DE2820441A1

DE2820441A1 - Verfahren und vorrichtung zum bestimmen der geschwindigkeit einer enzymreaktion

Info

Publication number: DE2820441A1
Application number: DE19782820441
Authority: DE
Inventors: Kazuo Hijikata
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1977-05-10
Filing date: 1978-05-10
Publication date: 1978-11-16
Also published as: DE2820441C3; DE2820441B2; US4224405A; JPS53138797A

Description

DR. ING. F. WUKSTHOFF «U.E. ν. PKCIIMANN

I)R. ING. I). BEnRKNS I)IPI,. ING. It. GOKTZ

PATENTANWÄLTE

SOOO MÜNCHEN 9O SCmv'EIGEHSTUASSE 2

TBLSVOH(080)062051 TKLEX 5 24 070

TELEOJtAMMK: 282044 I¹IiOTKCTPATKNT MÜ

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Anmelder:

Olympus Optical Company Limited 43-2, 2-Chome, Hatagaya, Shibuya-Ku, Tokyo, Japan

Titel:

Verfahren und Vorrichtung zum Bestimmen der Geschwindigkeit einer Enzymreaktion

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DK. ING. F. WtTESTHOFF I)R-E. ν. PECHMANN DIi. ING. D. BEHHBNS I)IPL. ING. K. GOEO₁ ¹Z PATENTANWÄLTE

80OO MÜNCHEN 9O SCHWEIGERSTRASSE 2 XELBFOK (089) 66ZO öl TSLEX 5 24 070

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Beschreibung

Verfahren und Vorrichtung zum Bestimmen der Geschwindigkeit einer Enzymreaktion

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Bestimmen der Geschwindigkeit einer Enzymreaktion, insbesondere ein Verfahren und eine Vorrichtung, mit denen die Enzymmenge in Blut durch eine chemische Umsetzung bestimmt wird.

Ein Enzym ist ein organischer, hochpolymerer Katalysator, der in biologischen Körpern anwesend ist und an nahezu jeder chemischen Reaktion teilnimmt, die innerhalb der biologischen Körper vor sich geht. Die in Blut enthaltene Enzymmenge kann nicht direkt bestimmt werden sondern wird normalerweise durch ein Alternativverfahren festgestellt, bei dem abgenommenem Blut Koenzym zugemischt und die Extinktion des Koenzyms festgestellt wird, die stellvertretend für eine entsprechende Menge Enzym steht. Genauer gesagt wird die Enzymmenge von der Geschwindigkeit der katalytischen Reaktion pro Zeiteinheit abgeleitete Eine derartige Bestimmung der Menge aktiven Enzyms in Blut wird normalerweise als die Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit einer chemischen Umsetzung, die Bestimmung der Enzymaktivität oder die Bestimmung der Geschwindigkeit der Enzymreaktion bezeichnet.

Die Anordnung einer für eine derartige Bestimmung benutzten Vorrichtung ist so getroffen, daß ein Proportionalitätsverhältnis zwischen der Extinktion und der Zeit eingehalten wird, so daß eine Änderung desselben zur Bestimmung der Enzymmenge benutzt werden kann. Insbesondere wird die Enzymmenge I.E_e pro Liter wie folgt bestimmt:

I.E./X = Δ A/min χ Κ

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(D

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V. χ V„ x 1000

■tr _ ΐ> I

worin t = ein Liter Blut, ^JA/min = Differenz in der Extinktion (optischen Dichte) pro Minute, V_f = Gesamtvolumen, V = Probenvolumen, V. = ein Temperaturkorrekturkoeffizient

S w

und C = ein Paktor, der sich auf die Bestimmung eines Koenzyms bei einer gegebenen optischen Wellenlänge beziehte

Die Gleichung (1) läßt sich wie folgt umschreiben: I.E./JL = ZU/min χ K¹ χ V_t (2) ■

V- x 1000

K¹

Es zeigt sich also, daß die Enzymmenge eine Punktion der Temperatur ist.

