms festgestellt wird, die stellvertretend für eine entsprechende Menge Enzym steht. Genauer gesagt wird die Enzymmenge von der Geschwindigkeit der katalytischen Reaktion pro Zeiteinheit abgeleitet. Eine derartige Bestimmung der Menge aktiven Enzyms in Blut wird normalerweise als die Bestimmung der

I.E./1 = M/min χ Κ

wobei

= K'xV,

worin /=ein Liter Blut, ΔΑ/ττύη = Differenz in der Extinktion (optischen Dichte) pro Minute, V/=Gesamtvolumen, V_s= Probenvolumen, V₁=ein Temperaturkorrekturkoeffizient und C= ein Faktor, der sich auf die Bestimmung eines Koenzyms bei einer gegebenen optischen Wellenlänge bezieht
Die Gleichung (1) läßt sich wie folgt umschreiben:

I.E./l = Μ/min χ K' χ V,

wobei

K =-

V₁ χ K)(K)

Es zeigt sich alo, daß die Enzymmenge eine Funktion der Temperatur ist.

Der Unterschied in der Extinktion AA kann durch eine optische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit der Umsetzung bestimmt werden. Dazu wird ein Reagens in eine Reaktionslösung eingeführt, die in einer Meßzellc enthalten ist, und die anfängliche Änderungsgeschwindigkeit der Extinktion der Reaktionslösung pro Zeiteinheit als den Reaktionsgrad darstellend angesehen. In Fig. 1, in der die Abszisse die Reaktionszeit f und die Ordinate die optische Dichte (O. D.) darstellt, sind verschiedene Kurven dargestellt, die Änderungen der optischen Dichte wiedergeben, die beim Einführen des Reaktionsmittels auftreten. Die oben erwähnte Anfangsgeschwindigkeit zeigt sich in Änderungen ΔΕ\, ΔΕι,ΔΕι der Extinktion pro Minute Δί, gemessen längs des Anfangsbereichs des linearen Segments der Kurven.

In einem Spektralphotometer für Enzymaktivitäts-Messungen (G-I-T Fachz. Lab. 19 [1975] H. 10, S. 847/849) wird die für die Messung gewählte Temperatur der Reaktionslösung durch eine Temperatursteuerung eines Termostaten so konstant wie möglich gehalten, in den die Meßzelle bzw. Küvette eingesetzt ist, so daß die rechnerische Auswertung mit einem festen Wert des Temperaturkorrekturkoeffizienten (Extinktionskoeffizienten), der in den Gleichungen (1) und (2) erscheint, erfolgen wird. Es wird also die Thermostattemperatur mit der Reaktionslösungstemperatur gleichgesetzt. Die Thermostatiertemperatur kann frei gewählt werden und wird entsprechend dieser Wahl bei der rechnerischen Auswertung der Meßergebnisse berücksichtigt.

Eine bekannte Anordnung ist in F i g. 2 gezeigt, bei der ein Glasgefäß 1 eine Thermostatierflüssigkeit 2 enthält, die mit einer Heizvorrichtung 3 erwärmt und deren Temperatur mittels eines Temperaturfühlers 4 und einer automatischen Steuerung der Heizvorrich-

tung 3 konstant gehalten werden kann. In die Thermostatierflüssigkeit 2 ist eine Küvette bzw. Meßzelle 5 eingesetzt, die eine Reaktionslösung 6 enthält Durch die MeDzelle wird ein Lichtstrom P von bestimmter optischer Wellenlänge hindurch auf ein lichtelektrisches Wandlerelement zur Bestimmung der Extinktion geleitet

F i g. 3 zeigt eine andere bekannte Anordnung, bei der ein Thermostatierblock 7 von einem Heizelement 8 aufheizbar ist, welches über einen Temperaturfühler 9 automatisch auf konstanter Temperatur gehalten wird. In den Block 7 ist eine Meßzelle 11 eingesetzt, die eine Reaktionslösung 10 enthält Der Block 7 hat zwei miteinander fluchtende Öffnungen 7a, durch die der Lichtstrom P für die Extinktionsbestimmung geleitet wird.

