JPS584917B2 - 蟻酸塩もしくは蟻酸塩に変換しうる化合物を測定する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、蟻酸塩もしくは蓚酸塩のような蟻酸塩に変換
しうる化合物を、蟻酸デヒドロゲナーゼ及び水素受容体
の存在下での反応によって測定する方法に関する。

ニコチンアミドーアデニンージヌクレオチド（ＮＡＤ）
のような水素受容体の存在下でプソイドモナス オキザ
ラチクス（Ｐｓ．ｅ ｕ ｄｏｍｏｎａｓｏｘａｌａｔ
ｉｃｕｓ）からの蟻酸デヒドロゲナーゼを用いる蟻酸塩
の測定は、例えばベルグマイヤー（Ｈ．Ｕ． Ｂｅｒｇ
ｍｅｙｅｒ）”メトーデン・デル・エンツイーマテイツ
シエン・アナリーゼ（Ｍｅ ｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒｅｎ
ｚｙｍａ ｔ ｉ ｓｃｈｅｎ Ａｎ ａ１ ｙｓｅ
）”、第３版、１９７４年、第１５９７頁〜第１６００
頁（Ｃｈｅｍｉｅ出版社、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）から公知
である。

しかし該酵素は、蟻酸塩消費に応じる化学量論的なＮＡ
ＤＨ形成が起きないという欠点を有し、これはＮＡＤＨ
を再び酸化する。

蟻酸デヒドロゲナーゼの２つの二次的活性に帰すること
ができる。

前記した文献に、このＮＡＤＨ一ないしは蟻酸オキシダ
ーゼ作用はＦＤＨの不純化ではなくて、ＦＤＨの真正の
二次的活性であることが明瞭に指摘されている。

その結果、得られる値は常に理論値よりも低い。

この場合に、比例定数はそれぞれの酵素製剤につき、新
たに蟻酸塩標準溶液に対し補正することによって定数を
決定しなければならない。

カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）Ｎ−１ ６−抽出物（”Ａ
ｇｒＢｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．”、第３６巻、第２２９７
頁、１９７２年）の場合でも、蟻酸塩及びＮＡＤととも
に培養する際に副反応によって化学量論的量は得られな
いことが判明した。

従って本発明の目的は、この欠点を除去することである
。

意外なことに、カンジダ・ボイジニイ（Ｃａｎｄ−ｉｄ
ａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）微工研菌寄第４５２２号からの
ＦＤＨは公知のＦＤＨ製剤の欠点を有せず、蟻酸塩を、
水素受容体としてＮＡＤを記載する次の方程式：により
、水素受容体の化学量論的還元下に定量的にＣＯ２に酸
化することが判明した。

従って、蟻酸塩もしくは蓚酸塩のような蟻酸塩に変換し
うる化合物を、ＦＤＨ及び水素受容体の存在下での反応
によって測定するための本発明方法は、カンジダ・ボイ
ジニイ微工研菌寄第４５２２号からのＦＤＨを使用する
ことを特徴とする。

本発明方法は、その蟻酸塩の定量的反応によって蟻酸塩
を測定するのに好適である。

同様に、本発明方法は、例えば蓚酸塩のような蟻酸塩に
変換しうる化合物を測定するために使用することもでき
る。

蓚酸塩は、例えば公知方法で蓚酸デカルボキシラーゼを
用い次の方程式によって蟻酸塩に変換することもできる
： 本発明方法によって測定することができる、蟻酸塩に変
換しうる他の化合物は、例えばホルミル−ＣｏＡ，ホル
ミルー燐酸エステル、ホルミルーテトラヒド口葉酸誘導
体、ならびに例えば酢酸鉛（ｒｖ）での酸化分解による
特定のポリオールである。

種々のカンジダ・ボイジニイ菌株からのＦＤＨは公知で
ある。

該酵素のどれにも従来、本発明により使用される酵素に
おいて存在する、水素受容体の定量酸化を見い出すこと
はできなかった。

それどころか、種々のカンジダ・ボイジニイから得られ
る酵素は、プソイドモナス・オキザラチクス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｏｘｌａｔｉｃｓ）から得られる酵素
に極めて類似であることが認められている（″Ａｒｃｈ
．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉ−”、第９０巻、第２６３頁、１
９７３年）。

