DE2712004B1 - Verfahren zur Bestimmung von Formiat oder in Formiat ueberfuehrbaren Verbindungen und hierfuer geeignetes Reagens - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von Formiat oder in Formiat ueberfuehrbaren Verbindungen und hierfuer geeignetes Reagens

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Description

HCOO f ΝΛΙ)' f Fl2O
Formia.dchydrogenas(
ygL>
ίο Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung oder Beseitigung von Formiat oder in Formiat überführbaren Verbindungen, wie Oxalat, durch Umsetzung in Gegenwart von FDH und einem Wasserstoffakzeptor ist daher dadurch gekennzeichnet, daß FDH aus
ι -> Candida boidinü DSM 941 verwendet wird.
Das Verfahren der Erfindung eignet sich aufgrund seiner quantitativen Umsetzung von Formiat nicht nur zur Bestimmung des Formiats, sondern auch zur Beseitigung von Formiat aus dieses enthaltenden
_>o Lösungen, beispielsweise bei analytischen oder präparativen Arbeiten, bei denen Formiat stört
Ebenso kann das Verfahren der Erfindung auch zur Bestimmung von in Formiat überführbaren Verbindungen, wie z. B. Oxalat verwendet werden. Oxalat läßt sich
_>-> beispielsweise in bekannter Weise mit Oxalatdecarboxylase in Formiat gemäß nachfolgender Gleichung überführen:
H2O + C2O4
Oxalatdecarboxylase
> HC(V t- HCOO (2)
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung oder Beseitigung von Formiat oder in Formiat r> überführbaren Verbindungen, wie Oxalat, durch Umsetzung in Gegenwart von Formiatdehydrogenase und einem Wasserstoffakzeptor.
Die Bestimmung von Formiat mit Hilfe von Formiatdehydrogenase aus Pseudomonas oxalaticus in w Gegenwart eines Wasserstoffakzeptors, wie Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD), ist bekannt beispielsweise aus H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, 3. Auflage, 1974, S. 1597 bis 1600, Verlag Chemie Weinheim. Dieses Enzym weist 4> jedoch den Nachteil auf, daß keine zum Formiatverbrauch stochiometrische NADH-Bildung auftritt was auf zwei Nebenaktivitäten der Formiatdehydrogenase (FDH) zurückzuführen ist welche NADH wieder oxidiert An der genannten Literaturstelle wird aus- ~>o drücklich darauf hingewiesen, daß es sich bei dieser NADH- bzw. Formiat-Oxidasewirkung nicht um eine Verunreinigung, sondern um echte Nebenaktivitäten der FDH handelt Infolgedessen sind die erhaltenen Werte stets niedriger als die theoretischen Werte. Der τ> Proportionalitätsfaktor muß dabei für jedes Enzympräparat von neuem durch Eichen gegen eine Formiatstandardlösung festgelegt werden.
Auch bei einem Candida N-16-Extrakt (Agr. Biol. Chem. 36, 2297 [1972]) wurde gefunden, daß bei Inkubation mit Formiat und NAD durch Nebenreaktionen keine Stöchiometrie erzielt wird.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, diesen Nachteil zu beseitigen.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß FDH aus Candida boidinü DSM 941 den Nachteil der bekannten FDH-Präparate nicht aufweist und Formiat quantitativ zu CO2 oxidiert unter stöchiometrischer Reduktion des Andere, in Formiat überführbare Verbindungen, die erfindungsgemäß bestimmt werden können, sind z. B. Formyl-CoA, Formylphosphat, Formyl-Tetrahydrofolsäure-Derivate sowie gewisse Polyole nach oxidativer Spaltung, z. B. mit Bleitetraacetat
FDH aus verschiedenen Candida boidinü-Stämmen ist bekannt Für keines dieser Enzyme konnte bisher die beim erfindungsgemäß verwendeten Enzym vorliegende quantitative Oxidation des Wasserstoffakzeptors aufgefunden werden. Die aus den verschiedenen Candida biodinü gewonnenen Enzyme wurden vielmehr dem aus Pseudomonas oxalaticus gewonnenen Enzym als sehr ähnlich befunden (Arch. Microbiol. 90, 263, [1973]).
Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Enzym kann nach an sich für die Gewinnung von FDH bekannten Methoden aus dem Mikroorganismus gewonnen werden.
Bevorzugt wird jedoch ein Verfahren, bei welchem ein auf Methanol gezüchteter Mikroorganismus eingesetzt durch Antolyse aufgeschlossen und dann mit Polyäthylenimin behandelt wird. Im Überstand der Polyäthyleniminfällung findet sich das gesuchte Enzym und kann an Phosphatgel adsorbiert und daraus wieder mit Phosphatpuffer extrahiert werden. Die so gewonnene Fraktion eignet sich bereits aufgrund ihrer spezifischen Aktivität von 13 bis 1,4 U/mg für die Formiatbestimmung. Zweckmäßig erfolgt jedoch eine weitere Aufreinigung durch Ammonsulfatfraktionierung und Chromatographie über schwach basische Ionenaustauscher. Eine Feinreinigung kann schließlich durch Behandlung mit Hydroxylapatit erfolgen, welches noch vorhandene Verunreinigungen absorbiert ohne die FDH zu binden.
Die Reaktion kann bei pH-Werten durchgeführt
ORIGINAL INSPECTED
werden, bei denen das Enzym aktiv ist, d. h. zwischen etwa 5,5 und 10. Bevorzugt werden pH 6,5 bis 9,5. Als Puffer eignet sich besonders Phosphatpuffer. Aber auch andere Puffer, die im genannten Bereich wirksam sind, können verwendet werden. Derartige Puffer sind dem Fachmann bekannt.
Die Züchtung von Candida boidinii DSM 941 kann unter Anwendung der üblichen Züchtungsmethoden und Medien mit Gehalt an Methanol erfolgen. Methanol wird dem Medium zugesetzt, um adaptativ einen höheren Gehalt an FDH in den Mikroorganismen zu erzielen. Ein besonders geeignetes Wachstumsmedium ist in Arch. Microbiol. 84,29 bis 42 (1972) beschrieben, es besteht im wesentlichen aus Hefeextrakt, Malzextrakt, Glucose sowie Methanol.
Ein anderes geeignetes Medium enthält außer Methanol und Hefeextrakt lediglich noch Kalium, Ammonium, Magnesium, Cl-, PO4- und SO4-Ionen sowie Spurenelemente.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur Bestimmung von Formiat oder von in Formiat überführbaren Verbindungen, welches Formiatdehydrogenase, einen Wasserstoffakzeptor und Puffer enthält und dadurch gekennzeichnet ist, daß es Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii DSM 9^ 1 enthält
Als Wasserstoffakzeptor enthält das erfindungsgemäße Reagens vorzugsweise NAD. In einer besonders bevorzugten Zusammensetzung besteht das Reagens im wesentlichen aus 0,1 bis 10 mMol/1 NAD, 10 bis 250 mMol/l Phosphatpuffer und 0,05 bis 5 U/ml Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii DSM 941, jeweils bezogen auf die wäßrige Lösung des Reagens.
Das erfindungsgemäße Reagens kann daneben noch Stabilisatoren für das Enzym oder/und für NAD, Sequestrierungsmittel und gegebenenfalls ein oberflächenaktives Mittel enthalten.
Durch die Erfindung werden die Nachteile der bisher bekannten Verfahren zur Bestimmung von Formiat, die vor allem darin lagen, daß die Umsetzung mit dem Wasserstoffakzeptor nicht quantitativ erfolgte, beseitigt Die Erfindung ermöglicht es daher, die bisher nötige Bestimmung von Korrekturgliedern für die Auswertung der Meßresultate entfallen zu lassen und eignet sich daher insbesondere auch für die Anwendung in Analysenautomaten.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.
