DE2748213C2 - - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Thymosin α₁, ein Verfahren zu dessen Gewinnung und dieses enthaltende pharmazeutische Präparate gemäß den voranstehenden Patentansprüchen.

Es ist heutzutage eine allgemein anerkannte Tatsache, daß der Thymusdrüse eine zentrale Bedeutung in der Entwicklung und Alterung des Immunsystems von Mensch und Tier zukommt. Obgleich noch sehr wenig Wissen über die molekularen Vorgänge existiert, durch die die Thymusdrüse die Entwicklung der T-Zellen kontrolliert, scheint es, daß ein wesentlicher Teil dieses Mechanismus hormonal gesteuert wird. DieThymusdrüse produziert eine Gruppe von Polypeptiden, Thymosin genannt, und vielleicht eine Anzahl anderer Thymushormone und/oder Thymusfaktoren, die eine wichtige Rolle bei der Reifung, Differenzierung und Funktion der T-Zellen spielen. Es wurde festgestellt, daß das Thymosin die Differenzierung der T-Zellen induziert und immunologische Funktionen verstärkt bei genetisch athymischen Mäusen, ausgewachsenen thymektomierten Mäusen, NZB-Mäusen mit starken Autoimmunreaktionen, bei tumorhaltigen Mäusen und Mäusen mit einer Casein-induzierten Amyloidose.

Es ist bekannt, daß die Thymusfraktion 5 (s. Hooper et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 249, (1975) 125-144) ein wirksames immunpotenzierendes Präparat ist, das bei der Wiederherstellung von Immunfunktionen bei Individuen ohne Thymusdrüse und/oder ohne Immunsystem wie die Thymusdrüse selbst wirken kann. Andauernde klinische Versuche mit der Thymusfraktion 5 scheinen die Vermutung zu belegen, daß das Thymosin sowohl bei Kindern, die an einem Thymus-abhängigen primären Immundefekt leiden, als auch bei Krebskranken mit eingeschränkter Immunabwehr, die Anzahl der T-Zellen erhöht.

Mit analytischen Methoden konnte gezeigt werden, daß die Thymusfraktion 5 aus 10-15 Haupt- und 20 oder mehr Nebenkomponenten mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 15 000 besteht.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein in der Thymosinfraktion 5 vorkommendes saures Polypeptid, das Thymosin α₁ genannt wurde und dessen Aminosäuresequenz aufgeklärt werden konnte, sowie dessen Isolierung und Reindarstellung aus dieser Thymusfraktion 5. Thymosin α₁ besitzt in verschiedenen in-vitro- und in-vivo-Tests, die ein Maß für die T-Zellen-Differenzierung und -Funktion sind, verglichen mit der Thymosinfraktion 5 die 10 - 1000fache Aktivität.

Thymosin α₁ besitzt das Molekulargewicht 3108, ein pI im Bereich von 4,0-4,3 (bestimmt durch isoelektrische Fokussierung in einem Gel bei pH 3-5) und die folgende Aminosäuresequenz:

(N-Acetyl)-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile- Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu- Ala-Glu-Asn-OH.

Die erfindungsgemäße Isolierung und Reindarstellung des Thymosin α₁ aus der Thymosinfraktion 5 erfolgte durch eine Kombination von Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration in der folgenden Weise:

• a) Die lyophilisierte Thymosinfraktion 5 wurde an einer Säule aus Carboxymethyl-cellulose in einem aus 10 mM Natriumacetat und 1,0 mM 2-Mercaptoäthanol bestehenden Puffer vom pH 5,0 chromatographiert, wobei die Säule zunächst mit diesem Puffer gewaschen und dann mit einem linearen Gradienten aus diesem Puffer und einem Gemisch aus diesem Puffer und einer 1,0 M Natriumchloridlösung eluiert wurde.
• b) Der erste gemäß a) erhaltene Proteinpeak wurde an einer Dextrangel-Säule (Sephadex® G-25) fraktioniert unter Verwendung von sterilem Wasser.
• c) Der zweite gemäß b) erhaltene Proteinpeak wurde auf eine mit 50 mM Tris/1,0 mM 2-Mercaptoäthanol-Puffer vom pH 8,0 äquilibrierte Säule aus 2-Diäthylaminoäthyl-cellulose (DE-32) gebracht. Es wurde zunächst mit diesem Puffer und dann mit einem linearen Gradienten aus 1,3 l dieses Puffers und 1,3 l dieses Puffers mit einem Gehalt von 0,8 M Natriumchlorid eluiert.
• d) Diejenigen Fraktionen, die das erste Sechstel des gemäß c) erhaltenen Proteinpeaks enthielten, wurden vereinigt und weiter an einer Dextrangel-Säule (Sephadex® G-75) in einem Puffer aus 6,0 M Guanidinhydrochlorid und 10 mM Tris vom pH 7,5 gereinigt.
• e) Schließlich wurden die mittleren Fraktionen des gemäß d) erhaltenen Proteinpeaks an einer Dextrangel-Säule (Sephadex® G-10) unter Verwendung von sterilem Wasser entsalzt.