本発明方法において使用される酵素は、ＦＤＨを得るの
に自体公知の方法によって微生物から得ることができる
。

しかし、メタノールで培養した微生物を使用し、アント
リーゼ（Ａｎｔｏｌｙｓｅ）により分解し、次にポリエ
チレンイミンで処理する方法がすぐれている。

ボリエチレンイミン沈殿物上澄液中に求める酵素が存在
し、燐酸塩ゲルに吸着させ、これから再び燐酸塩緩衝液
で抽出することができる。

こうして得られた画分は、すでにその比活性度１．３〜
１．４Ｕ／■のために蟻酸塩測定に好適である。

しかし、有利には、硫酸アンモニウム分別及び弱塩基性
イオン交換体によるクロマトグラフイーによって後精製
が行なわれる。

最後に、純精製は、ＦＤＨを結合することなしになお存
在する不純物を吸着するヒドロキシル燐灰石での処理に
よって行なうことができる。

該反応は、酵素が活性であるｐＨ価すなわち約５．５〜
１０の間のｐＨ値で実施することができる。

ｐＨ６．５〜９．５がすぐれている。

緩衝液としては、特に燐酸塩緩衝液が好適である。

しかし、記載した範囲内で有効である他の緩衝液を使用
することもできる。

この種の緩衝液は当業者に公知である。カンジダ・ボイ
ジニイ微工研菌寄第４５２２号の培養は、普通の培養法
及びメタノールを含有する培地の使用下に行なうことが
できる。

メタノールは順応的に微生物中に高いＦＤＨを含量する
ために培地に添加される。

特に適当な生長培地は、１アルキーフ・ミクロビオロギ
ー（Ａｒｃｈ． Ｍｉｃ一ｒｏｂｉｏ１．）”、第８４
巻、第２９頁〜第４２頁、１９７２年に記載されており
、大体において酵母エキス、麦芽エキス、グルコースな
らびにメタノールからなる。

他の適当な培地は、メタノール及び酵母エキスの他に、
単になおカリウム、アンモニウム、マグネシウム、Ｃｌ
−，ＰＯ４一及びＳＯ４−イオンならびに痕跡元素を含
有する。

さらに、本発明により、蟻酸塩もしくは蟻酸塩に変換し
うる化合物を測定するための、蟻酸デヒドロゲナーゼ、
水素受容体及び緩衝液を含有する試薬は、カンジダ・ボ
イジニイ微工研菌寄４５２２号からの蟻酸デヒドロゲナ
ーゼを含有する。

水素受容体として、本発明で使用される試薬は、特にＮ
ＡＤを含有する。

特にすぐれた組成の試薬は、主としてそれぞれ試薬の水
溶液に対してＮＡＤ０．１〜１０ミリモル／ｌ，燐酸塩
緩衝液１０〜２５０ミリモル／ｌ及びカンジダ・ボイジ
ニイ微工研菌寄第４５２２号からの蟻酸デヒドロゲナー
ゼ０．０５〜５Ｕ／ｍｌからなる。

次に、本発明において使用される蟻酸デヒドロゲナーゼ
の理化学的性質を示す： 活性度： 燐酸塩緩衝液８０ミリモル／ｌ中でｐＨ ７． ６及び
２５℃で測定されたタンパク質２〜４Ｕ／ｍｐ。

ＩＵ＝基質変換量１マイクロモル／ｍｉｎ． 基質の詳細： 蟻酸塩は唯一の公知の基質である。

ＫＭ＝１．１・１０−２モル／ｌ（ｐＨ７．６及び２５
°Ｃ）。

酢酸塩、蓚酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩及びコハク酸塩に
よる変換は測定されなかった。

