DK149094B - Fremgangsmaade til fremstilling af thymosin alfa1 eller fysiologisk acceptable salte deraf med syrer eller baser ud fra thymosinfraktion 5 - Google Patents

Description

149094

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af det hidtil ukendte thymosin eller fysiologisk acceptable salte deraf med syrer eller baser ud fra thymosin fraktion 5.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i kravets 5 kendetegnende del angivne.

Det er i vore dage en alment anerkendt kendsgerning, at thymus har én central betydning for udviklingen og ældningen af immunsystemet hos mennesker og dyr. Selv om der endnu kun eksisterer ringe viden om den molekylære mekanisme, hvorved thymus styrer T-cellernes 10 udvikling, tyder det på, at en væsentlig del af denne mekanisme styres hormonalt. Thymus producerer en gruppe af polypeptider, som kaldes thymosin, og måske et antal andre thymushormoner og/eller thymusfaktorer, som spiller en vigtig rolle for T-cellernes modning, differentiering og funktion. Det har vist sig, at thymosinet inducerer 15 T-cellernes differentiering og forstærker immunologiske funktioner hos genetisk athymiske mus, hos fuldvoksne thymektomerede mus, hos NZB-mus med stærke autoimmunreaktioner, hos mus med tumorer og hos mus med en casein-induceret amyloidose.

Det er kendt, at thymusfraktion 5 er et virksomt immunpotenserende 20 præparat, som kan virke ligesom thymus ved genoprettelsen af immunfunktioner hos individer uden thymus og/eller uden immunsystem. Vedvarende kliniske forsøg med thymusfraktion 5 synes at begrunde . formodningen om, at thymosinet forhøjer T-cellernes antal både hos børn, som lider af en thymus-afhængig primær immundefekt, og ved 25 kræftsygdomme med indskrænket immunforsvar.

Ved analytiske metoder kan det vises, at thymusfraktion 5 består af 10-15 hoved- og 20 eller flere bibestanddele med en molekylvægt på mellem 1000 og 15000.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af 30 et i thymosinfraktion 5 forekommende surt polypeptid, som kaldes thymosin a^, og hvis aminosyresekvens har kunnet opklares, ved isolering og renfremstilling ud fra denne thymusfraktion 5. Thymosin 2 149094 a.j viser ved forskellige in-vitro- og /n-wVo-tests, som giver et mål for T-celledifferentieringen og -funktionen, i sammenligning med thymosinfraktion 5 en 10 - 1000 gange så stor aktivitet.

Thymosin har en molekylvægt på 3108, en pl-værdi i området 5 4,0-4,3 (bestemt ved isoelektrisk fokusering i en gel ved en pH-værdi i området 3-5) og den følgende aminosyresekvens: (N-Acetyl)-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-lle-Thr-Thr-

Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH.

Isoleringen og renfremstillingen af thymosin ud fra thymosinfrakti-10 on 5 sker ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved en kombination af ionbytterchromatografi og gelfiltrering på følgende måde: a) Den lyofiliserede thymosinfraktion 5 chromatograferes på en kolonne med carboxymethylcellulose i en natriumacetat/2-mercaptoethanol-puffer, som er 10 millimolær med hensyn til natriumacetat og 1,0 15 millimolær med hensyn til 2-mercaptoethanol, og som har en pH-værdi på 5,0, hvorhos kolonnen først vaskes med denne pufferopløsning og derefter elueres med en lineær gradient af denne puffer og en 1:1 (vol/vol) blanding af denne puffer og pufferen med et indhold på 1,0M natriumchlorid.