Beispiel
A. Gewinnung des Enzyms
400 g auf Methanol gezüchtete Candida boidinii DSM 941 in tiefgefrorenem Zustand werden in 1200 ml 5OmM Ammonsulfatlösung aufgetaut und etwa 1 Stunde bei 370C gehalten. Dann wird die Suspension mit einer 10%igen Polyäthyleniminlösung, pH 7,5, versetzt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, der Überstand wird mit 9 Vol.-% Phosphatgel, pH 7,5, versetzt und r, nach 30 Minuten zentrifugiert Nach Waschen mit 0,5 M NaCl-Lösung wird das Gel mit 0,2 M Phosphatpuffer, pH 7,5, extrahiert. Die Extrakte werden auf 3,2 M Ammonsulfat versetzt unter Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von 7,5. Der gebildete Niederschlag wird
ίο abgetrennt und nach Auflösen in Phosphatpuffer, pH 7,5, über DEAE-Zellulose (mit Diäthylaminoäthanol-Einheiten modifizierte Zellulose) chromatographiert, wobei die Elution mit steigender Konzentration an Phosphatpuffer, pH 7,5, erfolgt. Die FDH-haltigen
r, Fraktionen werden vereinigt und erneut auf 3,2 M Ammonsulfat bei Aufrechterhaltung des pH-Wertes gebracht. Der Niederschlag wird abgetrennt, in Phosphatpuffer, pH 7,5, gelöst und nach Dialyse mit Hydroxylapatit behandelt. Nach Abtrennung des Hy-
_>i) droxylapatits wird die Lösung lyophilisiert.
Ausbeute: 0,7 g Lyophilisat mit einer spezifischen Aktivität von ca. 3,5 U/mg Protein. Die Gesamtausbeute 2> beträgt etwa43%.
B. Formiatbestimmung
0,02 ml einer 0,100 Mol/l wäßrigen NA D-Lösung, 0,02 ml von 2,5 mMol/1 Natriumformiatlösung, 0,8 ml 0,05 Mol/l Phospahtpuffer, pH 7,5, werden gemischt und mit Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt
In einer Vergleichsprobe wird die Formiatlösung durch eine gleiche Menge Wasser ersetzt. Für beide Proben wird dann die Anfangsextinktion bei 366 nm r> gemessen. Anschließend wird die Reaktion durch Zusatz von 0,2 U FDH gestartet Nach 30 Minuten wird die Endextinktion abgelesen.
Das Ergebnis wurde mit dem Literaturwert für NADH=3,4 αη2/μπιο1 berechnet Bei 6 Parallelversuchen ergaben sich 0,0498 μιηοΐ = 99,5% des eingesetzten Wertes bei einem Variationskoeffizienten von 1,28%. Das Resultat ist daher statistisch nicht von dem theoretisch zu erwartenden Wert zu unterscheiden.
Eine Vergleichsbestimmung gemäß Beispiel 4 der DT-OS 20 13 700 mit dem dort beschriebenen Enzym ergab bei einem Einsatz von 0,05μπκ>1 Formiat eine Wiederfindung von 0,0468 μηκ>1=93,6% des Sollwertes. Einzige Abweichung von diesem Beispiel war, daß analog dem vorstehenden Beispiel die NAD-Lösung -,ο 0,100 Mol/l enthielt Das war deswegen erforderlich, da — offenbar durch einen Schreibfehler in der genannten DT-OS — die dort angegebene Menge NAD nicht zur stöchiometrischen Umsetzung des vorgelegten Formiats ausgereicht hätte.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung oder Beseitigung von Formiat oder von in Formiat überführbaren Verbindungen, wie Oxalat, durch Umsetzung in Gegenwart von Formiatdehydrogenase und eines Wasserstoffakzeptors, dadurch gekennzeichnet, daß Formiatdehydrogenase aus Candida boidinü DSM 941 verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Formiatdehydrogenase aus Candida boidinü DSM 941 verwendet wird, der auf Methanol als Kohlenstoffquelle gezüchtet wurde.
3. Reagens zur Bestimmung von Formiat oder von in Formiat überführbaren Verbindungen, enthaltend Formiatdehydrogenase, einen Wasserstoffakzeptor und Puffer, dadurch gekennzeichnet, daß es Formiatdehydrogenase aus Candida boidinü DSM 941 enthalt
4. Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,1 bis 10 mMol an NAD, 5 bis 100 mMol an Phosphatpuffer ist und 0,05 bis 5 U/ml Formiatdehydrogenase aus Candida boidinü DSM 941 enthält, jeweils bezogen auf die wäßrige Lösung des Reagens.
Wasserstoffakzeptors entsprechend nachstehender Gleichung, die als Wasserstoffakzeptor NAD aufführt:
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