補酵素の場合、変換はＮＡＤのみにより起こるにすぎな
い（ＫＭ＝９・１０−５モル／ｌ；前記と同じ条件下で
測定）。

ＮＡＤＰによる変換は起こらない。

反応式は明細書中に既述されている。

最適ｐＨ価： ｐＨ７．５〜ｐＨ９、０の間で実際に同じ最大の活性度
を測定することができる（燐酸塩緩衝液８０ミリモル／
ｌ中、２５°Ｃ）。

安定ｐＨ範囲： ｐＨ ５． ０〜ｐＨ ９． ０の間で燐酸塩緩衝液（
８０ミリモル／Ａ；２５゜Ｃ）中１時間で活性度減少は
測定されない。

活性度測定法： ｌ．燐酸塩緩衝液（１００ミリモル／ｌ，ｐＨ７．６〕
２．ＮＡＤ溶液（５６．７ミリモル／ｌ）：結晶ＮＡＤ
−Ｌｉ・２Ｈ２０（例えば、＋ＢＯＥＨＲＩＮＧＢＲＭ
ＡＮＮＨＥＩＭＧｍｂＨ社、製品−Ｎｏ．２２３４６８
〕４０ｍ９を再蒸留水１ｄに溶かす。

３、 蟻酸塩溶液（１モル／ｌ）二蟻酸ナトリウム（ｐ
．ａ．）６８０ｍｇを再蒸留水１０ｍｌに溶かす。

４．試料溶液： 蟻酸塩デヒドロゲナーゼを公知のタンパク質濃度で再蒸
留水又は燐酸塩緩衝液（１）中に溶かす。

試験の直前に溶液を調製する。

波長：λ＝ ３ ６ ６ ｎｍ，試験量：３．Ｏｍｌ，
測定温度：２５°Ｃ 活性度の温度範囲： 温度の上昇に伴ない５５まで急激な活性度上昇（燐酸塩
緩衝液、ｐＨ７．５、０．０８モル／ｌ。

ｐＨ／温度に関する不活化条件： 燐酸塩緩衝液（ｐＨ７． ５ ， ０．０ ８モル／ｌ
）中で、５５℃よりも高い温度で活性度の低下か測定さ
れる。

１５分間及び６０゜Ｃで、残留活性度は５０％未満であ
る。

同じ測定法でｐＨ７．０で測定した場合は、残留活性度
は４０％未満である。

阻害率： アジド（ １ ０＝モル／ｌ）： 阻害率 ９９％ 亜硝酸塩（ １ ０−”モル／ｌ）： 阻害率 ５５％ 硝酸塩（ １ ０−２モル／ｌ） 阻害率 ２５％ ロダン化物（１０−３モル／ｌ） 阻害率 ５０％ 賦活体： 確認できなかった。

安定化： クエン酸三ナトリウム又は牛血清アルブミン（使用酵素
タンパク質に対してそれぞれ１０倍量）の存在下で、凍
結乾燥することによって明らかに安定性上昇が観察され
る。

分子量： アクリルアミドーＳＤＳ−ゲル７．５％での電気泳動法
で、３５０００±３０００の分子量／副単位が得られた
。

全分子は二量体であり、したがってその分子量は７００
００±６０００である。

結晶形： 酵素は結晶していない。

電気泳動移動度： 標識臭素一フェノールブルーに対して０．５７（ ＳＤ
Ｓ一添加剤なしのアクリルアミドーゲル７．５％中）。

その上、本発明で使用される試薬は、なお酵素又は／及
びＮＡＤ用の安定剤、金属イオン封鎖剤及び場合によっ
ては界面活性剤に対する安定剤を含有することができる
。

本発明により、従来公知の蟻酸塩測定方法の欠点、なか
んづく水素受容体との反応か定量的に行なわれなかった
という欠点が除去される。

従って本発明は、これまで必要であった測定結果の評価
のための補正項の決定を省略することができ、従って殊
に自動分析機における適用にも好適である。

本発明を次の実施例で詳説する。

実施例 Ａ，酵素の収得 メタノールで培養した、低温凍結状態のカンジダ・ボイ
ジニイＤＳＭ９４１ ４００ｇを５０ミリモルの硫酸
アンモニウム溶液１２００ｍｌ中で融解し、約１時間３
７℃に保持する。