Bei den herkömmlichen Anordnungen ist noch keine zufriedenstellende Temperatursteuerung der Reaktionslösung selbst über die Zeit, insbes. bei Änderungen der Umgebungstemperatur zu erzielen. Die Temperatursteuerung der Reaktionslösung stellt eine wichtige Größe bei der Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit dar. Wenn sich die Temperatur der Reaktionslösung nämlich um 1°C ändert, führt das zu einer Änderung der ermittelten Extinktionswerte von 10%. Da die Verbesserung der Genauigkeit der Temperatursteuerung über die Thermostatierflüssigkeit oder den Thermostatierblock kaum noch möglich erscheint, läßt sich die Exaktheit der Temperatursteuerung der in der Zelle enthaltenden Reaktionslösung auf diese.η Wege auch nicht wesentlich verbessern, denn die Steuerung richtet sich nach dem Thermostaten selbst

Aufgabe der Erfindung ist es, ein photometrisches Verfahren und eine Vorrichtung zum Bestimmen der Geschwindigkeit einer Enzymreaktion zu schaffen, welche genauer als die bekannten arbeiten.

Ein diese Aufgabe lösendes Verfahren ist im Patentanspruch 1 und eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens im Patentanspruch 2 sowie eine Ausgestaltung ?n Patentanspruch 3 angegeben.

Gemäß der Erfindung ist für die Bestimmung der Enzymmenge über die Extinktion nicht mehr die Temperatur der Thermostatierflüssigkeit die von der Temperatur der Reaktionslösung abweichen kann, sondern die Temperatur der Reaktionslösung selbst maßgebend. In die Bestimmung der Enzymmenge geht immer der der Reaktionslösungstemperatur entsprechende Temperaturkorrekturkoeffizient (Extinktionskoeffizient) ein. Es ist daher erstmals nicht mehr nötig, die TemperaüT der untersuchten Reaktionslösung möglichst konstant zu halten zu versuchen. Statt dessen kann die Temperatur der Reaktionslösung schwanken. Temperaturschwankungen werden bei der Ermittlung der Meßwerte durch die ständige, nur durch die Trägheit des Temperaturfühlers selbst verzögerte Anpassung des Temperaturkorrekturkoeffizienten kompensiert. Auf diese Weise kann die Enzymmenge sehr exakt und viel exakter als bisher bestimmt werden. Da keine genaue Temperatursteuerung des Thermostaten, sofern er überhaupt vorgesehen ist nötig ist, läßt sich dessen Temperatursteuerung gegenüber der bekannten Anordnung außerordentlich stark vereinfachen.

Die Temperatur der Reaktionslösung wird also direkt gemessen und die erhaltenen Temperaturangaben unmittelbar zur Korrektur der Meßdaten über die Enzymmenge, die ausgehend von der Annahme einer bestimmten TerriDeratur errechnet werden, verwendet.

Die Geschwindigkeit der Enzymreaktion wird durch Bestimmung der Enzymmenge nach jeweils einer Zeiteinheit über die Extinktion festgestellt wobei jeweils der Temperaturkorrekturkoefnzient V, berüeksichtigt wird, der der jeweils bei der Bestimmung der Enzymmenge herrschenden Temperatur, die der direkt in die zu untersuchende Reaktionslösung eintauchenden Temperaturfühler mißt entspricht Zu der zum Bestimmen der Reaktionsgeschwindigkeit verwendeten Vorrichtung gehört ein Thermostat, der die Reaktionslösung enthält ein Temperaturfühler, der unmittelbar in der Lösung angeordnet ist, ein lichtelektrisches Wandlerelement, das auf den durch die im Thermostaten angeordnete Meßzelle hindurchgeleiteten Lichtstrom P anspricht und die optische Dichte der Reaktionslösung bestimmt eine logarithmische Umwandlungsschaltung, die das Signal des Wandlerelements in ein entsprechendes logarithmisches Extinktionssignal umwandelt, und eine Koeffizienten-Um-Wandlungsschaltung, die aus dem Extinktionssignal und der Temperaturinformation des Temperaturfühlers die wahre Extinktion mit dem temperaturkorrigierten Temperaturkoeffizienten ermittelt

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist anhand der Zeichnung erläutert in der zeigt

F i g. 1 ein Diagramm der optischen Dichte über der Reaktionszeit und verdeutlicht die Änderung der Anfangsgeschwindigkeit,

F i g. 2 und 3 Schnitte durch Thermostaten, die bei der bekannten Bestimmung der Enzymreaktionsgeschwindigkeit verwendet werden,

Fig.4 einen Schnitt durch einen Thermostatblock und ein Blockschema der zum Ausführen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Vorrichtung,

Fig.5 ein Schaltschema der in Fig.4 gezeigten Koeffizienten-Umwandlungsschaltung.