20 b) Den første i trin a) vundne "proteintop" fraktioneres på en dex-trangelkolonne (Sephadex G-25) under anvendelse af sterilt vand.

c) Den anden i trin b) vundne "proteintop" chromatograferes på en kolonne med 2-diethylaminoethyl-cellulose (DE-32), i tris(hydroxyme-thyl)aminomethan(tris)/2-mercaptoethanol-pufferopløsning, der er 50 25 mM med hensyn til tris og 1,0 mM med hensyn til 2-mercaptoethanol og med pH-værdi 8,0. Der elueres først med denne puffer og derpå med en lineær gradient af denne puffer og denne puffer med et indhold på 0,8M natriumchlorid.

d) De fraktioner, som indeholder den første sjettedel af de i trin c) 30 vundne "proteintoppe", forenes og renses yderligere på en dextran- 3 149094 / gelkolonne (Sephadex G-75) i en guanidinhydrochlorid/tris-puffer, der er 6,OM med hensyn til guanidinhydrochlorid og 10 milliM med hensyn til tris og med en pH-værdi på 7,5.

e) Til slut afsaltes de midterste fraktioner af de i trin d) vundne 5 "proteintoppe" på en dextrangelkolonne (Sephadex G-10) under anvendelse af sterilt vand.

Det fremkomne thymosin kan derefter om ønsket omdannes til et fysiologisk acceptabelt salt deraf med en syre eller base.

Eksempler på sådanne salte er natrium- eller kaliumsaltet, salte med 10 stærke organiske baser såsom guanidin eller syreadditionssalte såsom hydrochlorid, hydrobromid, sulfat, phosphat, malat, maleat, acetat, citrat, succinat, benzoat og ascorbat.

Den således fremstillede, rensede proteinfraktion (udbytte 0,6%) identificeres som thymosin med den ovenfor angivne aminosyresek-15 vens. Præparatet er frit for carbonhydrater og nucleotider, Strukturopklaringen og bestemmelsen af aminosyresekvensen sker ved de almindelige sædvanlige metoder, dvs. ved enzymatisk nedbrydning med trypsin, chymotrypsin, thermolysin eller subtilisin, opspaltning af fragmenterne ved papirelektroforese og/eller chromatografi og 20 Edman-nedbrydning af de enkelte peptidfragmenter.

Af den nedenstående tabel fremgår den med faktoren 10-1000 gange større biologiske aktivitet af thymosin α^, sammenlignet med aktiviteten af thymusfraktion 5 ved tre kendte bioforsøg, nemlig mitogentes-ten på mus, lymphokin-testen (en in-vitro-test, hvorved produktionen 25 af makrophagmigrationshæmningsfaktoren, MIF, måles) og E-rosette-testen med menneskelige lymfocyter.

Claims (1)

10 Thymosin α-j kan til mennesker og pattedyr administreres parenteralt, nemlig intravenøst, subcutant eller intramuskulært. Ved intravenøs administration ligger den daglige dosis sædvanligvis i området 1-100 lig/kg legemsvægt. Det er selvfølgeligt, at den varierer fra tilfælde til tilfælde og afhænger af sygdommens art, dens styrke og varighed. En 15 hensigtsmæssig farmaceutisk dosisenhed er 1 mg lyofiliseret thymosin ct.|, som kort før anvendelsen kan opløses i sterilt vand eller en kogsaltopløsning. Fremgangsmåde til fremstilling af thymosin med aminosyresekvensen 20 (N-Acetyl)-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-lle-Thr- Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH eller fysiologisk acceptable salte deraf med syrer eller baser ud fra thymosinfraktion 5, kendetegnet ved, 25 a) at den lyofiliserede thymosinfraktion 5 chromatograferes på en kolonne med carboxymethylcelluJose i en natri umacetat/2-mercapto-ethanol-puffer, der er 10 milliM med hensyn til natriumacetat og 1,0 milliM med hensyn til 2-mercaptoethanol og med pH-vaerdi 5,0, hvorhos kolonnen først vaskes med denne puffer og derpå elueres med en 30 lineær gradient af denne puffer og en 1:1 (vol/vol) blanding af denne puffer og pufferen med et indhold på 1,0M natriumchlorid,