次に、該懸濁液に１０％のポリエチレンイミン溶液（ｐ
Ｈ７．５）を混和する。

沈殿物を遠心分離し、上澄液に９容量％の燐酸塩ゲル（
ｐＨ７．５）を混和し、３０分後に遠心分離する。

０．５モルのＮａＣｌ溶液で洗浄した後に、該ゲルを０
．２モルの燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で抽出する。

該抽出物を、ｐＨ価７．５の維持下に、３，２モルの硫
酸アンモニウムに加える。

形成した沈殿物を分離し、燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）
に溶かした後に、ＤＥＡＥセルロース（ジエチルアミノ
エタノール単位で変性されたセルロース）によってクロ
マトグラフイーを行ない、この際に溶離は上昇濃度の燐
酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて行なう。

ＦＤＨ含有画分を合し、改めてｐＨ価の保持下に３２モ
ルの硫酸アンモニウムに加える。

沈殿物を分離し、燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．５’）に溶か
し、透析後にヒドロキシル燐灰石で処理する。

ヒドロキシル燐灰石の分離後に、該溶液を凍結乾燥する
。

Ａ．収量： タンパク質１ｍｇあたり比活性度約３．５Ｕを有する凍
結乾燥物０．７ｇ、全収率は約４３％である。

Ｂ．蟻酸塩測定 ０．１００モル／ｌのＮＡＤ水溶液の０．０２ｍｌ、２
．５ミリモル／ｌの蟻酸ナトリウム溶液０．０２ｍｌ、
０，０５モル／ｇの燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）０．８
ｍｌを混合し、水でｌ．０ｍｌにする。

比較試料においては、蟻酸塩溶液を等量の水で代替する
。

次に、２つの試料の初期吸光を３６６ｎｍで測定する。

引続き、ＦＤＨ０．２Ｕの添加によって反応を開始する
。

３０分後に最終吸光を読み取る。

結果を、ＮＡＤＨの文献値−３． ４ ｃｍ／μモルと
差引計算する。

並行して実施した６つの実験では、ＮＡＤＨ０．０４９
８μモルが生じ、これは変動係数１．２８％で使用した
値の９９．５％である。

従って、結果は統計的には理論的に期待される値と区別
できない。

西ドイツ国特許公開公報第２０１３７００号の実怖例４
に記載された酵素を用いる比較測定で、蟻酸塩の使用量
０．０５μモルの場合に０．０４６８μモルが再び見出
され、こわは目標値の９３６％である。

この実施例からの唯一の相違は、前記した実箔例と同様
にＮＡＤ溶液０．１０モル／ｌを含有することであった
。

これは、前述した西ドイツ国特許公開公報の誤記によっ
て明らかなように、該明細書に記載されたＮＡＤ量は装
入した蟻酸塩を化学量論的に反応させるためには十分で
ないために必要であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 蟻酸塩もしくは蓚酸塩のような蟻酸塩に変換しうる
   化合物を蟻酸デヒドロゲナーゼ及び水素受容体の存在下
   での反応によって測定する方法において、カンジダ・ボ
   イジニイ微工研菌寄第４５２２号からの蟻酸ヂヒドロゲ
   ナーゼを使用することを特徴とする、蟻酸塩もしくは蟻
   酸塩に変換しうる化合物を測定する方法。 ２ 水素受容体としてニコチンアミドーアデノシンージ
   ヌクレオチド（ＮＡＤ）を使用し、形成した還元ジヌク
   レオチドを光学的に測定する、特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３ 炭素源としてのメタノールで培養したカンジダ・ボ
   イジニイ微工研菌寄第４５２２号からの蟻酸デヒドロゲ
   ナーゼを使用する、特許請求の範囲第１項又は第２項に
   記載の方法。 ４ 反応をｐＨ価６．５〜９．５で実施する、特許請求
   の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の方法。