Der Unterschied in der Extinktion A A kann durch eine optische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit der Umsetzung bestimmt werden« Genauer gesagt wird ein Reagens in eine Reaktionslösung eingeführt, die in einem Reaktionsgefäß enthalten ist, und eine anfängliche Änderungsgeschwindigkeit pro Zeiteinheit in der Extinktion der Reaktionslösung wird als den Reaktionsgrad darstellend angenommen. In Pig. I, in der die Abszisse die Reaktionszeit t und die Ordinate die optische Dichte (0,D·) darstellt, sind verschiedene Kurven dargestellt, die Schwankungen in der Dichte wiedergeben, die beim Einführen des Reaktionsmittels auftreten. Die oben erwähnte Anfangsgeschwindigkeit zeigt sich in Änderungen ^E₁, » -4Eo der Extinktion pro Minute At₁ gemessen längs des

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Anfangsbereichs des linearen Segments der Kurven.

In der Vorrichtung, mit der die Geschwindigkeit der Enzymreaktion bestimmt wird, wird die Temperatur der Heaktionslösung durch eine Temperatursteuerung eines Thermostaten konstant gehalten, so daß ein fester Wert eines Temperaturkorrekturkoeffizienten, der in den Gleichungen (1) und (2) erscheint, benutzt werden kann. Eine bekannte Anordnung ist in Fig. 2 gezeigt, bei der ein Glasgefäß 1 eine thermostatische Flüssigkeit 2 enthält, die mit einer Heizvorrichtung 3 erwärmt wird» In den Körper der thermostatischen Flüssigkeit wird ein Temperaturfühler 4 eingeführt, um die Temperatur der Flüssigkeit festzustellen, so daß diese über eine automatische Steuerung der Heizvorrichtung 3 auf konstanter Temperatur gehalten werden kann. In die thermostatische Flüssigkeit 2 taucht eine Zelle 5 ein, die eine Reaktionslösung 6 enthält, und ein Lichtstrom P von gegebener optischer Wellenlänge wird hindurchgeleitet, um die Extinktion festzustellen.

Fig. 3 zeigt eine andere bekannte Anordnung, bei der ein thermostatischer Block 7 von einem Heizelement 8 aufheizbar ist, welches von einem Temperaturfühler 9 automatisch gesteuert ist, um den Block 7 auf konstanter Temperatur zu halten« In den Block 7 ist eine Zelle 11 eingepaßt, die eine Reaktionslösung 10 enthält. Der Block 7 hat zwei miteinander fluchtende Öffnungen 7a, durch die der Lichtstrom geleitet wird, um die Extinktion festzustellen»

Bei den herkömmlichen Anordnungen ist keine zufriedenstellende Temperatursteuerung der Reaktionslösung im Verlauf der Zeit oder bei Änderungen der Umgebungstemperatur zu erzielen. Es sei ausdrücklich erwähnt, daß die Temperatursteuerung der Eeaktionslösung einen wichtigen Gesichtspunkt bei der Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit darstellt. Wenn sich die Temperatur der Reaktionslösung nämlich um 1° C ändert, hat das einen Einfluß

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auf die Enddaten in einer Höhe von IO %„ Es sei außerdem noch darauf hingewiesen, daß selbst "bei einer Verbesserung der Genauigkeit der Temperatursteuerung nach Wunsch die Exaktheit der Temperatursteuerung der in der Zelle enthaltenen Reaktionslösung noch nicht verbessert wird, denn die Steuerung richtet sich auf den Thermostaten selbst„ Wenn nämlich ein Reagens in die Reaktionslösung eingeführt wird, ergibt sich sofort eine Erniedrigung der Temperatur der Reaktionslösung. Das zeigt, daß die Bestimmung mit den bekannten Anordnungen unter Bedingungen reduzierter Temperatur vorgenommen wurde.