In Fig.4 ist die Vorrichtung zum Bestimmen der Geschwindigkeit einer Enzymreaktion dargestellt In einen Thermostatblock 12 ist eine durchsichtige Meßzelle 13 eingesetzt, die eine bestimmte Menge einer Reaktionslösung 14 enthält. Der Thermostatblock 12 hat zwei miteinander fluchtende Öffnungen 12a, durch die ein Lichtstrom P von gegebener optischer Wellenlänge hindurchgeleitet wird, um die Dichte der Lösung festzustellen. Der Lichtstrom P, der die Reaktionslösung 14 durchdrungen hat, trifft auf ein lichtelektrisches Wandlerelement 15, welches eine Siliziumzelle oder dgl. aufweisen kann. Das Wandlerelement 15 erzeugt ein Differentialextinktionssignal, welches zunächst an einen Verstärker 16 angelegt wird, ehe es in eine logarithmische Umwandlungsschaltung 17 von bekannter Art eingegeben wird. Der Ausgang der Umwandlungsschaltung 17 wird an eine Koeffizienten-Umwandlungsschaltung 18 angelegt, die die Berechnung von ÄAIrrim χ Κ durchführt

In die Reaktionslösung 14 ist ein Temperaturfühler 20, beispielsweise ein Thermistor direkt eingetaucht Um Verschmutzungswirkungen auf ein Minimum einzuschränken, ist die Oberfläche des Temperaturfühlers 20 so behandelt, daß sie wasserabstoßend wirkt, z. B. durch eine Beschichtung mit PTFE. Es liegt auf der Hand, daß das restliche Blut, das noch an der Wandoberfiäche der im vorhergehenden Meßzyklus verwendeten Meßzelle 13 haftet durch Spülen entfernt werden kann, so daß verhindert wird, daß es dem als nächstes in die Meßzelle 13 eingefüllten frischen Blut zugemischt wird und dieses verschmutzt. Die Behandlung des Temperaturfühlers 20, die diesen abstoßend macht, hat den Sinn, eine ähnliche

Verschmutzung des frischen Bluts durch möglicherweise anhaftendes altes Blut zu vermeiden. Der Temperaturausgang des Temperaturfühlers 20 wird über einen Verstärker 19 an die Koeffizienten-Umwandlungsschaltung 18 gegeben. Wie Fig.5 zeigt, weist die Koeffizienten-Umwandlungsschaltung 18 einen Analogrechenschaltkreis von bekannter Bauart auf, zu dem Verstärker 22, 23, ein Analog-Digital-Wandler 24, Feldeffekttransistoren Q 1 bis Qn, Widerstände Ra bis Re und R1 bis Rn und eine Vorspannungsquelle 25 gehören. Die Kombination aus Vorspannungsquelle 25 und Widerstand Rc liefert eine geeignete Vorspannung für den Verstärker 22, dem ein Temperaturausgang vom Verstärker 19 zugeführt wird. Der Ausgang des Verstärkers 22 Hegt am Analog-Digital-Wandler 24 an. Die einzelnen Feldeffekttransistoren Q1 bis Qn sind an entsprechende Ausgangsklemmen des Analog-Digital-Wandlers angeschlossen, und die Ausgangsklemmen der einzelnen Transistoren sind mit den einzelnen Widerständen R1 bis Rn verbunden. Die anderen Enden der Widerstände R1 bis Rn sind gemeinsam über den Widerstand Rd an den Eingang des Verstärkers 23 angeschlossen. Der Ausgang der Umwandlungsschaltung 17 liegt an der gleichen Eingangsklemme des Verstärkers 23 über den Widerstand Re an, während der Ausgang des Verstärkers 23 über einzele Tore mit den entsprechenden Feldeffekttransistoren und auch mit einem Ausgabedrucker 21 gekoppelt ist

Beim Gebrauch der Vorrichtung wird die Zelle 13, die das Blut oder die zu untersuchende Reaktionslösung 14 enthält, im Thermostatblock 12 aufgenommen, der auf konstanter Temperatur gehalten wird. Anschließend wird der Temperaturfühler 20, der vorzugsweise so konstruiert ist, daß er eine reduzierte Wärmekapazität hat, in die Reaktionslösung 14 eingeführt Der Reaktionslösung 14 wird ein Reagens zugefügt, und nach einer Zeitspanne von ca. 30 Sekunden wird ein Lichtstrom P von gegebener Wellenlänge durch die öffnungen 12a und durch die Reaktionslösung 14 geleitet. Zwischen der Reaktionslösung 14 und den Reagens erfolgt eine chemische Umsetzung, die ein« Änderung der optischen Dichte der Lösung im Verlau der Zeit hervorruft. Die Änderung der Extinktion übei eine Zeitspanne von einer Minute wird gemessen. Dei Lichtstrom P trifft auf ein Wandlerelement 15, welche! ihn in ein entsprechendes elektrisches Signal umwan delt. Die Umwandlungsschaltung 17 wandelt dies in eir entsprechendes logarithmisches Signal um, welches ir ίο die Koeffizienten-Umwandlungsschaltung 18 eingegeben wird.

