SE429558B - Forfarande for bestemning eller avlegsnande av formiat overforbara foreningar sasom oxalat jemte reagens herfor - Google Patents

Description

. ...a a. -..w ... 2G 7801695-s 2 genom bireaktioner icke erhålles någon stökiometri.

Ti11 grund för föreliggande uppfinning ligger därför uppgiften att eliminera denna nackdel. ¿ Överraskande nog har det nu visat sig, att FDH ur Candida boidinii DSM 941 icke uppvisar de kända FDH-preparatens nackdel och kvantitatívt oxiderar formiat till C02 under stökiometrisk re- duktion av väteacceptorn enligt efterföljande reaktionsföljd, som sker med NAD som väteacceptor: 1.) HC00- + NAD+ + H20 formiatdehvdro enas> HCO3- + NADH + H+ Förfarandet enligt föreliggande uppfinning för bestämning eller avlägsnande av formiat eller till formiat överförbara föreningar, såsom oxalat, genom omsättning i närvaro av FDH och en väteaccep- tor kännetecknas sålunda därav, att FDH ur Candida boidinii DSM 941 användes.

Förfarandet enligt uppfinningen lämpar sig på grund av sin kvan- titativa omsättning av formiat icke endast för bestämning av formia- tet, utan även för avlägsnande av formiat ur detta innehållande lös- ningar, exempelvis vid analytiska eller preparativa arbeten, vid vilka formiat verkar störande. 7 Förfarandet enligt uppfinningen kan ävenså användas för bestäm- ning av till formiat överförbara föreningar, såsom oxalat. Oxalat låter sig exempelvis på känt sätt med oxalatdekarboxylas överföras till formiat enligt efterföljande reaktionsföljd: z.) H20 + C204" gLlatdekarlwx las) Hcos' + Hcoo' Andra till formiat överförbara föreningar, vilka kan bestämmas enligt uppfinningen, är t ex formyl-COA, formylfosfat, formyl-tetra- _ hydrofolsyra-derivat ävensom vissa polyoler efter oxidativ spaltning, It ex med blytetraacetat- FDH ur olika Candida boidinii-stammar är kända. För intet av dessa enzym kunde hittills påvisas den vid enzymet enligt uppfin- ningen föreliggande kvantitativa oxidationen av väteacceptorn. De ur de olika Candida boidinii utvunna enzymen befunnos i stället vara mycket lika det ur Pseudomonas oxalaticus utvunna enzymet. (Arch.

Microbiol. gg, 263 (1973)). _ Det vid förfarandet enligt uppfinningen använda enzymet kan ut- vinnas ur mikroorganísmen enligt i och för sig för utvinningen av FDH kända metoder. i Att föredraga är dock ett förfarande, vid vilket en på metanol 30f 40 3 7so169s-s odlad mikroorganism insättes, genom autolys uppslutes och därpå be- handlas med polyetylenímin. I vätskeåterstoden från polyetylenimín- fällningen àterfinnes det önskade enzymet, som kan adsorberas till fosfatgel och därur åter extraheras med fosfatbuffert. Den så er- hållna fraktionen lämpar sig redan på grund av sin specifika akti- vitet pà 1,3-1,4 U/mg för formiatbestämningen. Lämpligen sker dock en ytterligare rening medelst ammoniumsulfatfraktionering och kro- matografi över en svagt basisk jonbytare. En finrening kan slutli- gen utföras genom behandling med hydroxylapatit, som absorberar än- nu förefintliga föroreningar, utan att binda FDH.

Reaktionen kan genomföras vid pH-värden, vid vilka enzymet är aktivt, dvs mellan ca 5,5 och 10. Företrädesvis användes pH 6,5-9,5.

Som buffert lämpar sig isynnerhet fosfoatbuffert. Men även andra buf- fertar, som är verksamma i det angivna området, kan användas. Sådana buffertar är kända för fackmannen.

Odlingen av Candida boidinii DSM 941 kan ske under användning av sedvanliga odlingsmetoder och medier med en halt av metanol. Me- tanol tillsättes mediet för att adaptivt åstadkomma en högre halt av FDH hos mikroorganismerna. Ett speciellt lämpligt tillväxtmedium har beskrivits i Arch. Microbiol. åí, 29-42 (1972); det består väsentli- gen av jästextrakt, maltextrakt, glukos ävensom av metanol.

Ett annat lämpligt medium innehåller utom metanol och jästextrakt dessutom kalium, ammoníum, magnesium, Cl-, P04- och S04-joner ävensom spårelement.

Ett ytterligare föremål för uppfinningen är ett reagens för be- stämning av formiat eller av till formiat överförbara föreningar, vilket innehåller formiatdehydrogenas, en väteacceptor och buffert e och kännetecknas därav, att det innehåller formiatdehydrogenas ur Candida boidinii DSM 941. _ _ Som väteacceptor innehåller reagenset enligt uppfinningen före- trädesvis NAD. I en speciellt föredragen sammansättning består rea- genset väsentligen av 0,1-10 mmol/l NAD, 10-250 mmol/1 fosfatbuffert och 0,05-5 U/ml formiatdehydrogenas ur Candida boidinii 941, varje gång räknat på den vattenhaltiga lösningen av reagenset. I Reagenset enligt uppfinningen kan därjämte dessutom innehålla stabilisatorer för enzymet eller/och för NAD, sekvestreïíflgfimedel °Ch eventuellt ett ytaktivt medel.