Aufgabe der Erfindung ist es> ein Verfahren zum Bestimmen der Geschwindigkeit einer Enzymreaktion zu schaffen, mit dem die oben genannten Nachteile dadurch vermieden sind, daß korrekte Daten erhalten werden, die nicht dem Einfluß von Temperaturänderungen unterliegen, ohne daß eine genaue Temperatursteuerung eines Thermostaten nötig wäre»

Aufgabe der Erfindung ist es auch, eine Vorrichtung zum Bestimmen der Geschwindigkeit einer Enzymreaktion zu schaffen, die optimal geeignet ist, das Verfahren auszuführen»

Gemäß der Erfindung ist es nicht nötig, die Temperatur der untersuchten Reaktionslösung konstant zu haltenf statt dessen kann die Temperatur der Lösung schwanken. Allerdings findet die TemperaturSchwankung ihren Niederschlag in der Ableitung der Enddaten hinsichtlich der Enzymmenge. Auf diese Weise kann die Enzymmenge sehr exakt bestimmt werden. Da keine genaue Temperatursteuerung des Thermostatblocks nötig ist, läßt sich die Temperatursteuerung gegenüber der bekannten Anordnung außerordentlich stark vereinfachen.

Gemäß der Erfindung wird die Temperatur der Reaktionslösung direkt gemessen und die erhaltenen Temperaturangaben

die zur Korrektur von Daten verwendet, die über/Enzymmenge erhalten

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BAD ORIGINAL

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wurden.

Die Geschwindigkeit der Enzymreaktion wird durch Bestimmung der Enzymmenge festgestellt indem die Reaktionsgeschwindigkeit pro Zeiteinheit einer Reaktionslösung abgeleitet wird, deren Extinktion proportional zur Zeit ist. Ein Temperaturkorrekturkoeffizient₍ der während der Bestimmung der Enzymmenge verwendet wird, wird von Temperaturinformation abgeleitet, die ein Temperaturfühler liefert, welcher in der zu untersuchenden Reaktionslösung angeordnet ist« Zu der zum Bestimmen der Reaktionsgeschwindigkeit verwendeten Vorrichtung gehört ein Thermostatblock, der die Reaktionslösung enthält, ein Temperaturfühler, der unmittelbar in der Lösung angeordnet ist, ein photoelektrisches Wandlerelement, welches auf die Lichtübertragung durch die Lösung anspricht, um die optische Dichte der Lösung zu bestimmen, eine logarithmische Umwandlungsschaltung, die das Signal des Wandlerelements in ein entsprechendes Extinktionssignal umwandelt, und eine KoäBTlzienten-Umwandlungsschaltung, die auf die Kombination des Extinktionssignals und von Temperaturinforraation des Temperaturfühlers anspricht, um einen Temperaturkoeffizienten zu korrigieren.

Die Lösung der der Erfindung zugrunde liegenden Aufgabe ist im einzelnen in den Ansprüchen definiert«

Im folgenden ist die Erfindung mit weiteren vorteilhaften Einzelheiten anhand eines schematisch dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:

Fig. 1 eine graphische Darstellung, bei der die optische Dichte über der Reaktionszeit eingetragen ist und die zeigt, daß die Extinktion von der Anfangsgeschwindigkeit dargestellt istf

Fig. 2 und 3 Schnitte durch bekannte Thermostaten, die bei der Bestimmung der Enzymreaktionsgeschwindigkeit ver-

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wendet werden!

Fig» ty einen Schnitt durch einen Thermostatblock in Kombination mit einem Blockschema durch die zum Ausführen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete AnordnungJ

Fig. 5 ein Schaltschema des in Fig. ty gezeigten Koeffizienten-Umwandlungsschaltkreises.

In Fig. ty ist eine allgemeine Anordnung einer Vorrichtung gemäß der Erfindung zum Bestimmen der Geschwindigkeit einer Enzymreaktion dargestellt« In einem Thermostatblock 12 ist eine durchsichtige Zelle 13 aufgenommen, die eine Menge einer Reaktionslösung lty enthält. Der Thermostatblock 12 hat zwei miteinander fluchtende Öffnungen 12a, durch die ein Lichtstrom P von gegebener optischer Wellenlänge hindurchgeleitet wird, um die Dichte der Lösung festzustellen. Der Lichtstrom P, der die Reaktionslösung lty durchdrungen hat, trifft auf ein lichtelektrisches Wandlerelement 15, welches eine Siliziumblauzelle oder dgl. aufweisen kann. Das Wandlerelement 15 erzeugt ein Differentialextinktionssignal, welches zunächst an einen Verstärker 16 angelegt wird, ehe es in eine logarithmische Umwandlungsschaltung 17 von bekannter Art eingegeben wird. Der Ausgang der Umwandlungsschaltung 17 wird an eine Koeffizienten-Umwandlungsschaltung 18 angelegt, die die Berechnung von Δ A/min χ Κ durchführt.