Die so erhaltene, gereinigte Proteinfraktion (Ausbeute 0,6%) wurde als Thymosin α₁ mit der oben angegebenen Aminosäuresequenz identifiziert. Das Präparat war frei von Kohlenhydraten und Nucleotiden. Die Strukturaufklärung und Bestimmung der Aminosäuresequenz erfolgte nach den allgemeinen üblichen Methoden, d. h. durch enzymatischen Abbau mit Trypsin, Chymotrypsin, Thermolysin oder Subtilisin, Auftrennung der Bruchstücke durch Papierelektrophorese und/oder Chromatographie und Edman-Abbau der einzelnen Peptidfragmente.

Die folgende Tabelle zeigt die um den Faktor 10-1000 größere biologische Aktivität von Thymosin α₁ verglichen mit der der Thymusfraktion 5 in drei bekannten Bioassays, nämlich dem Mitogen-Test an Mäusen, dem Lymphokin-Test (einem in-vitro-Test, mit dem die Produktion des Makrophagenmigrationshemmungsfaktors, MIF, gemessen wird) und dem E-Rosetten-Test mit menschlichen Lymphozyten.

Thymosin α₁ kann an Menschen und Säugetiere parenteral und zwar intravenös, subcutan oder intramuskulär verabreicht werden. Bei intravenöser Applikation liegt die tägliche Dosis gewöhnlich im Bereich von 1-100 µg/kg Körpergewicht. Es ist selbstverständlich, daß sie von Fall zu Fall variiert und abhängt von der Art der Erkrankung, ihrer Stärke und Dauer. Eine zweckmäßige pharmazeutische Dosiseinheit ist 1 mg lyophilisiertes Thymosin α₁, das kurz vor Gebrauch durch Zusatz von sterilem Wasser oder Kochsalzlösung in Lösung gebracht werden kann.

Die Erfindung umfaßt auch die physiologisch verträglichen Salze des Thymosins α₁, d. h. Salze mit Säuren und Basen. Beispiele derartiger Salze sind das Natrium- oder Kaliumsalz, Salze mit starken organischen Basen wie Guanidin oder Säureadditionssalze wie Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Malat, Maleat, Acetat, Citrat, Succinat, Benzoat und Ascorbat.

Claims (3)

1. Thymosin α₁ der Formel H₃C-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser- Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys- Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OHund dessen physiologisch verträgliche Salze.

2. Verfahren zur Gewinnung von Thymosin α₁ aus der Thymosinfraktion 5, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) die lyophilisierte Thymosinfraktion 5 an einer Säule aus Carboxymethyl-cellulose in einem Natriumacetat/2-Mercaptoethanolpuffer mit einem pH-Wert von 5,0 chromatographiert, wobei man die Säule zunächst mit diesem Puffer wäscht und dann mit einem linearen Gradienten aus diesem Puffer und einer Mischung aus diesem Puffer und 1-M-Natriumchloridlösung eluiert,
• b) die erste gemäß a) erhaltene Proteinfraktion an einer Dextrangel-Säule fraktioniert,
• c) die zweite gemäß b) erhaltene Proteinfraktion an einer Säule aus 2-Diethylaminoethyl-cellulose in einem Tris/2-Mercapto­ ethanol-Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 chromatographiert, wobei man zunächst mit diesem Puffer und dann mit einem linearen Gradienten aus diesem Puffer und einer Mischung aus diesem Puffer und 0,8-M- Natriumchloridlösung eluiert,
• d) das erste Sechstel der gemäß c) erhaltenen Proteinfraktionen über eine Säule eines Dextrangels in einem Guanidin­ hydrochlorid/Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 gibt und
• e) die mittleren Fraktionen der gemäß d) erhaltenen Proteinfraktionen an einer Dextrangel-Säule entsalzt.

3. Pharmazeutische Präparate enthaltend Thymosin α₁ oder ein physiologisch verträgliches Salz davon.