Genom uppfinningen elimineras nackdelarna hos de hittills kända förfarandena för bestämning av formiat, vilka nackdelar framför allt låg däri, att omsättningen med väteacceptorn icke skedde kvantita- D 30 40 7801693-8 4 tivt. Uppfinningen möjliggör sålunda, att den hittills nödvändiga bestämningen av- korrigerande element för uttolkningen av mätresul- taten bortfaller och lämpar sig därför jämväl isynnerhet för använd- ning i analysautomater. D ' Följande exempel åskådliggör närmare uppfinningen.

Exempel.

A- 9§rinaias-ar_§azza§t D _ - _400 g på metanol odlad Candida boidinii DSM 941 i djupfryst tillstånd försättes med 1200 ml 50 mM ammoniumsulfatlösning och får stå ca 1 h vid 57°C. Därpå försättes suspensionen med en 10-procen- tig polyetyleniminlösning, pH 7,5. Fällníngen avcentrifugeras, väts- škeåterstoden försättes med 9 volymprocent fosfatgel, pH 7,5, och centrifugeras efter 30 min. Efter tvättning med 0,5 M NaCl-lösning extraheras gelen med 0,2 M fosfatbuffert, pH 7,5. Bxtrakten försät- tes med 3,2 M ammoniumsulfat under upprätthållande av ett pH av 7,5.

Den bildade fällníngen separeras och efter upplösning i fosfatbuf- fert, pH 7,5, kromatograferas över "DEAE"-cellulosa (med dietylamíno- etanol-enheter modifierad celluosa), varvid elueríng sker med stigan- de koncentration av fosfatbuffert, pH 7,5. De FDH-haltiga fraktioner- na förenas och behandlas på nytt med 3,2 M ammoniumsulfat under upp- rätthållande av pH 7,5. Fällningen separeras, löses i fosfatbuffert, pH 7,5 och behandlas efter dialys med hydroxylapatit. Efter separe- ring av hydroxylapaptiten lyofiliseras lösningen. I Utbyte: 0,7 g lyofilisat med en specifik aktivitet av ca 3,5 U/mg protein. Totalutbytet utgör ca 43 %.-' B- Esániaëäeëtäaaiaa 0,02 ml av en 0,100 mol/l vattenhaltig NAD-lösning, 0,02 ml 2,5 ' mmol/1 natriumformiatlösning, 0,8 ml 0,05 mol/1 fosfatbuffert, pH 7,5, blandas och uppfylles med vatten till 1,0 ml. _I ett jämförelseprov ersättes.formiatlösningen med samma mängd vatten. För båda proven uppmätes därpå en begynnelseextinktion vid 366 nm. Därpå startas reaktionen genom tillsats av 0,2 U FDH. Efter .min avläses slutextinktionen. . _ Resultatet beräknades med lítteraturvärdet för NADH = 3,4 cmz/ ymol. Vid 6 parallellförsök erhölls 0,0498 pmol = 99,5 % av det in- satta värdet vid en variationskoefficient på 1,28 %. Resultatet är därför icke statistiskt avvikande från det teoretiskt förväntade värdet. 7 'En jämförelsebestämning enligt exempel 4 i DT-OS 20 13 700 med det däri beskrivna enzymet gav vid en insättning av 0,05 pmol for- 7801693-8 s míat ett återfinnande av 0,0468 ymol = 95,6 % av det beräknade vär- det. Den enda avvikelsen från detta exempel var, att analogt med øvanstående exempel NAD-lösningen innehöll 0,100 mol/1. Det var er- forderligt enär - uppenbarligen på grund av ett skrívfel í ovan an- förda DT-OS - den däri angivna mängden NAD icke skulle har varit tillräcklig för en stökiometrisk omsättning av det insatta formia- tet.

Claims (6)

6 Patentkrav

1. Förfarande för bestämning eller avlägsnande av formiat eller av till formiat överförbara föreningar, såsom oxalat, genom omsätt- ning i närvaro av formiatdehydrogenas och en väteacceptor, k ä n n e t e c k n a t därav, att formiatdehydrogenas ur Candida boidinii DSM 941 användes.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att som väteacceptor användes nikotinamid-adenosin-dinukleotid (NAD) och att bildad reduceraddinukleotidmätes optiskt.

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att formiatdehydrogenas ur Candida boidinii DSM 941 användes, som odlats på metanol som kolkälla. '

4. Förfarande enligt ett av föregående krav, k ä n n e t e c k - n a t därav, att omsättningen genomföres vid ett pH mellan 6,5 och 9,5.

5. Reagens för bestämning av formiat eller av till formiat över- förbara föreningar, såsom oxalat, för genomföring av förfarandet enligt krav 1, vilket reagens består av formiatdehydrogenas, en väteacceptor, buffert, eventuellt substanser, som omsätter till formiat överförbara föreningar, såsom oxalatdekarboxylas, och sed- vanliga tillsatsämnen, k ä n n e t e c k n a t därav, att det innehåller formiatdehydrøgenas ur Candida boidinii DSM 941.

6. Reagens enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att det är 0,1-10 mmol med avseende på NAD, 5-100 mmol med avseende på fosfatbuffert och innehåller 0,05-5 U/ml formiatdehydrogenas ur Candida boidinii DSM 941, varje gång räknat på den vattenhaltiga lös- ningen av reagenset.