In die Reaktionslösung lty ist ein Temperaturfühler 20, beispielsweise ein Thermistor direkt eingetaucht. Um Verschmutzungswirkungen auf ein Minimum einzuschränken, ist die Oberfläche des Temperaturfühlers 20 so behandelt, daß sie wasserabstoßend wirkt, z.B. durch eine Beschichtung mit Teflon. Es liegt auf der Hand, daß restliches Blut, das noch an der Wandoberfläche der im vorhergehenden Meßzyklus verwendeten Zelle 13 haftet, durch Spülen der Zelle I3 entfernt werden kann» so daß verhindert wird, daß es dem als nächstes in die Zelle

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eingefüllten frischen Blut zugemischt wird und dieses verschmutzt. Die Behandlung des Temperaturfühlers 20, die diesen abstoßend macht, hat den Sinn, eine ähnliche Verschmutzung des frischen Bluts durch möglicherweise anhaftendes altes Blut zu vermeiden. Der Temperaturausgang des Temperaturfühlers 20 wird über einen Verstärker 19 an die Koeffizienten-Umwandlungsschaltung 18 gegeben. Wie Fig. 5 zeigt, weist die Koeffizienten-Umwandlungsschaltung 18 einen Analogrechenschaltkreis von bekannter Bauart auf, zu dem Verstärker 22, 23, ein Analog-Digital-Wandler 24, Feldeffekttransistoren Ql bis Qn, Widerstände Ba bis He und Bl bis Bn und eine Vorspannungsquelle 25 gehören. Die Kombination aus Vorspannungsquelle 25 und Widerstand Bc liefert eine geeignete Vorspannung für den Verstärker 22, dem ein Temperaturausgang vom Verstärker 19 zugeführt wird. Der Ausgang des Verstärkers 22 liegt am Analog-Digital-Wandler 24 an« Die einzelnen Feldeffekttransistoren Ql bis Qn sind an entsprechende Ausgangsklemmen des Analog-Digital-Wandlers angeschlossen, und die Ausgangsklemmen der einzelnen Transistoren sind mit den einzelnen Widerständen Bl bis Bn verbunden. Die anderen Enden der Widerstände Bl bis Bn sind gemeinsam über den Widerstand Bd an den Eingang des Verstärkers 23 angeschlossen. Der Ausgang der Umwandlungsschaltung 17 liegt an der gleichen Eingangskiemme des Verstärkers 23 über den Widerstand Be an, während der Ausgang des Verstärkers 23 über einzelne Tore mit den entsprechenden Feldeffekttransistoren und auch mit einem Ausgabedrucker 21 gekoppelt ist.

Beim Gebrauch der Vorrichtung wird die Zelle I3, die das Blut oder die zu untersuchende Beaktionslösung 14 enthält, im Thermostatblock 12 aufgenommen, der auf konstanter Temperatur gehalten wird. Anschließend wird der Temperaturfühler 20, der vorzugsweise so konstruiert ist, daß er eine reduzierte Heizkapazität hat, in die Beaktionslösung 14 eingeführt. Der

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Beaktionslösung 14 wird ein Reagens zugefügt, und nach einer Zeitspanne von ca. 30 Sekunden wird ein Lichtstrom F von gegebener Wellenlänge durch die Öffnungen 12a und durch die Reaktionslösung Ik geleitet. Zwischen der Reaktionslösung 14 und dem Reagens erfolgt eine chemische Umsetzung, die eine Änderung der optischen Dichte der Lösung im Verlauf der Seit hervorruft. Die Änderung der Extinktion über eine Zeitspanne von einer Minute wird gemessen. Der Lichtstrom P trifft auf ein Wandlerelement 15, welches ihn in ein entsprechendes elektrisches Signal umwandelt. Die Umwandlungsschaltung 17 wandelt dies in ein entsprechendes logarithmisches Signal um, welches in die Koeffizienten-Umwandlungsschaltung 18 eingegeben wird.

Der Temperaturfühler erzeugt einen Temperaturausgang und liefert diesen über den Verstärker 19 an die Koeffizienten-Umwandlungsschaltung 18β In Abhängigkeit von dem Temperatursignal bewirkt der Analog-Digital-Wandler 7Ä in der Koeffizienten-Umwandlungsschaltung 18, daß die Feldeffekttransistoren Ql bis Qn entsprechend der Temperaturinformation leitend werden und einen entsprechenden Eingang an den Verstärker 23 liefern. Auf diese Weise wird der Temperaturkorrekturkoeffizient V. entsprechend der Reaktionslösungsteraperatur geändert, um sicherzustellen, daß der Verstärker 23 den exakten Wert der Enzymmenge I.E. abgibt. Die korrigierten Daten werden dann vom Ausgabedrucker 21 gedruckt.

Das oben beschriebene Korrektursystem verbessert die Genauigkeit des Wertes der Enzymmenge I₀E. gegenüber dem mit der bekannten Anordnung erhaltenen Wert.

Die Koeffizienten-Umwandlungsschaltung 18 ist bei dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel als Analogschaltung konstruiert. Sie kann jedoch auch durch die Funktion eines Computers oder einer zentralen Verarbeitungseinheit mit einem

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Speicher ersetzt sein, in dem die sich ändernden Werte des Koeffizienten für Temperaturänderungen gespeichert und entsprechend einem Ausgang von einem Analog-Digital-Wandler ausgegeben werden, um auf diese Weise A A/min χ K oder die Enzymmenge I.E. zu berechnen.

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te .

Leerseite

Claims

Ansprüche

lj Verfahren zum Bestimmen der Geschwindigkeit einer Enzymreaktion, bei dem eine Enzymmenge anhand der Reaktionsgeschwindigkeit einer Reaktionslösung, deren Extinktion proportional zur Zeit ist, pro Zeiteinheit bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet , daß ein Temperaturfühler (20) in der Reaktionslösung (14) zum Messen der Temperatur derselben angeordnet ist, und daß die Temperaturinformation des Temperaturfühlers zum Abwandeln eines Temperaturkorrekturkoeffizienten (V.) verwendet wird, um eine Korrektur einer Änderung der Enzymmenge zu liefern, die sich aus einer Temperaturänderung ergibt.

2β Vorrichtung zum Bestimmen der Geschwindigkeit einer Enzymreaktion, bei der eine Enzymmenge anhand der Reaktionsgeschwindigkeit einer Reaktionslösung, deren Extinktion proportional zur Zeit ist, pro Zeiteinheit bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet , daß ein Thermostatblock (12) eine durchsichtige Zelle (I3) aufnimmt, die eine Menge einer Reaktionslösung (1*0 enthält, daß ein Temperaturfühler (20) zum Messen der Temperatur in der Reaktionslösung angeordnet ist, daß ein lichtelektrisches Wandlerelement (15)» welches auf einen durch die im Thermostatblock angeordnete Reaktionslösung [Ik) hindurch geleiteten Lichtstrom (P) anspricht, die optische Dichte der Reaktionslösung bestimmt, daß eine logarithmische Umwandlungsschaltung (17) ein elektrisches Signal des Wandlerelements in ein Signal umwandelt, welches die Extinktion der Reaktionslösung wiedergibt, daß eine Koeffizienten-Umwandlungsschaltung (18), die auf das Extinktionssignal der logarithmischen Umwandlungsschaltung und auf Temperaturinformation des Temperaturfühlers (20) anspricht, einen Temperaturkorrekturkoeffizienten

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(V,) abwandelt, der zum Bestimmen der Enzymmenge verwendet wird, und daß ein Ausgabedrucker (21) die Ergebnisdaten der Koeffizienten-Umwandlungsschaltung (18) ausdruckt.

3« Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß der Temperaturfühler (20) einen Thermistor aufweist, dessen Oberfläche zum Verhindern von Verschmutzungen mit einem Iberzug aus Teflon (folytetrafluorethylen) versehen ist.

OFUGIHAL

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