Der Temperaturfühler liefert ein Temperatursigna über den Verstärker 19 an die Koeffizienten-Umwandlungsschaltung 18. Jn Abhängigkeit von dem Temperais tursignal bewirkt der Analog-Digital-Wandler 24 in dei Koeffizienten-Umwandlungsschaltung 18, daß die Feld effekttransistoren Qi bis Qn entsprechend dei Temperaturinformation leitend werden und ein entsprechendes Spannungssignal an den Verstärker 23 liefern Auf diese Weise wird der Temperaturkorrekturkoeffizient V, entsprechend der Reaktionslösungstemperatui geändert, um sicherzustellen, daß am Ausgang des Verstärkers 23 der exakte Wert der Enzymmenge I. E ansteht Die korrigierten Meßwerte werden dann vom Ausgabedrucker 21 gedruckt

Das oben beschriebene Korrektursystem verbesserl die Genauigkeit des Wertes der Enzymmenge I. E gegenüber dem mit der bekannten Anordnung erhaltenen Wert

Die Koeffizienten-Umwandlungsschaltung 18 ist bei dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel als Analogschaltung konstruiert Sie kann jedoch auch durch die Funktion eines Computers oder einer zentraler Verarbeitungseinheit mit einem Speicher ersetzt sein, in j5 dem die temperaturabhängigen Temperaturkorrekturkoeffizienten gespeichert und entsprechend dem Temperatursignal von einem Analog-Digital-Wandler ausgegeben werden, um hiermit ΔΑ/mm χ K oder die Enzymmenge I. E zu berechnen.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Bestimmen der Geschwindigkeit einer Enzymreaktion, bei dem eine Enzymmenge anhand der Reaktionsgeschwindigkeit einer Reaktionslösung, deren Extinktion proportional zur Zeit ist, pro Zeiteinheit unter Berücksichtigung der Meßtemperatur bestimmt wird, dadurch #ekennzeichnet, daß die Temperaturinformation eines unmittelbar in der Reaktionslösung (14) angeordneten Temperaturfühlers (20) zum Abwandeln eines Temperaturkorrekturkoeffizienten (V₁) zur Korrektur einer sich aus einer Temperaturänderung ergebenden Änderung der Enzymmenge verwendet wird.

2. Vorrichtung zum Bestimmen der Geschwindigkeit einer Enzymreaktion (Enzym-Aktivität), mit der eine Enzy*nmenge anhand der Reaktionsgeschwindigkeit einer Reaktionslösung, deren Extinktion sich proportional zur Zeit ändert, bestimmt wird, mit einer durchsichtigen Meßzelle zur Aufnahme der Reaktionslösung in einem Thermostaten, einem licht-elektrischen Wandlerelement, welches auf einen durch die Meßzelle von einer Lampe hindurchgeleiteten Lichtstrom (P) anspricht und mit dem die optische Dichte der Reaktionslösung bestimmbar ist; und mit einer an das Wandlerelement angeschlossenen logarithmischen Umwandlerschaltung, die ein elektrisches Signal des Wandlerelements in ein die logarithmische Extinktion der Reaktionslösung wiedergebendes Extinktionssignal umsetzt, sowie gegebenenfalls einem Ausgabedrukker zum Ausdrucken der Meßwerte nach bestimmten Zeiteinheiten, dadurch gekennzeichnet, daß eine Koeffizienten-Umwandlungsschaltung (18) zum Abwandeln des logarithmischen Extinktionssignals der logarithmischen Umwandlerschaltung (17) mittels eines Temperaturkoeffizienten (Vl) in Abhängigkeit von einer Temperaturinformation eines in die Reaktionslösung (14) unmittelbar eintauchenden Temperaturfühlers (20) vorgesehen ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Temperaturfühler (20) einen Thermistor, dessen Oberfläche mit einem Überzug aus Polytetrafluoräthylen versehen ist, aufweist.

Anfangsgeschwindigkeit einer chemischen Umsetzung, die Bestimmung der Enzymaktivität oder die Bestimmung der Geschwindigkeit der Enzymreaktion bezeichnet

Ein hierfür geeignetes Spektralphotometer ist derart ausgebildet, daß ein Proportionalitätsverhältnis zwischsn der Extinktion und der Zeit eingehalten wird, so daß eine Änderung der Extinktion zur Bestimmung der Enzymmenge benutzt werden kann. Insbesondere wird

ίο die Enzymmenge I. E. pro Liter wie folgt bestimmt: