DE2652679C2

DE2652679C2 -

Info

Publication number: DE2652679C2
Application number: DE2652679A
Authority: DE
Inventors: Burton Grant Metuchen N.J. Us Christensen; William Joseph Berkeley Heights N.J. Us Leanza; Kenneth James Somerville N.J. Us Wildonger
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1975-11-21
Filing date: 1976-11-19
Publication date: 1990-03-01
Also published as: PT65865A; NO153298C; AU512383B2; ES453501A1; DK157401B; ATA863476A; EG12261A; PT65865B; HK29683A; CH633800A5; NL189297B; GR62072B; CH632510A5; FI62306C; CA1083577A; PL110937B1; IL50911A0; FI62306B; DE2652679A1; NO763958L

Description

Die Erfindung betrifft substituierte N-Methylenderivate des Thienamycins. Solche Verbindungen und deren pharmazeu tisch annehmbare, für β-Lactamantibiotika übliche Salz- und Esterderivate der Carboxylgruppe sind als Antibiotika geeignet. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstel lung solcher Verbindungen sowie pharmazeutische Zusammen setzungen, welche diese Verbindungen enthalten.

Thienamycin wird beschrieben und beansprucht in der US-PS 39 50 357 (= DE-OS 25 52 638). Diese Patentschrift wird hiermit in die Offenbarung einbezogen, weil Thienamycin als Ausgangsverbindung bei der Herstellung der erfindungs gemäßen Verbindungen verwendet werden kann.

Thienamycin hat die folgende Strukturformel:

Im Gegensatz zu Thienamycin und den erfindungsgemäßen Thienamycin-Derivaten besitzt das bicyclische Grundgerüst der Antibiotika der US-PS 32 82 926 (Penam-Derivate) und der DE-OS 21 29 675 (Cephalosporin-Derivate) neben dem Stickstoffatom auch noch ein Schwefelatom.

Die substituierten N-Methylenthienamycin-Derivate gemäß der Erfindung können durch die folgende Strukturformel gekennzeichnet werden:

die auch, abhängig von der Basizität des Aminostickstoffs (eine Funktion der Identität der Methylensubstituenten NR₁R₂ und R) als inneres Salz äquivalent dargestellt werden kann:

welches eine anerkannte Form einer einfachen Resonanzstruktur

ist.

Der Einfachheit halber können die erfindungsgemäßen Ver bindungen durch das Symbol

wiedergegeben werden, worin "Th" den bicyclischen Kern des Thienamycins darstellt und worin bedeuten:

(a) R Wasserstoff oder C_1-3-Alkyl und
R¹ und R² Wasserstoff, C_1-4-Alkyl oder Benzyl, oder
(b) R Wasserstoff oder Methyl,
R¹ Phenyl und
R² Wasserstoff oder Methyl, oder
(c) R Amino,
R¹ Wasserstoff oder C_1-3-Alkyl und
R² Wasserstoff.

Umfaßt sind auch die pharmazeutisch annehmbaren, für β-Lactamantibiotika üblichen Salz- und Esterderivate der Carboxylgruppe dieser Verbindungen, die durch die folgende Strukturformel wiedergegeben werden:

und die auch in der, durch die folgende Strukturformel wiedergegebenen Salzform vorliegen können:

die einfacher in der vorher angegebenen symbolischen Art wiedergegeben werden kann:

in welcher das nicht-kritische Gegenanion A jeweils so ausgewählt ist, daß es ein pharmazeutisch annehmbares Salz bildet, beispielsweise ein Halogenid (Chlor oder Brom), Sulfat, Phosphat, Citrat, Acetat oder Benzoat und worin R^3′ ausgewählt ist aus den nachfolgend angegebenen Gruppen:
R^3′ ist Wasserstoff oder, unter anderem, so repräsentativ ausgewählt, daß es eine pharmazeutisch annehmbare Salz- oder Estergruppe bildet, wie sie bekannt ist bei den bi cyclischen β-Lactamantibiotika; solche Gruppen werden in größerer Anzahl unten aufgezählt.

Es besteht ein ständiger Bedarf an neuen Antibiotika. Denn unglücklicherweise gibt es keine statische Wirksam keit für ein gegebenes Antibiotikum, weil die fortwährende Anwendung im breiten Umfang eines solchen Antibiotikums selektiv die Bildung von resistenten Stämmen von Pathogenen erhöht. Darüber hinaus haben die bekannten Antibiotika den Nachteil, daß sie nur gegen gewisse Typen von Mikroorga nismen wirksam sind. Deshalb wird weiterhin nach neuen Antibiotika geforscht.

Unerwarteterweise wurde nun gefunden, daß die Verbindun gen der vorliegenden Erfindung Antibiotika mit breitem Spektrum sind, die sowohl für tierische und Humantherapie und in unbeseelten Systemen nützlich sind.

Es ist darum ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine neue Klasse von Antibiotika zur Verfügung zu stellen, welche die grundlegende Kernstruktur des Thienamycins (I) haben, die jedoch dadurch gekennzeichnet sind, daß sie substituierte N-Methylenderivate davon sind. Diese Anti biotika sind aktiv gegen einen breiten Bereich von Patho genen, für welche sowohl gram-positive Bakterien, wie S. aureus, Strep. pyogenes und B. subtilis, als auch gram negative Bakterien, wie E. coli, Proteus morganii, Klebsiella, Serratia und Pseudomonas, repräsentativ sind. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, chemische Verfahren zur Verfügung zu stellen zur Herstellung von solchen Antibiotika und deren pharmazeutisch annehmbaren, für β-Lactamantibiotika üblichen Salz- und Esterderivaten der Carboxylgruppe sowie auch von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die solche Antibiotika enthalten.

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung (Strukturen II und IIa) können in zwei Klassen eingeteilt werden:

1. Amidine der Formel

die auch durch die Resonanzstruktur:

wiedergegeben werden kann, worin bedeuten:

(a) R Wasserstoff oder C_1-3-Alkyl und
R¹ und R² Wasserstoff, C_1-4-Alkyl oder Benzyl, oder
(b) R Wasserstoff oder Methyl,
R¹ Phenyl und
R² Wasserstoff oder Methyl.

R kann Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl oder iso Propyl bedeuten und R¹ und R² können z. B. Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl, iso-Propyl, Butyl, tert.-Butyl oder Benzyl sein.

Typische Beispiele für solche Amidin-Ausführungsformen (der Substituent und die Aminogruppe des Thienamycins bilden die Amidinstruktur) sind Verbindungen, in denen R, R¹, R² und R^3′ die folgenden Bedeutungen haben:

2. Guanidine der Formel

worin bedeuten:
R¹ Wasserstoff oder C_1-3-Alkyl und
R² Wasserstoff.

R¹ kann beispielsweise Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder iso-Propyl bedeuten.

Typische Beispiele für solche Guanidin-Ausführungsformen (der Substituent und die Aminogruppe des Thienamycins bilden die Guanidin-Struktur) sind:

Guanidin: R¹ und R² = H;
N-Methylguanidin: R¹ = CH₃, R² = H.

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden in ein facher Weise hergestellt aus Thienamycin (I). Ausführungs formen der vorliegenden Erfindung, wie die vorher angegebene Formel IIa, worin die Carboxylgruppe derivatisiert ist, werden in einfacher Weise hergestellt aus dem entsprechenden Carboxylderivat des Thienamycins oder aus II oder Thienamycin, indem man den Rest R^3′ einführt.

Geeignete Ausgangsmaterialien hierfür sind:
N-Acylderivate des Thienamycins mit der folgenden Struktur formel:

worin R^1′ und R^2′ Wasserstoff oder Acyl, wie unten definiert, sind. Solche N-Acylthienamycine sind brauchbare Ausgangsver bindungen für die Herstellung substituierter Pseudoharnstoffe und Imidoether und Imidothioether, die als weitere Zwischen produkte dienen.

Carboxylderivate des Thienamycins mit der folgenden Struktur formel:

N-Acyl- und Carboxylderivate des Thienamycins mit der fol genden Strukturformel:

Es können somit die erfindungsgemäßen Verbindungen IIa hergestellt werden, indem man mit den entsprechenden Derivaten Ib, Ic oder Id anfängt oder indem man direkt mit Thienamycin I (I→II) anfängt und anschließend die Derivate IIa her stellt, indem man die Gruppe R^3′ (II→IIa) einführt.

Bezüglich der Strukturen IIa, Ib, Ic und Id können die Reste R^3′, R^1′ und R^2′ wie folgt definiert werden:

Identifizierung des Restes -COOR^3′

Bei der allgemeinen Beschreibung der erfindungsgemäßen Verbindungen (IIa) bedeutet der Rest, der durch die Gruppe -COOR^3′ bezeichnet wird, unter anderem -COOH (R^3′ ist Wasser stoff) und alle Reste, die bekannt sind als wirksame pharma zeutisch annehmbare Ester bei bicyclischen β-Lactamantibiotika, wie bei den Cephalosporinen und Penicillinen und deren im Kern Analogen.

Geeignete Reste (R^3′) schließen übliche Schutz- oder Carboxylblockierungsgruppen ein. Der Ausdruck "Blockierungs gruppe", wie er hier verwendet wird, wird in der gleichen Weise angewendet, wie sie gemäß US-PS 36 97 515, die hier mit bezüglich der Offenbarung eingeschlossen wird, verwen det wird. Pharmazeutisch annehmbare Thienamycinderivate der vorliegenden Erfindung, die unter diese Klasse fallen, werden nachfolgend angegeben. Geeignete Blockierungsester schließen somit solche ein, wie sie in der folgenden Aufzählung angegeben werden, die repräsentativ ist aber keineswegs eine erschöpfende Aufzählung der möglichen Estergruppen darstellt, bei denen R^3′ gegeben ist:

(i) R^3′ = CRaR^bR^c, worin wenigstens eines von Ra, R^b und R^c ein Elektronendonor ist, beispielsweise p-Methoxy phenyl, 2,4,6-Trimethylphenyl, 9-Anthryl, Methoxy, CH₂SCH₃, Tetrahydrofur-2-yl, Tetrahydropyran-2-yl oder Fur-2-yl. Die restlichen Ra, R^b und R^c-Gruppen können Wasserstoff oder organische Substitutionsgruppen sein. Geeignete Estergruppen dieser Art schließen ein p-Meth oxybenzyloxycarbonyl und 2,4,6-Trimethylbenzyloxycarbonyl.
(ii) R^3′ = CRaR^bR^c, worin wenigstens eine der Ra, R^b und R^c-Gruppen eine Elektronen anziehende Gruppe ist, beispielsweise Benzoyl, p-Nitrophenyl, 4-Pyridyl, Tri chlormethyl, Tribrommethyl, Jodomethyl, Cyanomethyl, Äthoxycarbonylmethyl, Arylsulphonylmethyl, 2-Dimethyl sulphoniummethyl, o-Nitrophenyl oder Cyano. Geeignete Ester dieser Art schließen ein Benzoylmethoxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, 4-Pyridylmethoxycarbonyl, 2,2,2-Trichloräthoxycarbonyl und 2,2,2-Tribromäthoxy carbonyl.
(iii) R^3′ = CRaR^bR^c, worin wenigstens zwei der Ra, R^b R^c-Reste Kohlenwasserstoffe sind, wie Alkyl, beispiels weise Methyl oder Äthyl oder Aryl, beispielsweise Phenyl und die restliche Ra, R^b R^c-Gruppe, falls vorhanden, Wasserstoff bedeutet. Geeignete Ester dieser Art schließen ein tert.-Butyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Diphenylmethoxycarbonyl und Triphenylmethoxycarbonyl.
(iv) R^3′ = R^d worin R^d Adamantyl, 2-Benzyloxyphenyl, 4-Methylthiophenyl oder Tetrahydropyran-2-yl ist.

Silylester dieser Kategorie von Blockierungsgruppen können in einfacher Weise hergestellt werden aus Halogensilanen oder Silazanen der Formel:
R⁴₃SiX′; R⁴₂SiX′₂; R⁴₃Si·NR⁴₂; R⁴₃Si·NH·COR⁴; R⁴₃Si·NH·CO·NH·SiR⁴₃; R⁴NH·CO·NH·SiR⁴₃; oder R⁴C(OSiR⁴₃); HN(SiR⁴₃)₂, worin X′ Halogen, Chlor oder Brom bedeutet und die verschiedenen Gruppen R⁴, die gleich oder verschie den sein können, Wasserstoffatome oder Alkyl bedeuten, bei spielsweise Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl; Aryl, bei spielsweise Phenyl; oder Aralkyl, beispielsweise eine Benzylgruppe.

Allgemeiner gesagt, sind pharmazeutische annehmbare Carb oxylderivate der vorliegenden Erfindung solche, die sich ableiten durch Umsetzen von Thienamycin oder einem N-ge schützten Thienamycin, wie einem N-acylierten Thienamycin, mit Alkoholen oder Phenolen. Beispielsweise sind interessante Ester die vorher aufgezählten Ausgangsverbindungen und Endprodukte, welche die folgende Gruppe in der 2-Stellung des Thienamycinkerns haben: -COOR^3′, worin R^3′ Alkyl bedeutet mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und zwar geradlinig oder verzweigt, wie Methyl, Ethyl, tert.-Butyl, Pentyl oder Decyl; Carbonylmethyl, einschließlich Phenylacyl, p-Brom phenacyl, p-tert.-Butylphenacyl, Acetoxyacetylmethyl, Pival oxyacetylmethyl, Pivaloylacetylmethyl, Carboxymethyl und dessen Alkyl- und Arylester, α-Carboxy-a-isopropyl; Amino alkyl einschließlich 2-Methylaminoethyl, 2-Diethylamino ethyl, Dimethylaminoethyl, 2-Acetamidoethyl, Phthalimido methyl, Bernsteinsäureimidomethyl; Alkoxyalkyl, worin der Alkoxyteil 1 bis 10 und vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoff atome hat und verzweigt, geradkettig oder cyclisch sein kann, und worin der Alkylteil 1 bis 6 Kohlenstoffatome hat, wie Methoxymethyl, Ethoxymethyl, Isopropoxymethyl, Decyloxymethyl, Ethoxypropyl, Decyloxypentyl oder Cyclo hexyloxymethyl; Alkanoyloxyalkyl, worin der Alkanoyloxy teil geradkettig oder verzweigt ist und 1 bis 6 Kohlenstoff atome hat und der Alkylteil 1 bis 6 Kohlenstoffatome hat, wie Acetoxymethyl, Pivaloyloxymethyl, Acetoxyethyl, Propionyl oxyethyl oder Acetoxypropyl; Halogenalkyl, worin Halogen Chlor, Brom, Fluor oder Jod ist und der Alkylteil gerad kettig oder verzweigt ist und 1 bis 6 Kohlenstoffatome hat, beispielsweise 2,2,2-Trichlorethyl, Trifluorethyl, 2-Brompropyl, Dÿodomethyl, 2-Chlorethyl oder 2-Bromethyl; Alkenyl mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, das entweder gerad kettig oder verzweigt ist, beispielsweise Allyl, 2-Propenyl, 2-Methyl-2-propenyl, 3-Butenyl, 4-Butenyl, 4-Pentenyl, 2-Butenyl, 3-Pentenyl, 3-Methyl-3-butenyl, Methallyl oder 1,4-Cyclohexadien-1-yl-methyl; Alkinyl mit 2 bis 10 Kohlen stoffatomen, das entweder geradkettig oder verzweigt sein kann, beispielsweise 3-Pentinyl, Propargyl, Ethinyl oder 3-Butin-1-yl; Alkanoyl, das entweder geradkettig oder ver zweigt sein kann, mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, wie Pivaloyl, Acetyl oder Propionyl; Aralkyl oder Hetero alkyl, worin das Alkyl 1 bis 3 Kohlenstoffatome hat, und Hetero bedeutet, daß 1 bis 4 Heteroatome vorhanden sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus O, S oder N, wie Benzyl, Benzhydryl und substituiertes Benzyl, Benzhydryl, beispiels weise Benzyl oder Benzhydryl, substituiert mit 1 bis 3 Substituenten, wie Benzyl, Phenoxy, Halogen, Niedrigalkyl, Niedrigalkanoyloxy mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Niedrig alkoxy, Hydroxy, Nitro, blockiertes Carboxy oder Kombi nationen davon, beispielsweise p-Chlorbenzyl, o-Nitrobenzyl, 3,5-Dinitrobenzyl, p-Methoxybenzyl, m-Benzoylbenzyl.

p-tert.-Butylbenzyl, m-Phenoxybenzyl, p-Benzoylbenzyl, p-Pivaloylbenzyl, p-Nitrobenzyl, 3,5-Dichlor-4-hydroxybenzyl, p-Methoxycarbonyl benzyl, p-Methoxybenzhydryl, p-Carboxybenzyl, wobei das letztere entweder als freie Säure, als Ester oder als Natriumsalz vorliegt, 2,4,6-Trimethylbenzyl, p-Pivaloyl oxybenzyl, p-tert.-Butoxycarbonylbenzyl, p-Methylbenzyl, p- Benzoyloxybenzyl, p-Acetoxybenzyl, p-2-Äthylhexanoylbenzyl, p-Äthoxycarbonylbenzyl, p-Benzoylthiobenzyl, p-Benzamido benzyl, o-Pivaloyloxybenzyl, m-Pivaloyloxybenzyl, p-Iso propoxybenzyl, p-tert.-Butoxybenzyl sowie auch die cyclischen Analoge davon, 2,2-Dimethyl-5-cumaranmethyl, 5-Indanylmethyl, p-Trimethylsilylbenzyl, 3,5-Bis-t-butoxy-4-hydroxybenzyl; 2-Thienylmethyl, 2-Furylmethyl, 3-tert.-Butyl-5-isothiazol methyl, 6-Pivaloyloxy-3-pyridazinyläthyl oder 5-Phenyl thio-1-tetrazolylmethyl (wobei der Ausdruck Niedrigalkyl oder Niedrigalkoxy in diesem Zusammenhang eine Kette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet); oder Phthali dyl; oder Phenyläthyl, 2-(p-Methylphenyl)-äthyl und die Arylthioalkylanaloge, Aryloxyalkyl, worin Aryl vorzugs weise ein Phenylring ist mit 0 bis 3 Substituenten, vor zugsweise 0 oder 1 Substituenten in der ortho- oder para- Stellung und das Alkyl 1 bis 6 Kohlenstoffatome hat, bei spielsweise (4-Methoxy)-phenoxymethyl, Phenoxymethyl, (4-Chlor)-phenoxymethyl, (4-Nitro)-phenoxymethyl, (4-Benzyloxy)-phenoxymethyl, (4-Methyl)-phenoxymethyl, (2-Methoxy)-phenoxymethyl, (1-Phenoxy)-äthyl, (4-Amino)- phenoxymethyl, (4-Methoxy)-phenylthiomethyl, (4-Chlor)- phenylthiomethyl, Phenylthioäthyl; Aryl, worin Aryl Phenyl, 5-Indanyl oder substituiertes Phenyl mit 0 bis 3 Substi tuenten, vorzugsweise 0 bis 1 Substituenten in der ortho- oder para-Stellung bedeutet, beispielsweise (4-Methyl)- phenyl, (4-Hydroxy)-phenyl, (4-tert.-Butyl)-phenyl, p-Nitro phenyl, 3,5-Dinitrophenyl oder p-Carboxyphenyl, wobei das letztere entweder als freie Säure oder als Natriumsalz vor liegt; Aralkenyl, worin Aryl Phenyl oder Alkenyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, wie 3-Phenyl-2-propenyl; Aralkoxyalkyl, worin Aralkoxy Benzyloxy ist und das Alkyl 1 bis 3 Kohlenstoffatome hat, wie Benzyloxymethyl, (4-Nitro)- benzyloxymethyl, (4-Chlor)-benzyloxymethyl; Alkylthioalkyl, worin der Alkylthioteil 1 bis 10 und vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatome hat, das aber verzweigt, geradkettig oder cyclisch sein kann und der Alkylteil 1 bis 6 Kohlenstoff atome hat, wie Methylthiomethyl, Methylthioethyl, Ethylthio ethyl, Cyclohexylthiomethyl, Decylthiobutyl, Methylthio propyl, Isopropylthioethyl oder Methylthiobutyl oder Acetyl thioethyl.

Bevorzugte Blockierungsgruppen R^3′ sind wie vorher definiert: Aralkyl, Halogenalkyl, Alkanoyloxyalkyl, Alkoxyalkyl, Alkenyl, substituiertes Alkyl oder Aralkoxyalkyl und auch Alkylsilyl, worin die Alkylgruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome hat.

Weiter bevorzugt als R^3′ sind Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoff atomen; Phenacyl und kernsubstituiertes Phenacyl, worin der Substituent Chlor, Brom, Fluor oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist; Alkoxyalkyl, worin die Alkoxy gruppe offenkettig oder cyclisch ist und 1 bis 6 Kohlen stoffatome enthält und die Alkylgruppe 1 bis 6 Kohlen stoffatome enthält; Alkanoyloxyalkyl mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen; Halogen- und Perhalogenalkyl, worin das Halogen Chlor, Brom oder Fluor ist und die Alkyl kette 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält; Alkenyl mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen; Alkoxycarbonylalkyl mit 3 bis 14 Kohlenstoffatomen; Dialkylaminoacetoxyalkyl mit 4 bis 21 Kohlenstoffatomen; Alkanoylamidoalkyl mit 2 bis 13 Kohlenstoffatomen; Aralkyl, worin die Alkyl gruppe 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthält und die Aryl gruppe 6 bis 10 Kohlenstoffatome enthält; mono- und bi cyclisches Heteroalkyl mit 4 bis 10 Ringatomen und 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in der Alkylgruppe, worin das Heteroatom oder die Heteroatome ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Sauerstoff, Schwefel oder Stick stoff; kernsubstituiertes Aralkyl und Heteroaralkyl, worin der Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Chlor, Fluor, Brom, Jod und Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; Niedrigalkanoyloxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und Niedrigalkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; mono- und bicyclisches Hetero cyclylalkyl, worin das Heterocyclyl 4 bis 10 Atome ent hält und das Heteroatom oder die Heteroatome ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff und die Alkylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoff atome enthält; Aryl und kernsubstituiertes Aryl mit 6 bis 10 Ringkohlenstoffatomen und worin der Kernsubsti tuent ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy, Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Chlor, Fluor, Brom, Alkylthioalkyl mit 2 bis 12 Kohlen stoffatomen; Cycloalkylthioalkyl mit 4 bis 12 Kohlen stoffatomen; Acylthioalkyl, worin die Acylgruppe 2 bis 10 Kohlenstoffatome enthält und die Alkylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält.

Zu den geeigneten "Blockierungsgruppen" R^3′ gehören bei spielsweise Benzyl, Phenacyl, p-Nitrobenzyl, Methoxymethyl, Trichlorethyl, Trimethylsilyl, Tributylzinn, p-Methoxy benzyl und Benzhydryl. Diese Blockierungsgruppen werden bevorzugt, weil sie im allgemeinen anerkannt sind als leicht entfernbare Blockierungsgruppen bei dem Stand der Technik, der die Cephalosporine und Penicilline betrifft.

Besonders bevorzugte Carboxyl-Blockierungsgruppen sind Benzyl und substituiertes Benzyl:

worin n = 0 bis 2 (n = O, R′=H) und R′ Niedrigalkoxyl oder Nitro bedeuten.

Am meisten bevorzugt sind die folgenden R^3′-Reste: Niedrig alkyl, Niedrigalkenyl, wie Methallyl, 3-Methylbutenyl oder 3-Butenyl; Methylthioethyl; Benzyl und substituiertes Benzyl, wie p-tert.-Butylbenzyl, m-Phenoxybenzyl, p-Pivaloyloxy benzyl oder p-Nitrobenzyl; Pivaloyloxymethyl, 3-Phthalidyl und Acetoxymethyl, Propionyloxymethyl, Acetylthiomethyl, Pivaloylthiomethyl, Allyl, 4-Butenyl, 2-Butenyl, 3-Methyl- 2-butenyl, Phenacyl, Acetoxyacetylmethyl, Methoxymethyl, p-Acetoxybenzyl, p-Pivaloyloxybenzyl, p-Isopropoxybenzyl, 5-Indanylmethyl, 5-Indanyl, Benzyloxymethyl, Ethylthioethyl, Methylthiopropyl, Methoxycarbonyloxymethyl, Ethoxycarbonyl oxymethyl, Dimethylaminoacetoxymethyl, Crotonolacton-3-yl und Acetamidomethyl.

Identifizierung der Reste R^1′ und R^2′

R^1′ und R^2′ sind Wasserstoff und Acyl. Zum Beispiel kann Acyl aus gewählt sein aus den folgenden Gruppen:

So können also R^1′ und R^2′ unter anderem ein substituierter oder unsubstituierter aliphatischer, aromatischer oder heterocyclischer, araliphatischer oder heterocyclylali phatischer Carboxylsäurerest sein, ein substituierter oder unsubstituierter Carbamylrest oder ein Carbothiosäurerest. Eine Gruppe von Acylresten kann dargestellt werden durch die allgemeine Formel:

worin X=O oder S bedeutet und R′′ bedeutet Wasserstoff; Amino; substituiertes Amino, wie Alkyl- und Dialkylamino, worin der Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome umfaßt; substituierte oder unsubstituierte Reste, wie: geradkettige oder verzweigtkettige Alkylreste, worin der Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome umfaßt; Mercapto; Aryloxy, welches typischerweise 6 bis 10 Kohlenstoffatome umfaßt; Alkenyl- oder Alkynylgruppen, die typischerweise 2 bis 6 Kohlen stoffatome umfassen; Aryl, wie Phenyl; Aralkyl, wie Benzyl; Cycloalkyl, welches typischerweise 3 bis 6 Kohlenstoff atome umfaßt; oder eine Heteroaryl- oder Heteroaralkyl gruppe (mono- oder bicyclisch), worin die Alkylgruppe typi scherweise 1 bis 3 Kohlenstoffatome umfaßt und der hetero cyclische Ring typischerweise 4 bis 10 Atome enthält und das Heteroatom oder die Heteroatome ausgewählt sind aus O, N und S; die vorgenannten Gruppierungen können unsubstituiert sein oder sie können substituiert sein durch Reste, wie OH, SH, SR (R ist Niedrigalkyl oder Aryl, wie Phenyl), Alkyl oder Alkoxygruppen mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen, Halogen, wie Cl, Br, F und J, Cyano, Carboxy, Sulfamino, Carbamoyl, Sulfonyl, Azido, Amino, substituiertes Amino, wie Alkylamino einschließlich quaternäres Ammonium, worin die Alkylgruppen 1 bis 6 Kohlenstoffatome haben, Halogen alkyl, wie Trifluormethyl, Carboxyalkyl, Carbamoylalkyl, N-substituiertes Carbamoylalkyl, worin die Alkylgruppe der vorgenannten vier Reste 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome umfaßt, Amidino, Guanidino, N-substituiertes Guanidino oder Guanidinoniedrigalkyl. Typische Beispiele für solche Acylgruppen, die hier erwähnt werden können, sind solche, bei denen R′′ bedeutet Benzyl, p-Hydroxy benzyl, 4-Amino-4-carboxybutyl, Methyl, Cyanomethyl, 2- Pentenyl, n-Amyl, n-Heptyl, Äthyl, 3- oder 4-Nitrobenzyl, Phenäthyl, β,β-Diphenyläthyl, Methyldiphenylmethyl, Tri phenylmethyl, 2-Methoxyphenyl, 2,6-Dimethoxyphenyl, 2,4,6- Trimethoxyphenyl, 3,5-Dimethyl-4-isoxazolyl, 3-Butyl-5- methyl-4-isoxazolyl, 5-Methyl-3-phenyl-4-isoxazolyl, 3-(2-Chlorphenyl)-5-methyl-4-isoxazolyl, 3-(2,6-Dichlor phenyl)-5-methyl-4-isoxyzolyl, D-4-Amino-4-carboxybutyl, D-4N-Benzoylamino-4-carboxy-n-butyl, p-Aminobenzyl, o-Amino benzyl, m-Aminobenzyl, p-Dimethylaminobenzyl, (3-Pyridyl)- methyl, 2-Äthoxy-1-naphthyl, 3-Carboxy-2-chinoxalinyl, 3-(2,6-Dichlorphenyl)-5-(2-furyl)-4-isoxazolyl, 3-Phenyl- 4-isoxazolyl, 5-Methyl-3-(4-guanidinophenyl)-4-isoxazolyl, 4-Guanidinomethylphenyl, 4-Guanidinomethylbenzyl, 4-Guani dinobenzyl, 4-Guanidinophenyl, 2,6-Dimethoxy-4-guanidino, o-Sulfobenzyl, p-Carboxymethylbenzyl, p-Carbamoylmethyl benzyl, m-Fluorobenzyl, m-Brombenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Methoxybenzyl, 1-Naphthylmethyl, 3-Isothiazolylmethyl, 4-Isothiazolylmethyl, 5-Isothiazolylmethyl, Guanylthio methyl, 4-Pyridylmethyl, 5-Isoxazolylmethyl, 4-Methoxy-5- isoxazolylmethyl, 4-Methyl-5-isoxazolylmethyl, 1-Imidazolyl methyl, 2-Benzofuranylmethyl, 2-Indolylmethyl, 2-Phenyl vinyl, 2-Phenyläthynyl, 1-Aminocyclohexyl, 2- und 3-Thienyl aminomethyl, 2-(5-Nitrofuranyl)-vinyl, Phenyl, o-Methoxy phenyl, o-Chlorphenyl, o-Phenylphenyl, p-Aminomethylbenzyl, 1-(5-Cyanotriazolyl)-methyl, Difluormethyl, Dichlor methyl, Dibrommethyl, 1-(3-Methylimidazolyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Carboxymethylthienyl)-methyl, 2- oder 3-(4- Carbamoylthienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Methylthienyl)- methyl, 2- oder 3-(Methoxythienyl)-methyl, 2- oder 3- (4-Chlorthienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Sulfothienyl)- methyl, 2- oder 3-(5-Carboxythienyl)-methyl, 3-(1,2,5- Thiadiazolyl)-methyl, 3-(4-Methoxy-1,2,5-thiadiazolyl)- methyl, 2-Furylmethyl, 2-(5-Nitrofuryl)-methyl, 3-Furylmethyl, 2-Thienylmethyl, 3-Thienylmethyl, Tetrazolylmethyl, Benzamidinomethyl und Cyclohexylamidinomethyl.

Die Acylgruppe kann auch ein Rest der Formel sein:

worin X O oder S bedeutet und n 0 bis 4 ist und Z Sauerstoff, Schwefel, Carbonyl oder Stickstof bedeutet und R′′ die vorstehend angegebene Bedeutung hat. Typische Glieder des Substituenten

-(CH₂)_nZR′′

die hier erwähnt sein sollen, sind Allylthiomethyl, Phenylthiomethyl, Butylmercaptomethyl, α-Chlorocrotyl mercaptomethyl, Phenoxymethyl, Phenoxyäthyl, Phenoxybutyl, Phenoxybenzyl, Diphenoxymethyl, Dimethylmethoxyäthyl, Dimethylbutoxymethyl, Dimethylphenoxymethyl, 4-Guanidino phenoxymethyl, 4-Pyridylthiomethyl, p-(Carboxymethyl)- phenoxymethyl, p-(Carboxymethyl)-phenylthiomethyl, 2- Thiazolylthiomethyl, p-(Sulfo)-phenoxymethyl, p-(Carboxy methyl)-phenylthiomethyl, 2-Pyrimidinylthiomethyl, Phen äthylthiomethyl, 1-(5,6,7,8-Tetrahydronaphthyl)-oxomethyl, N-Methyl-4-pyridylthio, Benzyloxy, Methoxy, Äthoxy, Phen oxy, Phenylthio, Amino, Methylamino, Dimethylamino, Pyri diniummethyl, Trimethylammoniummethyl, Cyanomethylthio methyl, Trifluormethylthiomethyl, 4-Pyridyläthyl, 4-Pyri dylpropyl, 4-Pyridylbutyl, 3-Imidazolyläthyl, 3-Imidazolyl propyl, 3-Imidazolylbutyl, 1-Pyrroloäthyl, 1-Pyrrolopropyl und 1-Pyrrolobutyl.

Alternativ kann die Acylgruppe ein Rest der Formel

sein, worin R′′ die oben angegebene Bedeutung hat und R′′′ ein Rest ist, wie Amino, Hydroxy, Azido, Carbamoyl, Gua nidino, Amidino, Acyloxy, Halogen, wie Chlor, Fluor, Brom, Jod, Sulfamino, Tetrazolyl, Sulfo, Carboxy, Carbalkoxy oder Phosphono. Typische Glieder des Substituenten

die hier erwähnt sein sollen, sind α-Aminobenzyl, α-Amino- (2-thienyl)-methyl, α-(Methylamino)-benzyl, α-Aminomethyl mercaptopropyl, α-Amino-3- oder -4-chlorbenzyl, α-Amino-3- oder -4-hydroxybenzyl, α-Amino-2,4-dichlorbenzyl, α-Amino-3,4-dichlorbenzyl, D(-)-α-Hydroxybenzyl, α-Carb oxybenzyl, α-Amino-(3-thienyl)-methyl, D(-)-α-Amino-3- chlor-4-hydroxybenzyl, a-Amino-(cyclohexyl)-methyl, α-(5-Tetra zolyl)-benzyl, 2-Thienylcarboxylmethyl, 3-Thienylcarboxymethyl, 2-Furylcarboxymethyl, 3-Furylcarboxymethyl, α-Sulfaminobenzyl, 3-Thienylsulfaminomethyl, α-(N-Methylsulfamino)-benzyl, D(-)-2-Thienylguanidinomethyl, D(-)-α-guanidinobenzyl, α-Guanylureidobenzyl, α-Hydroxybenzyl, α-Azidobenzyl, α-Fluorbenzyl, 4-(5-Methoxy-1,3-oxadiazolyl)-aminomethyl, 4-(5-Methoxy-1,3-oxadiazolyl)-hydroxymethyl, 4-(5-Methoxy- 1,3-sulfadiazolyl)-hydroxymethyl, 4-(5-Chlorthienyl)- aminomethyl, 2-(5-Chlorthienyl)-hydroxymethyl, 2-(5- Chlorthienyl)-carboxymethyl, 3-(1,2-Thiazolyl)-aminomethyl, 3-(1,2-Thiazolyl)-hydroxymethyl, 3-(1,2-Thiazolyl)- carboxymethyl, 2-(1,4-Thiazolyl)-aminomethyl, 2-(1,4- Thiazolyl)-hydroxymethyl, 2-(1,4-Thiazolyl)-carboxymethyl, 2-Benzothienylaminomethyl, 2-Benzothienylhydroxymethyl, 2-Benzothienylcarboxymethyl, α-Sulfobenzyl, α-Phosphono benzyl, α-Diäthylphosphono und α-Monoäthylphosphono.

Weitere interessante Acylreste in dieser Klasse, bei denen X=Sauerstoff ist, sind:

worin R⁴ und R⁵ nachfolgend definiert werden. R⁴ bedeutet Wasserstoff, Halogen, wie Chlor, Fluor, Brom, Jod, Amino, Guanidino, Phosphono, Hydroxy, Tetrazolyl, Carboxy, Sulfo oder Sulfamino und R⁵ bedeutet Phenyl, substituiertes Phenyl, ein mono- oder bicyclisches Heterocyclyl, ent haltend ein oder mehrere Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatome im Ring, wie Furyl, Chinoxalyl, Thienyl, Chinolyl, Chinazolyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, Tetra zolyl, Oxadiazolyl oder Thiadiazolyl, sub stituierte Heterocyclen, Phenylthio, Phenyloxy, Niedrig alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, heterocyclische oder substituierte heterocyclische Thiogruppen oder Cyano. Die Substituenten an den Gruppierungen R⁴ und R⁵ können sein Halogen, Carboxymethyl, Guanidino, Guanidinomethyl, Carboxyamidomethyl, Aminomethyl, Nitro, Methoxy oder Methyl. Wird R⁴ ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Amino oder Carboxy und R⁵ ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phenyl oder einem 5- oder 6 gliedrigen heterocyclischen Ring mit ein oder zwei Schwe fel-, Sauerstoff- oder Stickstoffheteroatomen, wie Tetra zolyl, Thienyl, Furyl und Phenyl, so sind die folgenden Acylreste typische Beispiele: Phenylacetyl, 3-Bromphenyl acetyl, p-Aminomethylphenylacetyl, 4-Carboxymethylphenyl acetyl, 4-Carboxyamidomethylphenylacetyl, 2-Furylacetyl, 5-Nitro-2-furylacetyl, 3-Furylacetyl, 2-Thienylacetyl, 5-Chlor-2-thienylacetyl, 5-Methoxy-2-thienylacetyl, α-Guanidino-2-thienylacetyl, 3-Thienylacetyl, 2-(4-Methyl thienyl)-acetyl, 3-Isothiazolylacetyl, 4-Methoxy-3-iso thiazolylacetyl, 4-Isothiazolylacetyl, 3-Methyl-4-isothia zolylacetyl, 5-Isothiazolylacetyl, 3-Chlor-5-isothiazolyl acetyl, 3-Methyl-1,2,5-oxadiazolylacetyl, 1,2,5-Thiadia zolyl-4-acetyl, 3-Methyl-1,2,5-thiadiazolylacetyl, 3-Chlor- 1,2,5-thiadiazolylacetyl, 3-Methoxy-1,2,5-thiadiazolyl acetyl, Phenylthioacetyl, 4-Pyridylthioacetyl, Cyanoacetyl, 1-Tetrazolylacetyl, α-Fluorphenylacetyl, D-Phenylglycyl, 4-Hydroxy-D-phenylglycyl, 2-Thienylglycyl, 3-Thienylglycyl, Phenylmalonyl, 3-Chlorphenylmalonyl, 2-Thienylmalonyl, 3-Thienylmalonyl, α-Phosphonophenylacetyl, α-Aminocyclo hexadienylacetyl, α-Sulfaminophenylacetyl, α-Hydroxyphenyl acetyl, α-Tetrazolylphenylacetyl und α-Sulfophenylacetyl.

Eine Acylklasse von besonderem Interesse sind solche Acylreste, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus üblichen bekannten N-Acyl-Blockierungs- oder Schutz gruppen, wie Carbobenzyloxy, ringsubstituiertes Carbo benzyloxy, wie o- und p-Nitrocarbobenzyloxy, p-Methoxy carbobenzyloxy, Chloracetyl, Bromacetyl, Phenylacetyl, tert.-Butoxycarbonyl, Trifluoracetyl, Bromäthoxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, Dichloracetyl, o-Nitrophenyl sulfenyl, 2,2,2-Trichloräthoxycarbonyl, Brom-tert.-butoxy carbonyl, Phenoxyacetyl; nicht-acylierte Schutzgruppen, wie Triniedrigalkylsilyl, beispielsweise Trimethylsilyl und tert.-Butyldimethylsilyl sind auch von Interesse.

Eine weitere Klasse von Acylresten sind endständig sub stituierte Acyle, bei denen der Substituent eine basische Gruppe ist, die substituiert oder unsubstituiert sein kann: Amino, Amidino, Guanidino, Guanyl und Stickstoff enthaltende mono- und bicyclische Heterocyclen (aorma tisch und nicht-aromatisch), bei denen das Heteroatom oder die Heteroatome zusätzlich zum Stickstoff ausgewählt sind aus Sauerstoff und Schwefel. Solche substituierten Acyle können durch die folgende Formel:

gekennzeichnet werden, worin m und n ganze Zahlen von 0 bis 5 sind;
A ist 0, NR′ (R′ ist Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), S oder A ist eine Einfachbindung; und Y° ist ausgewählt aus den folgenden Gruppen:

1. Amino oder substituiertes Amino:

worin die Werte für R° unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff; N(R′)₂ (R′ ist Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen); Niedrigalkyl und Niedrig alkoxyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; Niedrigalkoxyniedrig alkyl, worin die Alkoxylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome um faßt und die Alkylgruppe 2 bis 6 Kohlenstoffatome hat; Cycloalkyl und Cycloalkylalkyl, worin die Cycloalkyl gruppe 3 bis 6 Kohlenstoffatome umfaßt und die Alkyl gruppe 1 bis 3 Kohlenstoffatome hat, und wobei zwei R°- Gruppen miteinander verbunden sein können über das N- Atom, an welches sie gebunden sind unter Ausbildung eines Ringes mit 3 bis 6 Atomen;

2. Amidino und substituiertes Amidino:

worin die Werte für R° unabhängig voneinander ausgewählt sind aus den Gruppen: Wasserstoff; N(R′)₂ (R′ ist Wasser stoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen); Niedrigalkyl und Niedrigalkoxyl mit 1 bis 6 Kohlenstoff atomen, Niedrigalkoxyniedrigalkyl, worin die Alkoxylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält und die Alkylgruppe 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthält (falls der Niedrigalkoxyniedrig alkylrest an ein Kohlenstoffatom gebunden ist, umfaßt die Alkylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome); Cycloalkyl und Cycloalkylalkyl, worin die Alkylgruppe 1 bis 3 Kohlenstoff atome umfaßt; zwei R°-Gruppen können miteinander verbunden sein mit dem Atom, an das sie gebunden sind unter Ausbil dung eines Ringes mit 3 bis 6 Atomen;

3. Guanidino und substituiertes Guanidino:

worin R° die oben angegebene Definition unter 2. hat;

4. Guanyl und substituiertes Guanyl:

worin R° die Definition, wie vorher in 2. angegeben, hat;

5. Stickstoff enthaltende mono- und bicyclische Hetero cyclyle (aromatisch und nicht-aromatisch) mit 4 bis 10 Kernatomen, worin das Heteroatom oder die Heteroatome außer Stickstoff ausgewählt sind aus Sauerstoff und Schwefel. Solche Heterocyclyle werden typischerweise illustriert durch die folgende Aufzählung von Resten (R′ ist H oder Niedrigalkyl mit 1 bis Kohlenstoffatomen):

Die folgenden spezifischen Acylreste, die in diese Klasse fallen, sind zusätzlich repräsentativ:

Herstellung der Ausgangsmaterialien Ib, Ic und Id

Die vorher beschriebenen Ausgangsmaterialien Ic und Id werden einfach hergestellt aus einem N-geschützten Thienamycin, wie einem N-acylierten Thienamycin

worin R^1′ und R^2′ ausgewählt sind aus Wasserstoff und den vorher genannten Acylresten. Vorzugsweise ist R^1′ Wasserstoff und R^2′ ist eine einfach entfernbare Blockie rungsgruppe, wie: Carbobenzyloxy, ring-substituiertes Carbobenzyloxy, wie o- und p-Nitrocarbobenzyloxy, p-Meth oxycarbobenzyloxy, Chloracetyl, Bromacetyl, Phenylacetyl, t-Butoxycarbonyl, Trifluoracetyl, Bromäthoxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, Dichloracetyl, o-Nitrophenyl sulfenyl, 2,2,2-Trichloräthoxycarbonyl, Brom-t-butoxy carbonyl, Phenoxyacetyl; nicht-acylgeschützte Gruppen, wie Triniedrigalkylsilyl, beispielsweise Trimethylsilyl und tert.-Butyldimethylsilyl sind auch von Interesse. Die am meisten bevorzugten N-Blockierungsgruppen sind substituierte und unsubstituierte Carbobenzyloxyreste:

worin n 0 bis 2 (n = 0, R′=Wasserstoff) bedeutet und R′ ist Niedrigalkoxy oder Nitro; und Brom-tert.- butoxycarbonyl,

Die schließlich erfolgende N-Entblockierung bei der Herstellung von Ic wird nach einer Vielzahl von bekannten Verfahren durchgeführt, einschließlich Hydrolyse oder Hydrierung; wird eine Hydrierung verwen det, so schließen geeignete Bedingungen ein Lösungsmittel ein, wie ein Niedrigalkanol in Gegenwart eines Hydrierungs katalysators, wie Palladium, Platin oder Oxiden davon.

Das N-acylierte Zwischenprodukt Ib wird her gestellt, indem man Thienamycin (I) mit einem Acylierungs mittel behandelt, beispielsweise einem Acylhalogenid oder einem Acylanhydrid, wie einem aliphatischen, aromatischen, heterocyclischen, araliphatischen oder heterocyclischen aliphatischen Carbonsäurehalogenid oder -anhydrid. Andere Acylierungsmittel, die auch verwendet werden können, sind beispielsweise gemischte Carbonsäureanhydride und insbeson dere Niedrigalkylester von gemischten Carboxyl-Carbonsäure anhydriden; auch Carboxylsäuren in Gegenwart eines Carbo diimids, wie 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid, und ein aktivier ter Ester von Carboxylsäuren, wie p-Nitrophenylester, sind geeignet.

Die Acylierungsreaktion kann durchgeführt werden bei Tem peraturen im Bereich von etwa -20 bis etwa 100°C, aber vorzugsweise wendet man Temperaturen an im Bereich von -9°C bis 25°C. Jedes Lösungsmittel, in dem die Reaktanten löslich sind und das im wesentlichen inert ist, kann ver wendet werden, beispielsweise polare Lösungsmittel, wie Wasser, Alkohole und polare organische Lösungsmittel, im allgemeinen solche, wie Dimethylformamid (DMF), Hexa methylphosphoramid (HMPA), Aceton, Dioxan, Tetrahydro furan (THF), Acetonitril, heterocyclische Amine, wie Pyridin, Äthylacetat, wäßrige Mischungen der vorgenann ten, sowie auch halogenierte Lösungsmittel, wie Methylen chlorid und Chloroform. Die Umsetzung wird eine Zeitlang durchgeführt, die im Bereich von etwa 5 Minuten bis zu einem Maximum von 3 Stunden dauert, aber im allgemeinen reicht eine Reaktionszeit von etwa 0,5 bis etwa 1 Stunde aus. Die folgende Gleichung beschreibt dieses Verfahren unter Verwendung eines Carbonsäurehalogenids; es ist je doch selbstverständlich, daß man durch Verwendung eines Carbonsäureanhydrids oder eines anderen funktionellen äqui valenten Acylierungsmittels gleiche Produkte erhalten kann:

Im allgemeinen, wenn bei der oben beschriebenen Acylie rungsreaktion ein Säurehalogenid (geeignete Halogenide sind Chloride, Jodide oder Bromide) oder ein Säureanhydrid verwendet wird, wird die Umsetzung in Wasser oder einer wäßrigen Mischung eines polaren organischen Lösungsmittels, wie Aceton, Dioxan, THF, DMF oder Acetonitril in Gegenwart eines geeigneten basischen Akzeptors, wie NaHCO₃, MgO, NaOH oder K₂HPO₄ vorgenommen.

Beim Durchführen der hier beschriebenen Umsetzung ist es im allgemeinen nicht notwendig, die 2-Carboxygruppe oder die 1′-Hydroxygruppe zu schützen; in den Fällen, in denen das Acylierungsmittel außerordentlich wasserempfind lich ist, ist es manchmal vorteilhaft, die Acylierung in einem nicht-wäßrigen Lösungsmittelsystem vorzunehmen. Triorganosilyl (oder Zinn)-Derivate des Thienamycins er geben schnell die Tris-Triorganosilylderivate, beispiels weise Tris-Trimethylsilylthienamycin Th(TMS)₃:

Diese Derivate, die leicht löslich in organischen Lösungs mitteln sind, werden auf einfache Weise hergestellt, in dem man Thienyamcin mit einem Überschuß an Hexamethyl disilazan und einer stöchiometrischen Menge von Trimethyl chlorsilan bei 25°C unter kräftigem Rühren unter einer N₂- Atmosphäre umsetzt. Das dabei entstehende NH₄Cl wird durch Zentrifugieren entfernt und das Lösungsmittel wird durch Verdampfen entfernt, wobei man das gewünschte Silylderivat erhält.

Das Zwischenausgangsprodukt Ic wird hergestellt nach dem folgenden Schema; dabei ist jedoch zu beachten, daß eine direkte Veresterung, ohne Schutz der Aminogruppe auch möglich ist.

worin alle Symbole die vorher angegebene Bedeutung haben.

Im allgemeinen wird der Übergang (Ib→Ic) bewirkt nach üblichen Verfahren des Standes der Technik. Zu diesen Verfahren gehören:

1. Umsetzung von Ib (oder I) mit einem Diazoalkan, wie Diazomethan, Phenyldiazomethan oder Diphenyldiazomethan, in einem Lösungsmittel, wie Dioxan, Ethylacetat oder Aceto nitril, bei Temperaturen zwischen 0°C und Rückfluß für eine Zeitdauer von wenigen Minuten bis 2 Stunden.
2. Umsetzung eines Alkalisalzes von Ib mit einem aktivierten Alkylhalogenid, wie Methyljodid, Benzylbromid oder m-Phenoxybenzylbromid, p-tert.-Butylbenzylbromid oder Pivaloyloxymethylchlorid. Geeignete Reaktionsbedingungen schließen Lösungsmittel, wie Hexamethylphosphoramid sowie Temperaturen von 0°C bis 60°C während eines Zeitraumes von wenigen Minuten bis zu 4 Stunden ein.
3. Umsetzung von Ib mit einem Alkohol, wie Methanol, Ethanol oder Benzylalkohol. Diese Umsetzung kann durchge führt werden in Gegenwart eines Carbodiimidkondensierungs mittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid. Geeignete Lösungs mittel bei Temperaturen zwischen 0°C und der Rückfluß temperatur und Reaktionszeiten von 15 Minuten bis 18 Stunden schließen ein CHCl₃, CH₃Cl oder CH₂Cl₂.
4. Umsetzung von einem N-acylierten Säureanhydrid von Ib hergestellt durch Umsetzung der freien Säure Ib mit einem Säurechlorid, wie Ethylchlorformiat oder Benzyl chlorformiat, mit einem Alkohol, wie den unter 3. aufge zählten, unter den gleichen Reaktionsbedingungen wie unter 3. genannt. Das Anhydrid wird hergestellt durch Umsetzung von Ib und dem Säurechlorid in einem Lösungsmittel, wie Tetrahydrofuran (THF) oder CH₂Cl₂ bei Temperaturen von 25°C bis zur Rückflußtemperatur während 15 Minuten bis 10 Stunden.
5. Umsetzung von labilen Estern von Ib, wie Trimethyl silylester oder Dimethyl-tert.-butylsilylester mit R^3′X°, worin X° Halogen, wie Brom oder Chlor, ist und R^3′ die vorher angegebene Bedeutung hat, in einem Lösungsmittel, wie THF oder CH₂Cl₂ bei Temperaturen zwischen 0°C und Rück fluß während 15 Minuten bis 16 Stunden. Diese Umsetzung erfolgt beispielsweise nach dem folgenden Schema: worin TMS Triorganosilyl, wie Trimethylsilyl, bedeutet und alle anderen Symbole die vorher angegebene Bedeutung haben.

Die vorher wiedergegebenen Schemata für die Veresterung sind bekannt bei den verwandten bicyclischen β-Lactam antibiotika und allgemein bei organischen Synthesen und es soll hier festgestellt werden, daß keine besonderen kritischen Bedingungen hinsichtlich der Reaktionsparameter bei der Herstellung der N-acylierten und Carboxylderivate Ic, die als Ausgangsverbindungen für die vorliegende Er findung geeignet sind, erforderlich sind.

Herstellung

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, wie sie in einfacher Weise erfolgt, wird nach den vorher de finierten zwei Klassen bzw. Ausführungsformen beschrie ben, nämlich:
1. Amidine und 2. Guanidine.

1. Amidine

Im allgemeinen können die Verbindungen der Klasse 1 ein fach hergestellt werden, indem man Thienamycin (I) oder Ic oder deren pharmazeutisch annehmbare, für β-Lactamanti biotika übliche Salz- oder Esterderivate der Carboxylgruppe mit einem Imidoester (a) oder einem substituierten Imido halogenid (b) umsetzt:

worin R¹, R² und R die vorher angegebene Bedeutung haben; X′ ist Halogen, wie Chlor; und -X°R′′ ist eine austretende Gruppe, worin R′′ Niedrigalkyl, wie Methyl oder Ethyl und X° O oder S bedeuten. Alternativ können die Verbindungen der Klasse 1 hergestellt werden durch Umsetzung eines Imido esters oder Imidothioesters der Formel IV

oder eines pharmazeutisch annehmbaren, für β-Lactamanti biotika üblichen Salz- oder Esterderivats der Carboxyl gruppe davon, worin X′=-OR oder -SR bedeutet, mit NH₃ oder einer primären oder sekundären Aminoverbindung (c), die so ausgewählt ist, um die gewünschte Art der Klasse 1 zu ergeben. Die Reagentien a, b und c sind nachfolgend repräsentativ aufgezählt.

Ein typisches Beispiel für solche Imidoester (der Substi tuent und die Aminogruppe des Thienamycins bilden die Imido esterstruktur) ist:

Methylformimidat: X′ = -OCH₃, R = -H.

Geeignete Lösungsmittel für die Herstellung der Verbin dungen der Klasse 1 nach dem vorgenannten Reaktionsschema sind abhängig von der Art die Thienamycinsubstrats und des Reagens und schließen ein Wasser, Dioxan, Tetrahydro furan (THF), Dimethylformamid (DMF), Chloroform, Aceton, Acetonitril oder Mischungen davon. Die Umsetzung wird vor genommen bei Temperaturen im Bereich von 0°C bis etwa 25°C während einer bis etwa 6 Stunden. Die genaue Identität des Reaktionslösungsmittels und die Möglichkeiten der Reaktion innerhalb der vorher angegebenen Grenzen sind nicht kritisch, vorausgesetzt daß das Reaktionslösungs mittel inert ist oder im wesentlichen inert für den beab sichtigten Reaktionsverlauf. Geeignete typische Reagentien schließen ein:

a) Imidoester

Methylformimidat, Äthylformimidat, Methylacetimidat, Äthyl acetimidat, Ethyl-N-methylformimidat, Methyl-N-methyl formimidat oder Methyl-N-isopropylformimidat.

Solche Imidoester-Reagentien (a) werden in einfacher Weise hergestellt nach einer Vielzahl von möglichen Verfahrensweisen, wie:

1. Umsetzung eines Nitrils, RCN, mit einem Niedrig alkanol in Gegenwart von HCl nach der bekannten Pinner- Synthese.
2. Die Umsetzung eines Nitrils, RCN, mit einem Niedrig alkanol in Gegenwart einer Base. Typischerweise wird die Umsetzung bei 0 bis 40°C in Gegenwart eines Überschusses des Alkohols mit einer katalytischen Menge eines Alkali alkoxids während 15 Minuten bis 4 Stunden vorgenommen.
3. Die Umsetzung eines Amids, mit einem Alkylchlorformiat, wie Methylchlorformiat, bei 25°C bis 45°C während 1 bis 4 Stunden.
4. Die Umsetzung eines N-substituierten Amids, mit einem Äquivalent eines Alkylierungsmittels, wie Triäthyloxoniumfluorborat, in einem inerten Lösungs mittel, wie Äther, Chloroform und dergleichen, bei 0 bis 23°C während 10 Minuten bis 2 Stunden.
5. Die Umsetzung eines leicht erhältlichen Imidoesters, (R′ kann Wasserstoff sein), zu dem gewünschten Imido ester, durch Umsetzung der ersterwähnten Verbindung mit einem Alkylamin, R′NH₂, in einer Mischung aus Wasser und einem mischbaren Lösungsmittel, wie einem Äther oder Chloro form, bei 0 bis 23°C während 5 Minuten bis 1 Stunden.

b) Substituierte Imidohalogenide

Chlordimethylformiumchlorid oder Chlordiethylformium chlorid.

Solche Imidohalogenid-Reagentien (b) werden in einfacher Weise hergestellt nach einer Vielzahl von möglichen Ver fahrensweisen, wie:
1. Die Umsetzung eines N,N-disubstituierten Amids,

mit einem Halogenierungsmittel, wie Thionyl chlorid oder Phosgen, Phosphorpentachlorid, in einem inerten Lösungsmittel, wie Chloroform, Methylenchlorid und dergleichen, bei 0 bis 40°C während 1 bis 5 Stunden.

c) Primäre und sekundäre Aminoverbindungen

Methylamin, Ethylamin, Dimethylamin, Methylbenzylamin, Isopropylamin.

Die Umsetzung einschließlich des Reagens (a) kann durch das folgende Diagramm wiedergegeben werden:

worin -X°R′′ die austretende Gruppe des Imidoesterreagens ist und R, R¹, R², R^3′, R′′ und X° die vorher angegebene Be deutung haben. Diese Umsetzung ist besonders geeignet für die Ausführungsform, worin R^3′ Wasserstoff ist.

Die Umsetzung, bei welcher das Reagens (b) verwendet wird, kann durch das folgende Diagramm gezeigt werden:

worin alle Symbole die vorher angegebene Bedeutung haben.

Die Umsetzung, bei welcher das Reagens (c) verwendet wird, kann durch das folgende Diagramm gezeigt werden:

worin alle Symbole die früher angegebene Definition haben und X=-OR oder -SR ist, wobei R vorzugsweise Niedrig alkyl, wie Methyl oder Äthyl, bedeutet. Ist R^3′ eine leicht entfernbare Blockierungs- oder Schutzgruppe, so kann sie entfernt werden unter Ausbildung der er findungsgemäßen Verbindungen II.

2. Guanidine

Im allgemeinen können die Verbindungen der Klasse 2 einfach hergestellt werden, indem man (a) Thienamycin oder dessen pharmazeutisch annehmbare, für β-Lactamantibiotika übliche Salz- und Esterderivate der Carboxylgruppe mit einem -OR°- (beispielsweise O-Alkyl, O-Aryl) Pseudoharnstoff oder einem S-Alkyl- oder S-Arylpseudothioharnstoff umsetzt oder (b) durch Umsetzung eines substituierten Pseudoharnstoffs der Formel III

worin R^3′, R¹ und R² die vorher angegebene Bedeutung haben, und X′=die austretende Gruppe -OR oder -SR ist, mit Ammoniak.

Geeignete Lösungsmittel für solche Umsetzungen schließen ein Wasser und gepufferte wäßrige polare organische Lösungs mittelmischungen mit einem pH von 7 bis 9 oder wasserfreie polare organische Lösungsmittel, wie Dimethylformamid oder Hexamethylphosphoramid bei einer Temperatur von 0°C bis 40°C während 1 bis 24 Stunden.

Geeignete Reagentien für (a) sind z. B. O-Methylpseudo harnstoff, S-Methylpseudothioharnstoff, 0-2,4-Dichlor phenylpseudoharnstoff oder S-p-Nitrophenylpseudoharn stoff.

Die Umsetzung (a) kann durch das folgende Diagramm wieder gegeben werden:

worin R^3′, R¹ und R² die vorher angegebene Bedeutung haben; X′′ ist O oder S und R° ist wie angegeben und vorzugsweise Niedrigalkyl oder Aryl.

Die Umsetzung (b) kann durch das folgende Diagramm wiedergegeben werden:

wobei alle Symbole die vorher angegebene Bedeutung haben.

Die vorstehend unter 2. genannten Verbindungen der Formel III können hergestellt werden durch Umsetzung eines Carbamyl- oder Thiocarbamyl-N-substituierten Thienamycins (a), bei spielsweise:

mit einem Alkylierungsmittel (b), wie einem aktiven Alkylhalogenid oder Sulfatester.

Geeignete Lösungsmittel für die vorgenannte Reaktion schließen ein Niedrigalkanol, Dioxan und Acetonitril bei Temperaturen von 20°C bis 60°C während 1 bis 4 Stunden.

Geeignete Reagentien (a) für das vorgenannte Reaktions schema schließen ein N-Acylthienamycine:

worin R^3′ die vorher angegebene Bedeutung hat und R¹ Acyl ist, bestehend aus:

wie: Carbamyl, Methylcarbamyl, Ethylcarbamyl oder Methylthiocarbamyl.

Geeignete Reagentien (b), nämlich Alkylierungsmittel, schließen ein: Methyljodid, Dimethylsulfat oder Diethyl sulfat.

Die Umsetzung, welche die vorgenannten Reagentien (a) und (b) einschließt, kann durch das folgende Diagramm wiedergegeben werden:

worin X′′ Sauerstoff oder Schwefel ist; X° ist Halogen, wie Brom oder Jod oder Alkylsulfat; RX° ist das Alkylie rungsmittel und R¹, R², R^3′ und R haben die vorher ange gebene Bedeutung.

Die vorstehend unter 1. genannten Verbindungen der Formel IV können hergestellt werden durch Umsetzung eines geeignet geschützten N-Acyl- oder N-Thioacylderivats von Thienamycin (a) mit einem Alkylierungsmittel (b).

Geeignete Lösungsmittel für die vorgenannte Reaktion schließen ein Methylenchlorid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Chloroform und dergleichen bei Temperaturen von -78°C bis 25°C während 5 Minuten bis 3 Stunden.

Geeignete N-Acylthienamycin-Ausgangsverbindungen (a) schließen ein:

worin R^1′ Acyl,

bedeutet, wie Formyl oder Thioacetyl; und R^3′ die vorgenannte Bedeutung hat.

Geeignete Alkylierungsmittel (b) schließen ein: Tri äthyloxoniumfluorborat, Methylfluorsulfonat und Trimethyl oxoniumhexafluorphosphat.

Die Umsetzung, welche die obengenannten Reagentien (a und b) einschließt, kann repräsentativ durch das folgende Diagramm wiedergegeben werden:

worin X′′=O oder S bedeutet und R^3′ und R die vorher an gegebene Bedeutung haben. Das Entblocken kann durch eine milde wäßrige Hydrolyse bei pH 3 bis 6 erreicht werden. Es ist dabei festzuhalten, daß die vorgenannte Reaktions mischung direkt verwendet werden kann zur Umsetzung mit dem Amin (c), wie bei der Herstellung der Amidine der Klasse 1 vorher beschrieben worden ist.

Die Produkte gemäß der Erfindung (II und IIa) bilden eine Vielzahl von pharmakologisch annehmbaren Salzen, wie Säureadditionssalze, beispielsweise mit Chlorwasser stoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpeter säure, p-Toluolsulfonsäure und Methansulfonsäure. Die Salze dieser Erfindung sind pharmakologisch akzeptierbare nicht-toxische Derivate, die als aktive Bestandteile in geeigneten pharmazeutischen Dosierungsformen verwendet werden können. Sie können auch mit anderen Arzneimitteln vereint werden, um Zusammensetzungen zu bilden, die ein breites Aktivitätsspektrum haben.

Die neuen Verbindungen sind neue wertvolle Antibiotika, die aktiv sind gegen verschiedene gram-positive und gram- negative Bakterien und die deshalb in der Human- und Ve terinärmedizin Verwendung finden. Die Verbindungen der Er findung können deshalb als antibakterielle Arzneimittel für die Behandlung von Infektionen verwendet werden, die durch gram-positive und gram-negative Bakterien verursacht werden, beispielsweise gegen Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia, Sal monella typhosa, Pseudomonas und Bacterium proteus. Die erfindungsgemäßen Bakterizide können weiterhin verwendet werden als Additive für Futtermittel und zum Konservieren von Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel. Sie können beispielsweise in wäßrigen Zusammensetzungen in Konzen trationen im Bereich von 0,1 bis 100 Teile des Antibiotikums pro Million Teile Lösung verwendet werden, um das Wachstum von schädlichen Bakterien auf medizinischen und dental technischen Ausrüstungen zu zerstören oder zu inhibieren und auch als Bakterizide bei industriellen Anwendungen, beispielsweise bei auf Wasser aufgebauten Anstrichmitteln, beim Weißwasser von Papiermühlen, um das Wachstum von schädlichen Bakterien zu inhibieren.

Die erfindungsgemäßen Produkte können allein verwendet werden oder in Kombination mit aktiven Bestandteilen in einer Vielzahl von pharmazeutischen Zubereitungen. Diese Antibiotika und ihre entsprechenden Salze können in Form von Kapseln oder als Tabletten, als Pulver oder als flüs sige Lösungen oder als Suspensionen und Elexiere verwen det werden. Sie können oral, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden.

Die Zusammensetzungen werden vorzugsweise in einer solchen Form zubereitet, daß sie im Magen-Darm-Kanal absorbiert werden. Tabletten und Kapseln für eine orale Verabreichung können in Einzeldosierungsform vorliegen und können üb liche Excipientien, wie Bindemittel, enthalten, beispiels weise Sirup, Gummi arabicum, Gelatine, Sorbose, Traganth oder Polyvinylpyrrolidon; Füllstoffe, beispielsweise Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbose oder Glycerin; Schmiermittel, beispielsweise Magnesiumstearat, Talkum, Polyäthylenglykol, Siliciumdioxid; Zerfallmittel, beispiels weise Kartoffelstärke oder geeignete Befeuchtungsmittel, wie Natriumlaurylsulfat. Die Tabletten können in bekannter Weise beschichtet werden. Orale flüssige Präparationen können in Form von wäßrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen oder Elixieren vorliegen oder können als trockenes Produkt hergestellt werden, damit sie dann mit Wasser oder einem anderen geeignete Trägermaterial vor ihrer Verwendung angemacht werden können. Solche flüssigen Zubereitungen können üb liche Additive, wie Suspensionsmittel, beispielsweise Sorbose, Sirup, Methylcellulose, Glukose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxyäthylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel oder hydrierte eßbare Öle, beispielsweise Mandelöl, fraktioniertes Kokosnußöl, Öl ester, Propylenglykol oder Äthylalkohol; Kon servierungsmittel, beispielsweise Methyl- oder Propyl- p-hydroxybenzoat oder Sorbinsäure enthalten. Suppositorien ent halten die üblichen hierfür geeigneten Substanzen, bei spielsweise Kakaobutter oder andere Glycerine.

Zusammensetzungen für Injektionen können in Einzeldosie rungen in Form von Ampullen hergestellt werden oder in Behältern mit zugesetzten Konservierungsmitteln für Mehr fachdosierungen. Die Zusammensetzungen können in Form von Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in Öl oder wäßrigen Trägermaterialien vorliegen und sie können Formulierungs mittel, wie Suspensionsmittel, Stabilisierungsmittel und/oder Dispergiermittel enthalten. Alternativ können die ak tiven Bestandteile in Form von Pulver vorliegen, damit sie mit einem geeigneten Trägermaterial, beispielsweise sterilem, keimfreien Wasser vor der Anwendung angemacht werden können.

Die Zusammensetzungen können auch in geeigneten Formen für die Absorption zubereitet werden durch die Schleim häute der Nase und das Hals- und Bronchialgewebe und sie können in einfacher Weise auch in Form von pulvrigen oder flüssigen Sprays für Inhalationen zubereitet werden oder in Form von Pastillen oder Zubereitungen für Halspinselung. Für die medizinische Anwendung an den Augen oder Ohren können die Zubereitungen als besondere Kapseln in flüssiger oder halbflüssiger Form vorliegen oder sie können als Tropfen verwendet werden. Für topische Anwendungen kann man hydrophobe oder hydrophile Basen als Salben, Cremes, Lotionen, Salbungsmittel oder Pulver for mulieren.

Außer einem Trägermaterial können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auch weitere Bestandteile, wie Stabili satoren, Bindemittel, Antioxidantien, Konservierungsmittel, Schmiermittel, Suspensionsmittel, Viskositätsmittel oder Geschmacksstoffe enthalten. Darüber hinaus können in den Zusammensetzungen auch andere aktive Bestand teile vorhanden sein, um ein breiteres Spektrum der anti biotischen Aktivität zu bewirken.

Für die Veterinärmedizin können die Zusammensetzungen bei spielsweise als innerhalb der Brust einlegbare Zubereitungen mit einer entweder schnellen oder langsamen Abgabe wirkung formuliert werden.

Die zu verabreichenden Dosierungen hängen zu einem erheb lichen Teil von dem Zustand des behandelten Patienten ab und von dem Gewicht des Patienten, der Verabreichungsroute und der Häufigkeit der Verabreichung, wobei die parenterale Route für allgemeine Infektionen bevorzugt wird und die orale Route für Infektionen der Eingeweide. Im allgemeinen enthält eine tägliche orale Dosierung etwa 2 bis etwa 600 mg aktiven Bestandteil pro kg Körpergewicht des Patienten bei einer oder mehreren Verabreichungen pro Tag. Eine bevorzugte tägliche Dosierung für Erwachsene liegt im Bereich von etwa 15 bis 150 mg an aktivem Be standteil pro kg Körpergewicht.

Die vorliegenden Zusammensetzungen können in verschie denen Einzeldosierungsformen verabreicht werden, bei spielsweise in festen oder in flüssigen oral aufnehmbaren Dosierungsformen. Die Zusammensetzungen pro Einzeldosie rung, ob sie flüssig oder fest ist, sill etwa 0,1% bis 99% an aktivem Material enthalten, wobei der bevorzugte Bereich zwischen etwa 10 und 60% liegt. Die Zusammen setzungen enthalten im allgemeinen etwa 15 mg bis etwa 1500 mg an aktivem Bestandteil; im allgemeinen ist es jedoch bevorzugt, eine Dosierungsmenge im Bereich von etwa 100 bis 1000 mg zu verwenden. Bei einer parenteralen Verabreichung ist die Einzeldosierung im allgemeinen die reine Verbindung in einer leicht angesäuerten wäßrigen sterilen Lösung oder in Form eines löslichen Pulvers, das zum Auflösen bestimmt ist.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung, ohne diese aber zu beschränken. In den Beispielen wird der Thienamycinkern (I, wie vorher angegeben) durch das folgende Symbol wiedergegeben

an dem die sekundäre Alkoholgruppe, die Aminogruppe und die Carboxylgruppe enthalten sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können deshalb in einfacher Weise wie folgt beschrieben werden:

worin R, R¹, R², R^3′ und A die vorher angegebene Be deutung haben.

Beispiel 1 (Ausgangsmaterial) Herstellung von silyiertem Thienamycin

Thienamycin (80,0 mg) wird in 40 ml Tetrahydrofuran (THF) unter einer Stickstoffatmosphäre suspendiert und auf 10 ml konzentriert; dazu werden Hexamethyldisilazan (1,0 ml) und Trimethylchlorsilan (300 µl) gegeben. Die Mischung wird 20 Minuten bei 25°C unter heftigem Rühren umgesetzt. Dann wird die Suspension zur Entfernung von Ammonium chlorid zentrifugiert. Das Überstehende wird unter einem Stickstoffstrom zu einem Öl für die weitere Umsetzung ein gedampft.

Beispiel 2 Herstellung von N-Formimidoylthienamycin

Thienamycin (517 mg) wird in pH 7 0,1 n Phosphatpuffer (25 ml) gelöst und unter magnetischem Rühren auf einem Eisbad gekühlt. Die Lösung wird unter Verwendung von 2,5 n Natriumhydroxidlösung, die aus einer automatischen Burette ausgegeben wird, auf einen pH von 8,5 eingestellt. Unter Aufrechterhaltung eines pHs von 8,5 wird im Laufe von 2 bis 3 Minuten portionsweise Methylformimidat-Hydrochlorid (711 mg) zugegeben. Nach weiteren 10 Minuten wird der pH der Lösung unter Verwendung von 2,5 n Chlorwasserstoffsäure auf 7,0 gebracht. Die Lösung wird über einer Säule aus XAD-2 Harz (150 cm³) chromatographiert unter Eluieren mit Wasser. Das N-Formimidoylthienamycinderivat eluiert in 1,5-2,0 Säulenvolumen (200 bis 300 cm³) und wird zu einem weißen Feststoff (217 mg) gefriergetrocknet.

UV (pH 7 0,1 n Phosphatpuffer)g _max 297 nm (ε 8 590).
IR (Nujol mull) 1767 cm^-1 (β-Lactam).
KMR (D₂O) δ 1,37 (d, J=6 Hz, CH₃-CH), 3,0-3,75 (m, -CH₂-), 4,2-4,8 (m, C_5H, C_6H, C_7H),

Beispiel 3 Herstellung von N-Guanylthienamycin

Thienamycin (8,9 mg) wird in pH 7 0,1 n Phosphatpuffer (0,7 ml) und N,N-Dimethylformamid (0,3 ml) gelöst und die Lösung wird unter Zugabe von 2,5 n Natriumhydroxidlösung auf Ph 9,5 gebracht. Zu der magnetisch gerührten Lösung gibt man O-Methylisoharnstoff·Hydrogensulfat (43 mg), wodurch ein leichter Abfall des pHs bewirkt wird. Zusätz liche Natriumhydroxidlösung wird zugegeben, wobei der pH zurück auf 9,5 eingestellt wird und die Lösung wird 30 Minuten bei 23°C gerührt. Die Lösung wird dann auf einen pH von 7,0 angesäuert. Eine Probe der Lösung, enthaltend eine Mischung aus Thienamycin und N-Guanylthienamycin, zeigt zwei bioaktive Zonen nach Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten, 0,05 n pH 7 Phosphatpuffer) und Bioautographie gegen S. aureus Platten.

Beispiel 4 Herstellung von N-Guanylthienamycin

Thienamycin (11 mg) wird in einem pH 7 0,1 n Phosphat puffer (1 ml) gelöst und mit 0,1 n Natriumhydroxid mittels einer automatischen Ausgabeburette auf den pH 8,3 einge stellt. Zu der magnetisch gerührten Lösung gibt man 0-2,4,5- Trichlorphenylisoharnstoff·Hydrochlorid (76 mg) in ein zelnen Portionen, wobei man mittels der automatischen Aus gabeburette den pH nahezu konstant hält. Die Umsetzung wird 4 Stunden bei 22°C durchgeführt und dann wird mit ver dünnter Säure der pH auf 7,0 wieder eingestellt. Eine Probe dieser Lösung, enthaltend Thienamycin und N-Guanylthien amycin, wird elektrophoretisch behandelt (50 V/cm, 25 Minu ten, pH 7 0,1 n Phosphatpuffer) und zeigt eine positive Sakaguchi Sprühzone bei 2,0 cm gegenüber einer Anode und eine positive Ninhydrin-Sprayzone bei 1,5 cm in der gleichen Richtung.

Beispiel 5 (Ausgangsmaterial) Herstellung von 0-2,4,5-Trichlorphenylisoharnstoff.Hydrochlorid

Eine Lösung aus Cyanamid (0,28 mg) in Äther (0,50 ml) wird mit 2,4,5-Trichlorphenol (12,5 g) gemischt. Die Mischung wird auf 70°C erhitzt und die Schmelze wird magnetisch gerührt während man das Reaktionsgefäß mit Stickstoff spült. Dann wird trockenes Chlorwasserstoffgas langsam durch die Schmelze hindurchgeperlt und die Mischung wird auf 22°C abgekühlt. Der erhaltene Feststoff wird gründlich mit Äther gewaschen und filtriert, wobei man 0-2,4,5-Trichlorphenylisoharnstoff.Hydrochlorid als weißen Feststoff F. 205 bis 206°C erhält.

Beispiel 6 Herstellung von N-Dimethylaminoethylenthienamycin

Thienamycin (16,5 mg) wird silyliert mit Hexamethyldisilazan (200 µl) und Trimethylchlorsilan (60 µl) in üblicher Weise. Das silylierte Thienamycin wird in äthanolfreiem Chloroform (1 ml) unter magnetischem Rühren und unter einer Stickstoffatmosphäre suspendiert. Die Mischung wird auf -45°C gekühlt und dazu wird eine Lösung aus Triäthylamin (21 µl) in Chloroform (21 µl) gegeben und anschließend daran eine Lösung aus (Chlormethylen)-dimethylammoniumchlorid (11,5 mg) in Chloroform (50 µl). Die Mischung wird erwärmt auf -25°C innerhalb 1 Stunde und 0,1 n pH 7 Phosphatpuffer (5 ml) wird zugegeben. Die Mischung wird heftig 15 Minuten gerührt. Die wäßrige Phase wird abgetrennt und enthält N-Dimethylaminomethylenthienamycin, das eine elektrophoretische Beweglichkeit (50 V/cm, 1 Stunde, pH 7 Puffer) von 3,6 cm in Richtung auf die Kathode zeigt.

Beispiel 7 Herstellung von N-Formimidoylthienamycin-Pivaloxymethylesterhydrobromid

N-Aminoethylenthienamycin (10 mg) wird in Hexamethylphosphoramid (200 µl) gelöst, enthaltend Brommethylpivalat (10 µl) und Triäthylamin (1 µl), und magnetisch bei 22°C gerührt. Nach 2 Stunden wird die Hexamethylphosphoramidlösung in 2 ml Methylenchlorid gelöst und das Produkt mit einer 50% Hexan/Äther-Lösung ausgefällt. Der Niederschlag wird in einer wäßrigen 10%igen Tetrahydrofuranlösung gelöst und über eine XAD-2 Harzsäule chromatographiert. Der N-Formimidoylthienamycinpivaloxymethylester wird als Feststoff isoliert, nachdem die Säule mit Tetrahydrofuran eluiert worden ist und nach Gefriertrocknung.

Beispiel 8 Herstellung von N-Acetimidoylthienamycin

Thienamycin (190 mg) wird in pH 7 0,1 n Phosphatpuffer (13 ml) gelöst und auf einem Eisbad unter magnetischem Rühren gekühlt. Die Lösung wird auf pH 8,5 unter Verwendung von 2,5n Natriumhydroxidlösung aus einer automatischen Burette eingestellt. Unter Aufrechterhaltung eines pHs von 8,5 wird Acetomidathydrochlorid (400 mg) portionsweise im Laufe von einigen Minuten hinzugegeben. Nach weiteren 40 Minuten wird die Lösung auf pH 7 2,5n Chlorwasserstoffsäure eingestellt. Die Lösung wird dann über Dowex® 50-X8 Harz chromatographiert (250 cm³, Na⁺-Zyklus. Teilchengröße 0,074-0,149 mm) und mit Wasser eluiert. Das N-Acetimidoylderivat eluiert in 1 bis 2 Säulenvolumina (240 bis 520 cm³) und wird gefriergetrocknet zu einem weißen Feststoff (88 mg).
UV (pH 7 0,1 n Phosphatpuffer) λ _max 297 nm (ε 7 620),
IR (Nujol mull) 1884 cm^-1, β-Lactam,
KMR (D₂O) δ 1,27 (d, J=6 Hz, CH₃-CH),

3,2-3,5 (m, -CH₂), 3,5-3,9 (m, -CH₂-),
4,2-4,6 (m; C_5H, C_6H, C_7H).

Beispiel 9 Herstellung von N′-tert.-Butyl-N-Formimidoylthienamycin

Thienamycin (105 mg) wird in pH 7 0,1 n Phosphatpuffer (5 ml) gelöst und dazu wird eine Lösung von Äthyl-N- tert.-butylformimidat (290 mg) in Tetrahydrofuran (1 ml) zugegeben. Der pH der Lösung wird eingestellt und aufrechterhalten auf 8,5 unter Verwendung einer automatischen Burette, welche 1 n NaOH ausgibt. Nach 30 Minuten wird der pH 2,5n HCl auf 7,0 eingestellt. Die Lösung wird chromatographiert über einer mit Eiswasser ummantelten Säule eines Dowes® 50-X4 Harzes (53 cm³, Na⁺-Zyklus, 0,037-0,074 mm Teilchengröße) und mit entionisiertem Wasser eluiert. Die Fraktionen, enthaltend das in der Überschrift angegebene Produkt, werden vereint und gefriergetrocknet.

Beispiel 10 Herstellung von N-Propionimidoylthienamycin

Thienamycin (114 mg) wird in pH 7 0,1 n Phosphatpuffer (10 ml) gelöst und der pH der Lösung wird auf 8,5 eingestellt unter Verwendung einer automatischen Burette, welche in 1 n NaOH ausgibt. Portionsweise wird dazu festes Äthylpropionimidathydrochlorid (231 mg) so schnell wie möglich zugegeben, wobei der pH aufrechterhalten wird nahe 8,5. Nach 30 Minuten wird der pH unter Verwendung von 2,5n HCl auf 7 eingestellt und die Lösung wird chromatographiert über einem Dowex® 50-X4 Harz (72-cm³, Na⁺-Zyklus, Teilchengröße 0,037-0,074 mm) und mit entionisiertem Wasser eluiert. Das N-Propionimidoylderivat eluiert im zweifachen Säulenvolumen und wird gefriergetrocknet unter Bildung eines weißen Feststoffes (76 mg). UV (pH 7 0,1 n Phosphatpuffer) λ _max 298 nm (ε 7 830), KMR (D₂O) δ 1,28 (d, J=6 Hz, CH₃CH(OH)), 1,23 (t, J=8 Hz, -CH₂-CH₃), 2,50 (q, J=8 Hz, CH₂CH₃).

Beispiel 10 Herstellung von N′-Methyl-N-formimidoylthienamycin

Thienamycin (140 mg) wird in pH 7 0,1n Phosphatpuffer (10 ml) gelöst und der pH der Lösung wird eingestellt auf 8,5 unter Verwendung einer automatischen Burette, welche 1 n NaOH ausgibt. Zu dieser Lösung wird Methyl-N-methyl formimidathydrochlorid (200 ml) gegeben, wobei der pH auf 8,5 gehalten wird. Nach 40 Minuten wird der pH eingestellt auf 7,0 unter Verwendung von 2,5n HCl und die Lösung wird chromatographiert über Dowex® 50-X4 Harz (72 cm³m, Na⁺-Zyklus, Teilchengröße 0,037-0,074 mm) und mit entionisiertem Wasser eluiert. Das N′-Methyl-N-formimidoylderivat eluiert im zweifachen Säulenvolumen und wird zu einem weißen Feststoff gefriergetrocknet (43 mg). UV (pH 7 0,1 n Phosphatpuffer) g _max 298 nm (ε 7 250), IR (Nujol Mull) 1765 cm^-1 (β-Lactam). KMR (D₂O) δ 1,29 (d, J=6 Hz, CH₃-CH), 2,92 (s, N-CH₃), 7,80 (s, N-CH).

Beispiel 12 1. Herstellung des Ausgangsmaterials Herstellung von Äthyl-N-benzylformimidat

Eine Lösung aus 690 mg (5,1 mMol) N-Benzylformamid in 5 ml Methylenchlorid wird auf einem Eis-Wasser Bad gekühlt und unter einen Argon-Schutz gestellt. Die Lösung wird gerührt während tropfenweise 4,9 ml (4,9 mMol) 1M Triäthyl oxoniumfluorborat in Methylenchlorid zugegeben werden. Nach 45minütiger Reaktionszeit wird die Mischung zur Trockne konzentriert unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur und der Rückstand wird unter vermindertem Druck über P₂O₅ getrocknet. Das kernmagnetische Resonanzspektrum des Produktes in Deuterochloroform stimmt vollständig überein mit dem Fluorboratätheratkomplex von Äthyl-N-benzylformimidat.

2. Herstellung von N′-Benzyl-N-formimidoylthienamycin

Thienamycin (110 mg) wird in pH 7 0,1 n Phosphatpuffer (7 ml) gelöst und der pH der Lösung wird auf 8,5 eingestellt unter Verwendung einer automatischen Burette, die 1 n NaOH ausgibt. Zu der gepufferten Lösung wird unter Aufrechterhaltung eines pHs von 8,5 eine Lösung von Äthyl-N- benzylformimidatfluorborat (572 mg) in p-Dioxan (2 ml) gegeben. Nach 20 Minuten wird der pH der Lösung unter Verwendung von 2,5n HCl auf 7,0 eingestellt und über einem Dowex® 50-X4 Harz chromatographiert (53 cm³, Na⁺- Zyklus, Teilchengröße 0,037-0,074 mm) und mit entionisiertem Wasser eluiert. Die Chromatographie wird in einer mit einem Wasser ummantelten Säule bei 3°C durchgeführt. Das N′-Benzyl-N- formimidoylderivat eluiert im zweifachen Säulenvolument und wird unter Ausbildung eines weißen Feststoff (5 mg) gefriergetrocknet. UV (pH 7 0,1 n Phosphatpuffer) λ _max 295 nm (ε 3 908), IR (Nujol Mull) 1765 cm^-1 (β-Lactam), KMR (D₂O) δ 1,29 (d, J=6 Hz, CH₃-CH), 4,44 (s, CH₂-Ar), 7,37 (s, Aryl), 8,14 (s, NCH).

Beispiel 13 1. Herstellung der Ausgangsmaterialien Herstellung von N-Isopropylformamid

Formamid (1,13 g, 0,98 ml) wird in 10 ml Toluol gelöst, welches Toluolsulfonsäure (4,7 g) enthält. Zu dieser Mischung wird Isopropylamin (2,95 g, 4,25 ml) gegeben. Die Mischung wird über Nacht unter Rückfluß und unter einem leichten Stickstoffstrom gehalten. Die Lösung wird filtriert und das Toluol verdampft unter vermindertem Druck. Das rückständige Öl wird destilliert bei 59-62°C/ 0,093 mbar, wobei man 1,0 g des gewünschten Produktes erhält.

Herstellung von Methyl-N-isopropylformimidat

Isopropylformamid (535 mg) wird mit der äquivalenten Menge Äthylchlorformat (440 µl) 2 bis 3 Stunden bei 40 bis 45°C unter Stickstoff behandelt. Die Mischung wird nacheinander mit Petroläther und wasserfreiem Äther und Benzol gewaschen, wobei man das Produkt als ein Öl erhält.

2. Herstellung von N′-Isopropyl-N-formimidoylthienamycin

Thienamycin (110 mg) wird in pH 7 0,1 n Phosphatpuffer (7 ml) gelöst und der pH der Lösung wird auf 8,5 eingestellt unter Verwendung einer automatischen Burette, die 1 n NaOH ausgibt. Zu der magnetisch gerührten gepufferten Lösung wird unter Aufrechterhaltung eines pHs von 8,5 eine Lösung von Methyl-N-isopropylformimidathydrochlorid (300 mg) in p-Dioxan (1 ml) gegeben. Nach 25 Minuten wird der pH der Lösung eingestellt auf 7,0 unter Verwendung von 2,5n NaOH und man chromatographiert über Dowex® 50-X4 Harz (53 cm³, Na⁺-Zyklus, Teilchengröße 0,037-0,074 mm) und eluiert mit entionisiertem Wasser. Die Chromatographie wird in einer Wasser ummantelten Säule bei 3°C durchgeführt. Das N′- Isopropyl-N-formimidoylderivat eluiert in 2 Säulen Volumina und wird gefriergetrocknet unter Bildung eines weißen Feststoffes (12 mg). UV (pH 7 0,1 n Phosphatpuffer) λ _max 299 nm (ε 8 130), IR (Nujol mull) 1760 cm^-1 (β-Lactam), KMR (D₂O) δ 1,26 (d, J=6 Hz, CH₃CH(OH)), 1,29 (d, H=6 Hz, CH(CH₃)₃), 7,89 (s, NHCH), 7,96 (s, NHCH).

Beispiel 14 Herstellung von N-Isobutyrimidoylthienamycin

Arbeitet man nach dem Verfahren von Beispiel 12, ersetzt aber Äthylacetimidathydrochlorid durch Isobutyrimidathydrochlorid und läßt die Umsetzung bei 20°C und pH 8,2 ablaufen, so erhält man N-Isobutyrimidoylthienamycin (14%).
UV (pH 7 0,1 n Phosphatpuffer) λ _max 298 nm (ε 8 290),
KMR (D₂O) S 1,27 (d, J=7 Hz, CH(CH₃)₂, 1,29 (d, J=6 Hz, CH₃CH(OH), 2,79 (Heptett, J=7 Hz, CH(CH₃)₂).

Beispiel 15 Herstellung von N′-Methyl-N-acetimidoylthienamycin

Arbeitet man nach dem Verfahren von Beispiel 12, ersetzt aber Äthylacetimidathydrochlorid durch Methyl-N-methylacetimidat, so erhält man N-Methyl-N′-acetimidoylthienamycin (10%).
UV (pH 7 0,1 n Phosphatpuffer) λ _max 289 nm (ε 6 700),
IR (Nujol mull) 1750 cm^-1 (β-Lactam), 1660 cm^-1 (C=NCH₃),
KMR (D₂O) δ 1,27 (d, J=6 Hz, CH₃CH(OH)) 2,22 und 2,25

2,97 (S, NCH₃).

Beispiel 16 Herstellung von N′-Methyl-N-formimidoylthienamycin

Arbeitet man nach dem Verfahren von Beispiel 12, ersetzt aber Äthylacetimidathydrochlorid durch Äthyl-N-methylformimidathydrochlorid, so erhält man N′-Methyl-N-form imidoylthienamycin (10%).
UV (pH 7 0,1 n Phosphatpuffer) λ _max 298 nm,
KMR (D₂O) S 1,30 (d, J=6 Hz, CH₃ CH(OH)), 2,92, (S, N-CH₃),

Beispiel 17 Herstellung von N-[N′-Äthylformimidoyl]-thienamycin

Thienamycin (100 mg) in 10 ml 0,1 m pH 7,0 Phosphatpuffer wird mittels 2,5n Natriumhydroxid auf den pH 8,5 bis 9,0 eingestellt und aufrechterhalten. Zu dieser Lösung werden 300 mg Äthyl-N-äthylformimidat-hydrochlorid gegeben. Die Mischung wird 20 Minuten bei 23°C gerührt und dann auf den pH 7,0 mit 2,5n HCl neutralisiert und über einer Dowex® 50-X8 (Natrium-Form) Ionenaustauschsäule (38,1 mm-254 mm) chromatographiert. Die Säule wird mit Wasser eluiert, wobei man 6,7-ml-Fraktionen gewinnt. Die Fraktionen 40-90 werden vereint, konzentriert und gefriergetrocknet, wobei man 15 mg eines festen Produktes erhält. Durch Elektrophorese des Produktes bei 50 V/cm während 20 Minuten in 0,1 m pH 7,0 Phosphatpuffer stellt man eine einzelne bio-aktive Zone dar, die sich 2 mm in Richtung auf die Kathode bewegt.
UV λ 301 nm; KMR (100 MH₂, D₂O); δ 7,77 (S) und 7,82 (S) (Formimidoyl CH).

Beispiel 18

Arbeitet man nach der Verfahrensweise, wie sie im vorhergehenden Text und in den Beispielen beschrieben wurde, so können die folgenden Verbindungen der Erfindung erhalten werden. Die Reagentien, Imidoäther und Imidohalogenide, die für die Umsetzung mit Thienamycin oder einem Derivat davon verwendet werden für die Herstellung der nachstehend aufgeführten Verbindungen, sind entweder bekannt oder können in der vorher beschriebenen Weise hergestellt werden.

Beispiel 19 Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen

Eine solche Einzeldosierungsform besteht darin, daß man 120 mg von N-Acetimidoylthienamycin (Produkt von Beispiel 7) mit 20 mg Lactose und 5 mg Magnesiumstearat mischt und die 145 g Mischung in eine Gelatinekapsel füllt. In gleicher Weise kann man durch Verwendung von mehr an aktivem Bestandteil und weniger Lactose andere Dosierungsformen in Gelatinekapseln füllen. Erforderlichenfalls kann man mehr als 145 mg an Bestandteilen zusammen vermischen und größere Kapseln oder komprimierte Tabletten und Pillen herstellen. Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen:

Tabletten
pro Tablette
N-Acetimidoyl-thienamycin\|125 mg
Maisstärke, U. S. P.	6 mg
Dicalciumphosphat	192 mg
Lactose, U. S. P.	190 mg

Der aktive Bestandteil wird vermischt mit Dicalciumphosphat, Lactose und etwa der Hälfte der Maisstärke. Die Mischung wird dann granuliert mit 15% der Maisstärkepaste (6 mg) und grob gesiebt. Sie wird dann bei 45°C getrocknet und wiederum durch ein Sieb gesiebt. Der Rest an Maisstärke und Magnesiumstearat wird zugegeben und die Mischung wird zu Tabletten verpreßt, die annähernd 1,2 cm Durchmesser haben und jeweils 800 mg wiegen.

Parenterale Lösung
Ampuule
N-Aetimidoyl-thienamycin	500 mg
steriles Wasser	2 ml

Ophthalmische Lösung
N-Acetimidoyl-thienamycin\|100 mg
Hydroxypropylmethylcellulose	5 mg
steriles Wasser	bis zu 1 ml

Ohren-Lösung
N-Acetimidoyl-thienamycin\|100 mg
Benzalkoniumchlorid	0,1 mg
steriles Wasser	bis zu 1 ml

Topische Salbe
N-Acetylimidoyl-thienamycin\|100 mg
Polyäthylenglykol 4000 U. S. P.	400 mg
Polyäthylenglykol 400 U. S. P.	1,0 g

Die aktiven Bestandteile der obengenannten Formulierungen können allein oder in Kombination mit anderen biologisch aktiven Bestandteilen verabreicht werden, beispielsweise mit anderen antibakteriellen Mitteln, wie Lincomycin, einem Penicillin, Streptomycin, Novobiocin, Gentamicin, Neomycin, Colistin und Kanamycin oder mit anderen therapeutischen Mitteln, wie Probenecid.

Vergleichsversuche (nachgereicht am 16. Dezember 1985 und 27. Januar 1988)

Die nachveröffentlichte Literaturstelle "Antimicrobial Agents and Chemotherapy, June 1982, p. 1016-1022" zeigt, daß das erfindungsgemäße Antibiotikum N-Formimidoylthienamycin (Beispiel 2) zahlreichen handelsüblichen Antibiotika überlegen ist. Die folgende Wirksamkeitstabelle zeigt, daß die dort getesteten erfindungsgemäßen Verbindungen auch im Vergleich mit Thienamycin gegenüber verschiedenen Mikroorganismen eine bessere Wirksamkeit besitzen.

Herstellung der Ausgangsmaterialien

Außer Thienamycin ist es für den Fachmann ersichtlich, daß dessen verschiedene Isomere allein oder als Mischungen als Ausgangsstoffe bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können. Einige dieser Isomeren sind aus natürlichen Produkten der Fermentation erhältlich (siehe unten). Durch Totalsynthese werden jedoch alle Isomere erhältlich (siehe unten) in Form einer Mischung von 4 Diastereoisomeren, welche bacterizide Aktivität aufweisen und die nach üblichen technischen Verfahren aufgetrennt werden können. Die 4 Diastereoisomere (2 cis, 2 trans) können chromatographisch getrennt werden. Die Auftrennung von jeweils einem gegebenen d/1 Paar mit optisch aktiven Säuren oder Basen läuft nach üblichen Verfahren ab. Dabei soll festgehalten werden, daß die absolute Konfiguration des zuerst identifizierten Ausgangsmaterials (I) 5R 6S 8R ist.

Herstellung von Thienamycin durch Totalsynthese Stufe A Herstellung von 4-(2-Acetoxyvinyl)-azetidin-2-on

Eine Lösung aus 1,0 ml destilliertem Chlorsulfonylisocyanat (1,65 g, 11,7 mMol) in 2,5 ml wasserfreiem Diäthyläther wird unter N₂ in einem Bad von -20°C gekühlt.

Eine Lösung von 2,5 g L-Acetoxybutadien (22 mMol) in 2,5 ml wasserfreiem Äther wird ähnlich gekühlt unter Stickstoff in einem -20°C Bad.

Die Chlorsulfonylisocyanatlösung wird tropfenweise zu der Acetoxybutadienlösung hinzugegeben mittels eines in die CSI-Lösung eintauchenden Polytetrafluoräthylenrohres und wird mit N₂ unter Druck gesetzt. Die Zugabe dauert 10 Minuten. Wenig oder keine Farbe ist erkennbar und die Reaktion wird 0,5 Stunden bei -20°C gerührt. Die Lösung ist klar und hat eine hellgelbe Farbe.

Eine Lösung aus 2 g Natriumsulfit und 5 g K₂HPO₄ in 20 ml H₂O wird hergestellt während der vorerwähnten 0,5 Stunden Reaktionszeit und auf einem Eisbad gekühlt; 20 ml Äther werden zu der Mischung unter heftigem Rühren auf einem Eisbad hinzugegeben. Nach Ende der 30minütigen Reaktionszeit wird das Reaktionsgemisch, wiederum unter Anwendung von N₂-Druck und einem Polytetrafluoräthylenrohr aus dem Reaktionskolben, der in einem Bad von -20°C gehalten wird, zu der heftig gerührten Hydrolysemischung überführt. Die schnelle, tropfenweise Zugabe ist nach 5 Minuten beendet. Man läßt die Hydrolyse weitere 5 Minuten stattfinden. Die Hydrolysemischung hat einen pH von 6-8, vorzugsweise pH 8.

Die Phasen werden getrennt, wobei ein gelb-oranges Harz in der wäßrigen Phase verbleibt. Die Ätherphase wird direkt über MgSO₄ getrocknet. Die wäßrige Harzphase wird dreimal mit 50-ml-Anteilen Äther extrahiert, wobei jeder Anteil zu der Ausgangs-Äther/MgSO₄-Mischung gegeben wird.

Die getrockneten Extrakte werden filtriert und unter einem N₂-Strom auf 5 ml konzentriert; ein Teil des Produktes ist kristallisiert in diesem Stadium.

Man stellt eine Säule aus 10 g Kieselgel, gepackt in Äther, her und das Ätherkonzentrat wird obenauf gegeben und durchlaufen gelassen. Der im Kolben enthaltene Rückstand wird dreimal mit 2 ml Äther gespült, jedesmal abpipettiert und auf die Säule gegeben. Dann wird mit Äther eluiert.

Die ersten 25 ml sind hauptsächlich Leervolumen. Die nächsten 5 10-ml-Fraktionen werden gesammelt und anschließend daran 3 50-ml-Fraktionen und alle werden unter einem N₂-Strom im Volumen vermindert. Das Produkt kristallisiert aus den Fraktionen 4 bis 6 mit Spuren in 3 und 7. Die Fraktionen 1 bis 3 enthalten ein gelbliches, scharf-riechendes Material, das beim Stehen harzförmig wird. Ausbeute: 100 mg als Mischung aus den cis- und trans- Isomeren.

Stufe B Herstellung von 4-(2-Acetoxyäthyl)-2-acetidinon

Eine Lösung von 4-(2-Acetoxyvinyl)-2-azetidinon (10,0 g 0,065 Mol) in 200 ml Äthylacetat, enthaltend 100 mg eines 10% Palladium/C-Katalysators, wird in einem Schüttler hydriert bei 25°C unter einem Druck von 2,8 kg/cm² im Laufe von 15 Minuten. Die Mischung wird durch ein Bett aus Supercel filtriert und mit zusätzlichem Äthylacetat gewaschen. Das vereinte Filtrat wird im Vakuum gewaschen, wobei man als kristallinen Feststoff 4-(2-Acetoxyäthyl)-2- azetidinon (10,0 g) erhält. Beim Umkristallisieren aus Äther erhält man weiße Kristalle: F. 44 bis 47°C; IR (CHCl₃)_μ 5,66, 5,74; KMR (CDCl₃) τ 3,44 (breites s, 1, NH), 5,82 (m, 2, CH₂OCOCH₃), 6,29 (m, 1, C-4H, 6,87 (1/2 AB Muster wird weiterhin vierfach aufgeteilt durch C-4H und NH, 1 J_gem=12,8 Hz, J=4,5 H H_NH=1,9 Hz, 7,38 (1/2 AB Muster wird weiterhin vierfach aufgeteilt durch C-4H und NH, 1 J_gem=12,8 Hz, J=2,3 Hz, J_NH=1,0 Hz). 7,93 und 8,02 (s an m, total 5, OCOCH₃ und CH₂CH₂OCOCH₃, entsprechend).

Stufe C Herstellung von 4-(2-Hydroxyäthyl)-2-azetidinon

Unter Stickstoff bei 0°C wird eine Lösung aus 4-(2- Acetoxyäthyl)-2-azetidinon (2,24 g 0,014 Mol) in 25 ml wasserfreiem Methanol mit einer Lösung von Natriummethylat (77 mg, 1,4 mMol) in 5 ml wasserfreiem Methanol behandelt. Nach einstündigem Rühren wird die Lösung mit Eisessig neutralisiert. Die Entfernung des Methanols im Vakuum ergibt, das rohe 4-(2-Hydroxyäthyl)-2-azetidinon als ein Öl. Das Produkt wird chromatographisch über Kieselgel gereinigt, indem man es mit 10% Methanol/CHCl₃ eluiert, wobei man 1,55 g des Alkohols erhält: F. 50°C; IR (CHCl₃)_µ 5,67; KMR (CDCl₃) τ 3,20 (breites s, 1, NH), 6,24 und 6,28 (m an t, total 3, C-4H und CH₂ OH entsprechend), 6,90 (breites s an 1/2 AB Muster spaltet weiter auf in vier durch C-4H und NH, total 2, OH und C-3H entsprechend, J_gem=13,0 Hz, J_vic=4,2 Hz, J_NH=1,6 Hz), 7,42 (1/2 AB Muster spaltet weiter auf in vier durch C-4H und NH, 1, C-3H J_gem=13,0 Hz, J_vic=2,2 Hz, J_NH=1,1 Hz), 816 (m, 2, CH₂CH₂OH).

Stufe D Herstellung von 8-Oxo-2,2-dimethyl-3-oxa-1-azabicyclo- [4,2,0]-octan

Eine Lösung aus 4-(2-Hydroxyäthyl)-2-azetidinon (1,87 g, 0,016 Mol) und 2,2-Dimethoxypropan (1,69 g, 0,016 Mol) in 25 ml wasserfreiem Methylenchlorid wird mit Bortrifluordiätherat (0,201 ml, 0,002 Mol) bei 25°C behandelt. Die erhaltene Lösung wird 10 Miunten gerührt. Beim Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhält man ein Öl (2,5 g). Die Chromatographie des Rohproduktes über einer Kieselgelsäule unter Verwendung von 2 : 1 Äthylacetat/ Benzol als Eluierungsmittel ergibt 8-Oxo-2,2-dimethyl- 3-oxa-1-azabicyclo-[4,2,0]-octan (1,59 g) als kristallinen Feststoff. Beim Umkristallisieren aus Äther/ Hexan erhält man ein Produkt mit dem F. 60 bis 61°C.
IR (CHCl₃)_µ: 5,73 (β-Lactam).
KMR (CDCL₃) _τ:
6,02-6,28, m, 2H, C-4 Methylen
6,22-6,62, m, 1H, C-6 Methin
6,90, dd, 1H, J_7,7=14 Hz, J_6,7=4,5 Hz
C-7 Proton cis bis C-6H
7,47, dd, 1H, J_7,7=14 Hz, J_6,7=2 Hz
C-7 Proton trans bis D-6H
7,82-8,68, m, 2H, C-5 Methylen
8,23, s 3H (C-2 Methyl)
8,57, s, 3H (C-2 Methyl)

Stufe E Herstellung von 8-Oxo-2,2-dimethyl-7α- und β-(1-hydroxyäthyl)- (3-oxa-1-azabicyclo-[4,2,0]-octan

Zu einer Lösung aus 1,1 Äquivalenten von frisch hergestelltem Lithiumdiisopropylamid in wasserfreiem Tetrahydrofuran unter einer Stickstoffatmosphäre bei -78°C wird eine Lösung aus 8-Oxo-2,2-dimethyl-3-oxa-1-azabicyclo-[4,2,0]-octan in wasserfreiem Tetrahydrofuran, das auf -78°C gekühlt worden ist, zugegeben. Nach 2 Minuten wird das erhaltene Lithiumenolat mit überschüssigem Acetaldehyd behandelt. Die Lösung wird 30 Minuten bei -78°C gerührt und dann in Wasser gegossen. Die wäßrige Phase wird mit Natriumchlorid gesättigt und mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatlösungen werden über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man das rohe Produkt erhält. Durch Reinigung mittels Chromatographie über Kieselgel unter Verwendung von Äthylacetat/Benzol erhält man 8-Oxo-2,2-dimethyl- 7α- und b-(1-hydroxyäthyl)-3-oxa-1-azabicyclo- [4,2,0]-octan.

Daten für 8-Oxo-2,2-dimethyl-7β-(1-hydroxyäthyl)-3-oxa- 1-azabicyclo-[4,2,0]-octan:
IR (CH₂Cl₂)_µ: 5,72 µ (b-Lactam),
KMR (CDCl₃)_τ : 5,53-6,43, m, 4H, C-4 Methyl 48468 00070 552 001000280000000200012000285914835700040 0002002652679 00004 48349en+ C-6 Methin+C-9 Methin
6,90, dd auf breitem s, 2H, J_7,9=9 Hz,
J_6,7 = 5,5 Hz, C-7 Methin + OH
7,70 - 8,83, m, 2H, C-5 Methylen
8,27, s, 3H (C-2 Methyl)
8,60, s, 3H (C-2 Methyl)
8,78, d, 3H, J_9,10 = 6,5 Hz, C-10 Methyl

Daten für 8-Oxo-2,2-dimethyl-7α-(1-hydroxyäthyl)-3-oxa-1- azabicyclo-[4,2,0]-octan:
IR (CHCl₃)_µ : 2,9 breites O-H, 5,73 β-Lactam
KMR (Aceton - d₆)δ:
4,23 - 3,33, m, C-9 Methin + C-4 Methylen + C-6 Methin
3,33, breites s, OH
2,83, dd, J = 2 Hz, 6 Hz, (C-7 Methin)
2,67, dd, J = 2 Hz, 8 Hz, (C-7 Methin)
1,93 - 1,63, m, C-5 Methylen
1,63, s, (C-2 Methyl)
1,40, s, (C-2 Methyl)
1,23, d, J = 6,5 Hz, C-10 Methyl

Stufe F Herstellung von 8-Oxo-2,2-dimethyl-7α-(1-p-nitrobenzyl carbonyldioxyäthyl)-3-oxa-1-azabicyclo-[4,2,0]-octan

Unter wasserfreien Bedingungen wird eine Lösung aus 8-Oxo-2,2-dimethyl-7α-(1-hydroxyäthyl-3-oxa-1-azabicyclo- [4,2,0]-octan (60 mg, 0,302 mMol) in 0,6 ml Äther mit pulverisiertem Kaliumhydroxid (19 mg, 0,332 mMol) behandelt. Nach 15 Minuten wird p-Nitrobenzylchlorformiat (65 mg, 0,302 mMol) zu der Reaktionsmischung gegeben. Man rührt weitere 15 Stunden bei 25°C. Die Mischung wird aufgeteilt zwischen 1 m pH 7 Phosphatpuffer und weiterem Äther. Die Ätherphase wird mit Wasser und Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Beim Abdampfen des Filtrates unter vermindertem Druck erhält man 67 mg eines farblosen Öls. Reinigung durch präparative Dickschicht- Chromatographie über Kieselgel und Entwickeln mit 1 : 9 Äthylacetat/Benzol ergibt 8-Oxo-2,2-dimethyl-7α-(1-p- nitrobenzylcarbonyloxyäthyl)-3-oxa-azabicyclo-[4,2,0]- octan (40 mg) als Mischung der Diastereomeren.
IR (CH₂Cl₂)_µ: 5,68 (β-Lactam und Carbonat), 6,19 und 6,54 (Nitro).
KMR (CDCl₃):
1,67, d, 2H, ArH
2,37, d, 2H, ArH
4,67, s, 2H, ArCH₂
4,67 - 5,22, m, CH₃CH
5,98 - 6,25, m, 2H, C-4 Methylen
6,25 - 6,62, m, 1H, C-6 Methin
7,75 - 8,83, m, 2H, C-5 Methylen
8,22, s, 3H, C-2 Methyl
8,50 - 8,59, m, 5H, C-2 Methyl + CH₃CH

Die 7β-Diastereoisomeren oder die 7α- und 7β-Mischungen werden in analoger Weise erhalten.

Stufe G Herstellung von Cis- und Trans-3-(1-p-Nitrobenzylcarbonyl- dioxyäthyl)-4-(2-hydroxyäthyl)-2-azetidinon

8-Oxo-3-oxa-2,2-dimethyl-7α-(1-p-nitrobenzylcarbonyl- dioxyäthyl)-1-azabicyclo-[4,2,0]-octan (1,0 g) wird in 8 ml Essigsäure und 2 ml Wasser gelöst und 1,25 Stunden auf 65°C erhitzt. Die Essigsäure und das Wasser werden unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wird aufgenommen in Benzol und eingedampft, wobei man Trans-3- (1-p-Nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-(2-hydroxyäthyl)-2- azetidinon als Mischung der Diastereoisomeren erhält.
IR (CH₂Cl₂)_µ: 5,67 (β-Lactam), 5,72 Schulter, 6,20 und 6,57 (Nitro),
KMR (CDCl₃):
1,73, d, 2H, H = 8,5 Hz, ArH
2,43, d, 2H, J = 8,5 Hz, ArH
3,63, breites s, 1H, NH
4,37 - 5,13, m, 1H, CH₃CH
4,72, s, 2H, ArCH₂
6, 07 - 6,53, m, 1H, C-4 Methin
6,23, t, 2H, J = 5,5 Hz, CH₂OH
6,73 - 6,93, m, 1H, C-3 Methin
7,63 - 8,97, m, 3H, CH₂CH₂OH
8,53, d, J = 6,5 Hz, CH₃CH

Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

Stufen D′, E′, F′ und G′ als Alternative zu den Stufen D, E, F und G für die Herstellung von 3-(1-p-Nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)- 4-(2-hydroxyäthyl)-azetidinon Stufen D′, E′, F′ und G′ Herstellung von 1-(2-Tetrahydropyranyl)-4-[2-tetrahydropyranyl)- oxyäthyl]-2-azetidinon

Unter Stickstoff und bei 25°C wird eine Lösung aus 4-(2-Hydroxyäthyl)-2-azetidinon (62 mg, 0,539 mMol) in 0,5 ml wasserfreiem p-Dioxan mit 2,3Dihydropyran (0,98 ml, 1,08 mMol) und p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (19 mg, 0,10 mMol) behandelt. Die erhaltene Lösung wird während 60 Minuten gerührt und dann zwischen 10 ml eines 0,5 m pH 7 Phosphatpuffers und 10 ml Äthylacetat geteilt. Die wäßrige Phase wird ein zweites Mal mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatlösungen werden mit Salzwasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man 216 mg des Rohproduktes erhält. Reinigung durch präparative Dicksicht-Chromatographie und Entwickeln mit Äthylacetat ergibt 80 mg 1-(2-Tetrahydropyranyl)- 4-[2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl]-2-azetidinon als ein Öl.
KMR (CDCl₃)_τ:
5,13 - 5,60, m, OCH
5,83 - 6,85, m, C-4H + OCH₂
6,95, dd, J = 5 Hz und 15 Hz (C-3 Methylen)
7,35, dd, J = 3 Hz und 15 Hz (C-3 Methylen)
7,62 - 8,95, m, CHCH₂CH₂CH₂CH₂ + CHCH₂CH₂O

Herstellung von Cis- und Trans-1-(2-Tetrahydropyranyl)-3- (1-hydroxyäthyl-4-[2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl]-2- azetidinon

Arbeitet man in der für die Herstellung von 8-Oxo-2,2-dimethyl- 7α- und β-(1-hydroxyäthyl)-3-oxa-1-azabicyclo- [4,2,0]-octan aus 8-Oxo-2,2-dimethyl-3-oxa-1-azabicyclo- [4,2,0]-octan beschriebenen Weise und verwendet 1-(2-Tetrahydropyranyl)- 4-[2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl]-2- acetidinon, so erhält man eine diastereomere Mischung von sowohl Cis- und Trans-1-(2-Tetrahydropyranyl)-3-(1-hydroxyäthyl)- 4-[2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl]-2-azetidinon.

Herstellung von Cis- und Trans-1-(2-Tetrahydropyranyl)-3- (1-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-[2-(2-tetrahydropyranyl)- oxyäthyl]-2-azetidinon

Arbeitet man wie bei der Herstellung von 8-Oxo-2,2- dimethyl-7α-(1-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-8-oxa-1- azabicyclo-[4,2,0]-octan aus 8-Oxo-2,2-dimethyl-7-(1- hydroxyäthyl)-3-oxa-1-azabicyclo-[4,2,0]-octan und verwendet Trans-1-(2-Tetrahydropyranyl)-3-(1-hydroxyäthyl-4- [2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl]-2-azetidinon, so erhält man Trans-1-(2-Tetrahydropyranyl)-3-(1-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-- 4-[2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl]-2-azetidinon. Das Cis-Diastereoisomere wird in analoger Weise erhalten.

Herstellung von Cis- und Trans-3-(1-p-nitrobenzyl carbonyldioxyäthyl)-4-(2-hydroxyäthyl)-2-azetidinon

Eine Lösung aus Trans-1(2-tetrahydropyranyl)-3-(1-p- nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-[2-(2-tetrahydropyranyl)- oxyäthyl]-2-azetidinon in Methanol bei 25°C wird mit einem 0,1 molaren Äquivalent von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat behandelt. Die Lösung wird 2 Stunden gerührt und dann mit 1 m pH 7 Phosphatpuffer neutralisiert. Das Produkt wird in Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatlösung wird mit Salzwasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man Trans-3-(1-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)- 4-(2-hydroxyäthyl)2-azetidinon erhält. Das Cis-Diastereoisomere wird in analoger Weise erhalten.

Stufe H Herstellung von Cis- und Trans-3-(1-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)- 4-[2,2-bis-(2-hydroxyäthyl)-thioäthyl]-2- azetidinon

Unter Stickstoff bei 25°C wird eine Mischung aus wasserfreiem Pyridin (0,146 ml, 1,81 mMol) und wasserfreiem, gepulvertem Chromtrioxid (92 mg, 0,916 mMol) in 8 ml wasserfreiem Acetonitril 30 Minunten gerührt. Zu der erhaltenen dunkelbraunen Lösung werden 250 mg trockenes Supercel gegeben und anschließend daran eine Lösung von Trans-3-(1-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-(2-hydroxyäthyl)- 2-azetidinon (186 mg, 0,550 mMol) in 1 ml wasserfreiem Acetonitril. Nach einstündigem Rühren wird das Reaktionsgemisch durch ein gemischtes gepacktes Bett aus 2 g von jeweils Kieselgel und Magnesiumsulfat filtriert.

Das Bett wird wiederholt gewaschen mit insgesamt 30 ml zusätzlichem Acetonitril. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck bei 25°C auf ein Volumen von 3 ml konzentriert. Durch Dünnschicht-Chromatographie (Kieselgel; Äthylacetat/Benzol 2 : 1) wird festgestellt, daß diese Lösung ein Produkt enthält (R_f=0,38), das weniger polar ist als das Ausgangsmaterial (R_f=0,21).

Die Acetonitrillösung von Trans-3-(1-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)- 4-(2-oxoäthyl)-2-azetidinon, die wie oben hergestellt worden ist, wird unter Stickstoff bei 0°C mit 2- Mercaptoäthanol (0,386 ml, 5,5 mMol) behandelt und unmittelbar darauf mit Bortrifluorid-ätherat (0,176 ml, 1,43 mMol). Nach 15minütigem Rühren wird diese Lösung geteilt zwischen wäßrigem Dikaliumhydrogenphosphat (1,5 g in 4 ml Wasser) und 12 ml Äthylacetat. Die wäßrige Phase wird ein zweites Mal mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatlösungen werden mit Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man 229 mg eines Öls erhält. Das Produkt wird durch präparative Dickschichtchromatographie über Kieselgel gereinigt und mit Äthylacetat entwickelt, wobei man 118 mg Trans-3-(1-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)- 4-[2,2-bis-(2-hydroxyäthyl)-thioäthyl)]-2-azetidinon als ein farbloses Öl erhält.
IR (CH₂Cl₂)_µ: 5,75 (5,79 Schulter) β-Lactam und Carbonat, 6,20, 6,55 Nitro,
KMR (Aceton-d₆)_τ:
1,70, d. J = 8,5 Hz, 2H, ArH
2,28, d, J = 8,5 Hz, 2H, ArH
2,48-2,88, m, 1H, NH
4,63, s, ArCH₂ (3H)
4,63 - 5,12, m, CH₃CH (3H)

5,80 - 7,45 m, C-4H + C-3H + SCH₂CH₂OH (13H)
7,63 - 8,33, m, 2H, CH₂CH
8,53, d, J = 6,5 Hz 3H, CH₃CH

Die Cis-Diastereoisomeren werden in analoger Weise hergestellt. Alternativ werden die gemischten Diastereoisomeren erhalten, wenn man als Ausgangsmaterial eine Mischung der Diastereoisomeren verwendet.

Stufe I Herstellung von Trans-3-(1-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)- 4-[2,2-bis-(2-azidoäthyl)-thioäthyl]-2-azetidinon

Zu einer Lösung aus 211 mg (Molgewicht=474; 0,445 mMol) Trans-3-(1-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-[2,2-bis-(2- hydroxyäthyl)-thioäthyl]-2-azetidinon in 5 ml Tetrahydrofuran (THF) (von Lithiumaluminiumhydrid abdestilliert) bei 0°C werden 103 mg Mesylchlorid (Molgewicht=114; 0,904 mMol) in 1 ml Tetrahydrofuran gegeben und unmittelbar darauf 134 µl Triäthylamin (Molgewicht 101; ρ=0,729; 0,967 mMol). Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde unter N₂ gerührt. Das Triäthylamin-hydrochlorid wird unter N₂ filtriert und mit einigen ml zusätzlichem THF gewaschen. Das klare farblose Filtrat wird unter einem Strom von N₂ konzentriert und anschließend im Hochvakuum 10 Minuten gepumpt. Das Dimesylat wird unmittelbar darauf aufgelöst in 5 ml DMSO (von CaH₂ bei 10,6 mbar abdestilliert und gelagert über einem 4A Molekularsieb) in Gegenwart von 347 mg NaN₃ (Molgewicht=65; 5,34 mMol). Nach Rühren über Nacht und unter N₂ werden 10 ml H₂O und 20 ml Äthylacetat (EA) zugegeben. Die Schichten werden getrennt und die wäßrige Schicht wird dreimal mit 10 ml EA gewaschen, wobei jede organische Schicht noch einmal gewaschen wird mit 10 ml H₂O und 10 ml Salzlösung. Die vereinten Äthylacetatschichten werden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert und unter einem N₂-Strom konzentriert, wobei man das rohe Diazid erhält. Durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel erhält man Trans-3-(1-p- nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-[2,2-bis-(2-azidoäthyl)- thioäthyl]-2-azetidinon. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung werden in analoger Weise erhalten.

Stufe J

Eine frisch zubereitete (H. Davies und M. Schwarz, J. O. C., 30, 1242 (1965)) Lösung aus p-Nitrophenyldiazomethan (29 mMol) in 150 ml Äther wird unter Rühren zu einer Lösung aus 1,0 g Oxomalonsäuremonohydrat (Molgewicht= 136; 7,35 mMol) in 50 ml Äthylacetat (EA) bei 0°C gegeben. Nach 2 1/2 Stunden wird die gelbe Lösung auf einem Rotationsverdampfer unter schwachem Erhitzen auf ungefähr das halbe Volumen konzentriert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und wie oben beschrieben, zu einem Öl konzentriert. Zu dem rohen p-Nitrobenzylester in 50 ml Toluol (Tol.) gibt man 3,54 mg Trans-3-(1-p-Nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-[2,2-bis- (2-azidoäthyl)-thioäthyl]-2-azetidinon (Molgewicht=524; 6,75 mMol). Das Reaktionsgemisch wird unter Rühren erhitzt auf einem Ölbad, wobei man ungefähr 1/3 des Toluols abdestillieren läßt. Toluol (getrocknet über einem 3A 1,59 mm Molekulargewicht) wird wiederum zugegeben, um das Volumen auf 50 ml aufzufüllen und der Azeo-Trocknungsprozeß wird dreimal wiederholt. Die Lösung wird dann unter N₂ eine Stunde rückflußbehandelt und der Azeo- Trocknungsprozeß wird ein letztes Mal wiederholt und die Rückflußbehandlung wird eine weitere Stunde fortgesetzt. Beim Konzentrieren der erhaltenen Lösung unter einem Strom von N₂ erhält man rohes 1. Das Rohmaterial wird chromatographiert über Kieselgel, wobei man 1 erhält. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

Stufe K

Zu einer Lösung aus 2,80 g 1 (Molgewicht=912; 3,07 mMol) in 35 ml THF (von Lithiumaluminiumhydrid abdestilliert) bei -20°C werden 0,3 ml Pyridin (Molgewicht=79; ρ=0,982; 3,73 mMol) (von NaH abdestilliert und gelagert über einem 4A Molekularsieb) gegeben. Unter Rühren unter N₂ werden tropfenweise 0,438 g Thionylchlorid (Molgewicht= 119; 3,68 mMol) in 1 ml THF zugegeben. Die Reaktionsmischung wird unter N₂ 5 Minuten bei -20°C gerührt und dann 1/2 Stunde bei 0°C und schließlich 1 Stunde bei 25°C. Das Pyridinhydrochlorid wird unter N₂ abfiltriert und zweimal mit Benzol (getrocknet über einem 3A 1,59 mm Molekularsieb) gewaschen. Die vereinten Filtrate und Waschlösungen werden unter einem N₂-Strom konzentriert, in einem geringen Volumen Benzol mit wasserfreiem MgSO₄ aufgeschlämmt, unter N₂ filtriert und dann unter einem N₂-Strom konzentriert. Beim Pumpen unter Hochvakuum während 1/2 Stunde erhält man ein Öl. Zu dieser frisch zubereiteten Chlorverbindung gibt man unter Rühren 0,885 g Triphenylphosphin (Molgewicht=262; 3,38 mMol) in 66 ml 9 : 1 Dimethylformamid (DMF)/H₂O und anschließend 550 mg K₂HPO₄ (Molgewicht=174; 3,16 mMol). Das Reaktionsgemisch wird 35 Minuten bei 25°C gerührt. Nach Verdünnen mit EA und Kochsalzlösung werden die Schichten getrennt und die wäßrige Schicht wird dreimal mit EA extrahiert. Die vereinten EA-Schichten werden mit Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter einem N₂-Strom konzentriert, wobei man rohes 2 erhält. Das Material wird über Kieselgel chromatographiert, wobei man 2 erhält. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

Stufe L

Zu 7,8 ml Pentan (getrocknet über einem 4A Molekularsieb) werden 0,2 ml Br₂ (Molgewicht=160; ρ=3,12; 3,9 mMol) gegeben. Zu einer Lösung aus 950 mg 2 (Molgewicht=896; 1,06 mMol) in 15 ml Diäthyläther (getrocknet über einem 3A 1,59 mm Molekularsieb) gibt man bei 0°C und unter N₂ unter Rühren tropfenweise 2,3 ml der obigen 0,49m Br₂- Lösung (1,13 mMol). Nach 10minütigem Rühren bei 0°C werden 114 µl Cyclohexen (Molgewicht=82, ρ=0,81; 1,13 mMol) zugegeben. Nach 5 Minuten bei 0°C werden 53 mg 57%iges NaH (57% von 53 mg=30,2 mg, Molgewicht 24, 1,26 mMol) in Mineralöl zu der gerührten Reaktionsmischung gegeben. Darauf unmittelbar gibt man 14 ml eiskaltes DMF (von wasserfreiem CaSO₄ bei 53,2 mbar abdestilliert und gelagert über einem 4A Molekularsieb). Das Rühren wird unter N₂ bei 0°C 3 Stunden fortgeführt. Das Reaktionsgemisch wird auf eine gerührte eiskalte Mischung aus 2,5 ml 1 m KH₂PO₄- 40 ml H₂O-75 ml EA gegossen. Nach Trennung der Schichten wird die wäßrige Schicht mit NaCl gesättigt und nochmals mit EA extrahiert. Die vereinten organischen Schichten werden einmal mit Kochsalzlösung extrahiert, über wasserfreiem MGSO₄ getrocknet, filtriert und unter einem N₂-Strom konzentriert und anschließend in einem Hochvakuum gepumpt, wobei man das rohe 3 erhält. Durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel erhält man 3. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans- Mischung erhält man in analoger Weise.

Stufe M

Zu 9,16 ml Pentan (getrocknet über einem 4A Molekularsieb) gibt man 0,2 ml Br₂ (Molgewicht=160; 3,9 mMol). Zu 474 mg 3 (Molgewicht=793; 0,598 mMol) in 13 ml Diäthyläther (getrocknet über einem 3A 1,59 mm Molekularsieb) bei 0°C unter N₂ gibt man tropfenweise unter Rühren 1,52 ml der obengenannten 0,42m Br₂-Lösung (0,63 mMol). Nach 15 Minuten bei 0°C werden 33 mg 57%iges NaH (57% von 33 mg=18,8 mg; Molgewicht=24; 0,78 mMol) zugegeben und unmittelbar daran gibt man 6,35 ml eiskaltes DMF (von wasserfreiem CaSO₄ bei 53,2 mbar abdestilliert und aufbewahrt über einem 4A Molekularsieb) hinzu. Das Reaktionsgemisch wird 1 1/2 Stundenb bei 0°C gerührt, dann zu einer gerührten eiskalten Mischung von 1,6 ml 1 m KH₂PO₄-20 ml H₂O und 20 ml EA gegossen. Die Schichten werden getrennt und die wäßrige Schicht wird mit NaCl gesättigt und nochmals mit weiterem EA extrahiert. Die vereinten organischen Schichten werden einmal mit Salzwasser gewaschen, getrocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und filtriert. Das Filtrat wird konzentriert unter einem N₂-Strom und dann an ein Hochvakuum gelegt, wobei man das rohe 4 erhält. Durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel erhält man 4. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

Stufe N

Zu 210 mg 4 (Molekulargewicht=871; 0,241 mMol), gelöst in 0,5 ml DMSO (von CaH₂ bei 10,6 mbar abdestilliert und aufbewahrt über einem 4A Molekularsieb) werden bei 25°C unter Rühren 40 mg 1,5-Diazobicyclo-[5,4,0]-undec-5-en (destilliert bei 80°C/2,66 mbar) (Molekulargwicht=152; 0,263 mMol) in 0,7 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gegeben. Die Lösung wird 4 Stunden unter N₂ gerührt und dann zu einer gerührten eiskalten Mischung von 0,48 ml 1 m KH₂PO₄, 7 ml H₂O und 10 ml EA gegeben. Nach Trennung der Schichten wird die wäßrige Schicht wiederum mit EA extrahiert. Die vereinten organischen Schichten werden einmal mit Salzwasser gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter einem N₂-Strom konzentriert und anschließend an ein Hochvakuum gelegt, wobei man das rohe 5 erhält. Durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel erhält man 5. Die Cis-Diastereoisomeren oder oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

Stufe O

Zu einer Lösung aus 187 mg 5 (Molekulargewicht=791; 0,236 mMol) in 2,5 ml s-Collidin (von gepulvertem KOH bei 3,9 mbar Druck abdestilliert) werden 45 mg wasserfreies LiJ (getrocknet für einige Stunden bei 100°C über P₂O₅ unter Vakuum) (Molekulargewicht=134; 0,336 mMol) gegeben. Unter Rühren unter N₂ wird das Reaktionsgemisch auf einem Ölbad auf 120°C erhitzt. Nach insgesamt 25 Minuten wird die Reaktionsmischung auf 25°C abgekühlt, mit CH₂Cl₂ verdünnt und in einen Rundkolben überführt, um unter einem N₂-Strom und im Hochvakuum zu konzentrieren. Der Rückstand wird zwischen 10 ml EA und 1,8 ml 1 m KH₂PO₄ in 10 ml H₂O geteilt und anschließend wird die wäßrige Schicht zwei weitere Male mit EA extrahiert. Die vereinten organischen Schichten werden mit Salzwasser extrahiert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter einem Stickstoffstrom konzentriert, wobei man rohes 6 erhält. Durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel erhält man 6. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

Stufe P

Zu einer Lösung der gemischten Diastereoisomeren 6 (34 mg; Molekulargewicht=612; 0,055 mMol) in 0,2 ml DMSO (von CaH₂ bei 10,64 mbar abdestilliert und aufbewahrt über einem 4A Molekularsieb) werden unter Rühren zugegeben 9,5 µl 1,5 Diazobicyclo- [5,4,0]-undec-5-en (destilliert bei -80°C/2,66 mbar (Molekulargewicht=152; ρ=1; 0,0625 mMol). Die Lösung wird unter Stickstoff 15 Minuten gerührt und zu einem Gesamtvolumen von 1 ml mit CHCl₃ verdünnt und unmittelbar auf 2 bis 1000 µ Kieselgelplatten gegeben. Die Bande des Produktes zeigt 7 an als Mischung von Cis- und Trans diastereoisomeren.

Stufe Q

In Gegenwart von 61 mg PtO₂ werden 61 mg 7 (Molekulargewicht= 6,12; 0,1 mMol) in 6 ml Dioxan, 6 ml THF, 3 ml H₂O 4 Stunden bei einem Druck von 2,8 kg/cm² mit Wasserstoff hydriert. Das Reaktionsgemisch wird durch ein Celite®-Filter filtriert und mit 2 ml 0,1 n pH 7 Phosphatpuffer gewaschen. Nach dem Konzentrieren im Vakuum bis zum Trübungspunkt wird die wäßrige Mischung mit Äthylacetat extrahiert. Die wäßrige Schicht wird zu einem geringen Volumen konzentriert und auf eine Säule von 100 g XAD-2 Harz gegeben. Beim Eluieren mit H₂O und Verwerfen der Anfangsfraktionen werden die Fraktionen, welche das Produkt enthalten, gefriergetrocknet, wobei man 8 als Mischung von Cis- und Trans-Diastereoisomeren erhält.

Die nachfolgend beschriebene Verfahrensweise für die enzymatische N-Deacylierung von N-Acyl-Thienamycinen ist anwendbar für alle Isomeren des Thienamycins, besonders für die speziellen N-Acetyl-Isomeren 890 A₁ und 890 A₃, die nachfolgend beschrieben sind.

Deacetylierung von N-Acetylthienamycin

Eine 1%ige (Gewicht/Volumen) Suspension von fruchtbarer Rasenerde wird hergestellt, indem man 1 g der Rasenerde in 100 ml sterile Phosphatpuffer-Salzlösung gibt, wobei die Phosphatpuffer-Salzlösung die folgende Zusammensetzung hat:

Phosphatpuffer-Salzlösung
NaCl\|8,8 g
1 m Phosphatpuffer, pH 7,5⁺ (1 m Phosphatpuffer, pH 7,5:16 ml 1 m KH₂PO₄ werden gemischt mit 84 ml 1 m K₂HPO₄. Der pH des Phosphatpuffers wird durch Zugabe einer geringen Menge von entweder 1 m KH₂PO₄ oder 1m K₂HPO₄ auf 7,5 eingestellt.)	10 ml
destilliertes Wasser	1000 ml

Aliquote dieser 1%igen Vorratserde-Suspension werden hergestellt zur Zubereitung von 10×, 100× und 1000×-Verdünnungen.

1-ml-Anteile der Vorratssuspension oder 1-m-Anteile der 10×, 100× und 1000×-Verdünnungen werden zu 2-ml-Anteilen von sterilen, 1,0%igen Agarlösungen bei 48°C gegeben. Die Mischung wird schnell über die Oberfläche von sterilen Petrischalen von 85 mm Durchmesser, enthaltend 20 ml des Mediums A, gegossen. Medium A hat die folgende Zusammensetzung:

Medium A
KH₂PO₄\|3,0 g
K₂HPO₄	7,0 g
MgSO₄	0,1 g
destilliertes H₂O	1000 ml
N-Acetyläthanolaminlösung (N-Acetyläthanolaminlösung: N-Acetyläthanolamin wird 10× in H₂O verdünnt und membransterilisiert. Diese Lösung wird nach der Autoklavenbehandlung zugegeben.)	8,5 ml
Für feste Medien: Man gibt 20 g Agar zu.

Die Petrischalen werden 18 Tage bei 28°C inkubiert. Eine gut isolierte Kolonie wird aufgenommen und auf einer Petrischale, enthaltend Medium B, ausgebreitet. Medium B hat die folgende Zusammensetzung:

Medium B
Tomatenpaste\|40 g
gemahlenes Weizenmehl	15 g
dest. Wasser	1000 ml
pH: eingestellt auf pH 6 unter Verwendung von NaOH @	Für feste Medien: Man gibt 20 g Agar hinzu.

Eine einzelne Kultur wird ausgwählt und 2 Tage bei 28°C auf einer Agarkultur des Mediums B wachsen gelassen. Ein Teil des Wachstums dieser Kultur wird auf die Oberfläche von 6 Kulturen, die aus dem Medium B hergestellt worden sind, ausgebreitet. Diese Kulturen werden 2 Tage bei 28°C inkubiert. Diese Kultur wurde identifiziert als Protaminobacter ruber und bezeichnet mit MB-3528 in der Kulturkollektion von Merck & Co., Inc, Rahway, N. J., USA und eine Probe wurde hinterlegt beim Agricultural Research Service, U. S. Department of Agriculture, Accession No. NRRL B-8143.

Ein Teil des Wachstums der Agarkultur von Protaminobacter ruber MB-3528 wird verwendet, um einen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 50 ml des Mediums C, zu beimpfen. Medium C hat die folgende Zusammensetzung:

Medium C
Dextrose\|20 g
Pharmamedia	8 g
Maisquellwasser	5 g
destilliertes Wasser	1000 ml
pH: eingestellt auf 7 mit NaOH oder HCl @	N-Acetyläthanolaminlösung (N-Acetyläthanolaminlösung: N-Acetyläthanolamin wird 10× in H₂O verdünnt und membransterilisiert. Diese Lösung wird nach der Autoklavenbehandlung zugegeben.)	8,5 ml

Der Kolben wird bei 28°C und 220 U/Min. auf einem Rüttler 4 Tage geschüttelt. Eine 25-ml-Portion aus dem Kolben wird 15 Minuten mit 8000 U/Min zentrifugiert. Das Überstehende wird entfernt und die Zellen an der Oberfläche des festen Mediums werden abgekratzt und zu einem 0,5 ml 0,05 m Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4, gegeben. Die erhaltene Suspension wird einer Ultraschallbehandlung unterworfen mit vier 15-Sekunden-Intervallen, während die Suspension während und zwischen den Unterbrechungen in Eiswasser gekühlt wird. Ein 10-µl-Anteil des schallbehandelten Produktes wird mit 25 µl Lösung, enthaltend 840 µg/ml N-Acetylthienamycin in 10 mMol Kaliumphosphatpuffer, pH 7, vermischt und über Nacht bei 28°C inkubiert. Kontrollen, welche das Antibiotikum und Puffer allein enthalten und beschallte Zellen und Puffer ohne Antibiotikum wurden auch vorgenommen. Nach einer Inkubierung über Nacht bei 28°C werden 2-µl-Mengen auf cellulosebeschichtete Dünnschichtchromatographie-Platten gegeben, die entwickelt wurden in Äthanol : H₂O, 70 : 30. Nach dem Trocknen an der Luft wird die Dünnschichtchromatographie- Platte auf eine mit Staphylococcus aureus ATCC 6538P infizierte Platte für 5 Minuten gegeben.

Die infizierten Platten sind wie folgt hergestellt worden: Das Über-Nacht-Wachstum des für die Infizierung verwendeten Organismus Staphylococcus aureus ATCC 6538P in Fleischbrühe plus 0,2% Hefeextrakt wird mit Fleischbrühe plus 0,2% Hefeextrakt zu einer Suspension verdünnt, die eine 60%ige Durchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 660 nm hat. Diese Suspension wird zu Difco-Nähragar, ergänzt mit 2,0 g/l Difco-Hefeextrakt, bei 37 bis 48°C gegeben, um eine Zusammensetzung zu erhalten, die 33,2 ml der Suspension pro Liter Agar enthält. 40 ml dieser Suspension werden auf Petrischalen, 22,5 cm×22,5 cm, gegossen und die Platten werden gekühlt und bei 4°C gehalten bis sie verwendet werden (5 Tage Maximum).

Die Dünnschichtchromatographie-Platte wird entfernt und die den Organismus enthaltende Platte wird über Nacht bei 35°C inkubiert. Außer dem nicht umgesetzten bio-aktiven N-Acetylthienamycin mit einem Punkt bei R_f 0,7-0,89 wurde ein bio-aktiver Punkt beobachtet bei R_f 0,44-0,47, der dem Thienamycin zugeschrieben wird. Kontrollinkubationsmischungen des Antibiotikums plus Puffer, schallbehandelte Zellen plus Puffer und Antibiotikum plus Puffer, zu denen schallbehandelte Zellen zugegeben worden waren kurz vor der Dünn schichtchromatographie-Anwendung, zeigten kein bio-aktives Material bei R_f 0,44-0,47.

Herstellung von 890A₁, einem speziellen Isomeren

Ein Röhrchen einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4434 (NRRL 8139) wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in ein Röhrchen suspendiert, welches 0,8 ml steriles Davis-Salz der folgenden Zusammensetzung enthält:

Davis-Salz
Natriumcitrat\|0,5 g
K₂HPO₄	7,0 g
KH₂PO₄	3,0 g
(NH₄)₂SO₄	1,0 g
MgSO₄ · 7H₂O	0,1 g
destilliertes Wasser	1000 ml

Diese Suspension wird verwendet zum Bebrüten von vier Kulturen des Mediums A mit der folgenden Zusammensetzung:

Medium A
Glycerin\|20.0 g
primäre Hefe	5,0 g
Fischmehl	15,0 g
destilliertes Wasser	1000 ml
Agar	20,0 g
pH: eingestellt auf 7,2 unter Verwendung von NaOH

Die beimpften Kulturen werden ein Woche bei 27-28°C bebrütet und dann bis zur Verwendung bei 4-6°C aufbewahrt.

Eine 1/3-Protion des Wachstums von drei Kulturen wird verwendet um 9 mit einem Stoß versehene Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung, zu beimpfen:

Medium B
Hefeautolysat\|10,0 g
Glukose	10,0 g
Phosphatpuffer (Phosphatpufferlösung: KH₂PO₄ 91,0 g, Na₂HPO₄ 95,0 g, destilliertes Wasser 1000 ml.)	2,0 ml
MgSO₄ · 7H₂O	50 mg
destilliertes Wasser	1000 ml
pH: eingestellt auf 6,5 unter Verwendung von HCL oder NaOH

Die die Keime enthaltenden Kolben werden 1 Tag bei 27-28°C auf einem Rüttler mit 220 U/Min. geschüttelt. Die Kolben und die Inhalte werden 1 Tag bei 4°C aufbewahrt.

33 2-l-Erlenmeyer-Kolben, jeder enthaltend 250 ml des Mediums C, werden mit 8 ml pro Kolben des Wachstums aus dem die Keime enthaltenden Kolben beimpft. Das Medium C hat die folgende Zusammensetzung:

Medium C
Tomatenpaste\|20,0 g
primäre Hefe	10,0 g
Dextrin	20,0 g
CoCl₂ · 6H₂O	5,0 mg
destilliertes Wasser	1000 ml
pH: eingestellt auf 7,2-7,4 durch NaOH

Nach der Beimpfung werden die Produktionskolben bei 24°C bebrütet unter Schütteln auf einem Rüttler, der mit 212 U/Min. betrieben wird, und zwar für 4 Tage. Die Kolben werden dann entleert und der Inhalt auf Aktivität untersucht unter Verwendung von Standard Salmonella gallinarum MB1287 und Vibrio percolans ATCC 8461-Platten unter Anwendung von 1,25-cm-Scheiben, welche in die zentrifugierten Brüheproben eingetaucht wurden. Die Proben werden mit 0,02m Phosphatpuffer, pH 7,0, nötigenfalls verdünnt. Die Ergebnisse werden nachfolgend angegeben:

Zeitpunkt der Ernte (in Stunden)
96
pH	7,2
Salmonella gallinarum (mm Zone)	29,5
Vibrio percolans 1/10-Verdünnung (mm Zone)	31
890 Prüfeinheiten	40

7 l der gesamten Fermentationsbrühe werden auf 3°C abgekühlt und in 200-ml-Anteilen mit 9000 U/Min. 15 Minuten jeweils zentrifugiert.

Zu den vereinten überstehenden Flüssigkeiten werden 7 ml 0,1 m neutrales EDTA gegeben und die ganze Probe wird auf eine Dowex®-1×2 (Cl^-) Säule (Teilchengröße 0,149-0,298 mm) gegeben mit Bettdimensionen von 5,1×25cm und einer Fließgeschwindigkeit von 40 ml/Min. Die Säule wird mit 500 ml entionisiertem Wasser, enthaltend 5 ml 1 m Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 25 µMol neutrales EDTA, gewaschen. Das Antibiotikum wird mit 1 Liter entionisiertem Wasser, enthaltend 50 g Natriumchlorid, eluiert und die Säule wird dann mit 300 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Fraktionen von 100 ml werden gesammelt, ausgehend vom ersten Aufreten des Salzes am Säulenausgang. Die Bio-Aktivität liegt in den Fraktionen 1 bis 10 mit einem Peak bei der Fraktion 2 vor. Die Fraktionen 2 bis 5, welche 17% der angewandten Aktivität enthalten, werden zusammengegeben.

Die zusammengegebenen Fraktionen werden auf 110 ml konzentriert mittels eines Rotationsverdampfers unter vermindertem Druck und der pH wird auf 5,8 eingestellt durch Zugabe von 4,2 ml 1 m HCl. Das so eingestellte Konzentrat wird auf eine Säule von XAD-2 gegeben mit einer Bettdimension von 3,8×50 cm, die vorher gewaschen worden war mit 3 l 60%igem wäßrigem Aceton (Volumen/Volumen) und anschließend mit 3 l entionisiertem Wasser, 3 l von 5%igem (Gewicht/Volumen) Natriumchlorid und 1 l 25%igem (Gewicht/Volumen) Natriumchlorid in entionisiertem Wasser. Das angewendete Konzentrat läßt man auf das Niveau des Bettes abfließen. Das Antibiotikum wird eluiert mit entionisiertem Wasser mit einer Fließgeschwindigkeit von 15 ml/Min. 22 Fraktionen von jeweils 100 ml werden gesammelt, gerechnet von der ersten Anwendung der Probe. Die Bio-Aktivität erscheint in den Fraktionen 6 bis 22 mit einem Peak bei den Fraktionen 9 und 10. Fraktionen 9 bis 20 werden für die weitere Verarbeitung vereint. Ähnlich hergestellte Fraktionen werden vereint und die vereinten Fraktionen werden auf 70 ml konzentriert mittels eines Rotationsverdampfers unter vermindertem Druck.

Das Konzentrat wird auf eine Dowex®-1×4 (Cl^-) Säule (Teilchengröße größer als 0,037 mm) mit einer Bettdimension von 2,2×27 cm gegeben. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser gewaschen und das Antibiotikum eluiert mit 2 l 0,070 m NaCl+0,005 m NH₄Cl+0,0001 m NH₃ in entionisiertem Wasser mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Min. Fraktionen von 9,5 ml werden gesammelt.

Der Hauptpeak des Antibiotikums wird eluiert in den Fraktionen 142 bis 163. Die Fraktionen 146 bis 157 werden vereint für die weitere Verarbeitung.

Die vereinten Fraktionen 146-157 werden konzentriert auf 3 ml durch Verdampfen unter vermindertem Druck auf einem Rotationsverdampfer und das Konzentrat wird durch Zugabe von 5 µl 1 m NH₃ auf pH 6,5 gebracht. Das Konzentrat wird auf eine Säule (2,2×70 cm) eines Bio-Gel P-2 (Teilchengröße 0,037-0,074 mm) gegeben, die vorher gewaschen worden war mit 20 ml 5 m NaCl und 500 ml entionisiertem Wasser. Nachdem das Konzentrat auf das Bettniveau abgelaufen war, wurden 2 Spülungen mit jeweils 1 ml entionisiertem Wasser vorgenommen und wiederum bis zum Bettniveau ablaufen gelassen. Die Säule wird dann eluiert mit entionisiertem Wasser mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,6 ml/Min. Fraktionen von 2,9 ml werden gesammelt.

Der Hauptpeak des Antibiotikums wird eluiert in den Fraktionen 63 bis 70. Fraktionen 64 und 65 werden für die weitere Aufarbeitung zusammengegeben.

Die vereinten Fraktionen 64 und 65 werden in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck auf 2 ml konzentriert und dann in einer Umhüllung gefroren und lyophilisiert während 8 Stunden in einem 14 ml mit Schraubverschluß versehenen Gefäß, wobei man 2,25 mg des im wesentlichen reinen Antibiotikums 890A₁ erhält. Die N-Acetylgruppe wird abgespalten, wie vorher beschrieben, wobei man die freie Base erhält:

Herstellung von 890A₃, einem speziellen Isomeren

Ein Röhrchen einer lyophilisierten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4434 (NRRL 8139) wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird suspendiert in einem Röhrchen, enthaltend 0,8 ml einer sterilen Davis-Salzlösung der folgenden Zusammensetzung:

Die Suspension wird verwendet, um 4 Kulturen des Mediums A der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen:

Medium A
Glycerin\|20,0 g
primäre Hefe	5,0 g
Fischmehl	15,0 g
destilliertes Wasser	1000 ml
Agar	20,0 g
pH: eingestellt auf 7,2 unter NaOH

Die beimpften Kulturen werden 1 Woche bei 27-28°C bebrütet und dann bei 4-6°C bis zur Verwendung aufbewahrt (nicht länger als 21 Tage).

Ein 1/3-Anteil des Wachstums aus 4 Kulturen wird zum Beimpfen von 12 verstöpselten 250-ml-Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung, verwendet:

Medium B
Hefeautolysat\|10,0 g
Glucose	10,0 g
Phosphatpuffer (Phosphatpufferlösung: KH₂PO₄ 91,0 g, Na₂HPO₄ 95,0 g, destilliertes Wasser 1000 ml.)	2,0 ml
MgSO₄ · 7H₂O	50 mg
destilliertes H₂O	1000 ml
pH: eingestellt auf 6,5 unter HCL oder NaOH

Die Flasche mit den Keimen wird 1 Tag bei 27-28°C auf einer Rüttelmaschine mit 220 U/Min. geschüttelt. Die Flasche und der Inhalt werden 1 Tag bei 4°C stationär aufbewahrt.

44 2-l-Erlenmeyer-Kolben, jeweils enthaltend 200 ml von Medium C, werden mit 8 ml pro Kolben des Wachstums aus den beimpften Flaschen versetzt. Medium C hat die folgende Zusammensetzung:

Nach der Beimpfung werden die Produktionskolben bei 24°C 4 Tage und 5 Stunden auf einer Schüttelmaschine, die mit 212 U/Min. betrieben wird, gerüttelt. Die Kolben werden dann entleert und auf Aktivität untersucht unter Verwendung von Standard Salmonella gallinarum MB1287 und Vibro percolans ATCC 8461-Probeplatten unter Verwendung von 1,25-cm-Probescheiben, die in die zentrifugierten Proben der Brühe eingetaucht wurden. Die Proben werden verdünnt mit 0,2 m Phosphatpuffer, pH 7,0, falls erforderlich. Die Ergebnisse werden nachstehend angegeben:

Zeitpunkt der Ernte (in Stunden)
101
pH	7,2
Salmonella gallinarum (mm Zone)	35
Vibro percolans 1/10-Verdünnung (mm Zone)	34
890 Probeeinheiten	121

Aus dieser Fermentation werden insgesamt 7 l der gesamten Brühe erhalten und diese werden auf 3°C abgekühlt und zentrifugiert in 200-ml-Portionen bei 9000 U/Min. während jeweils 15 Minuten. Zu den vereinten überstehenden Lösungen werden 1,7 ml von 0,1 m neutralem EDTA zugegeben und der Ansatz wird auf 3°C gehalten.

Die obengenannte Fermentation wird unter identischen Bedingungen wiederholt mit der Ausnahme, daß die 44 2-l- Erlenmeyer-Kolben mit 7 ml pro Flasche des Wachstums aus den die Kulturen enthaltenden Flaschen beimpft werden; der pH und die erhaltenen Prüfergebnisse werden nachfolgend angegeben:

Zeitpunkt der Ernte (in Stunden)
101
pH	7,3
Salmonella gallinarum (mm Zone)	38
Vibro percolans 1/10-Verdünnung (mm Zone)	39
890 Probeeinheiten	92,8

Insgesamt 7,4 l der gesamten Brühe, die aus dieser Fermentation erhalten worden sind, werden auf 3°C abgekühlt und jeweils 15 Minuten in 200-ml-Portionen bei 9000 U/Min. zentrifugiert. Zu den vereinten überstehenden Lösungen gibt man 1,8 m neutrales EDTA.

Das überstehende von den zentrifugierten Brühen, wie es aus den beiden obengenannten Fermentationen in diesem Beispiel erhalten wurde, wird vereint, wobei man ein Gesamtvolumen von 13 ml erhält.

Die vereinten überstehenden Lösungen werden durch eine Säule aus Dowex®-1×2 (Cl^-) (Teilchengröße 0,149-0,298 mm) mit einer Bettdimension von 4,7 cm×50 cm und einer Fließgeschwindigkeit von 60 ml/Min. gegeben. Die Säule wird gewaschen mit 1 l entionisiertem Wasser und das Antibiotikum wird mit 5 l einer 5%igen (Gewicht/Volumen) NaCl-Lösung, enthaltend 0,01 m Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 25 µMol EDTA eluiert. Fraktionen von 220 ml werden gesammelt mit einer Fließgeschwindigkeit von 50 ml/Min. und die Fraktionen werden geprüft gegenüber Salmonella gallinarum MB 1287-Platten.

Antibiotische Aktivität liegt vor in den Fraktionen 3 bis 26 mit einem Peak bei den Fraktionen 5 und 6. Die Fraktionen 5 bis 9 werden vereint für die weitere Verarbeitung. Der pH der zusammengegebenen Fraktionen ist 10,8 und die zusammengegebenen Fraktionen enthalten 24% der Anfangs-Bioaktivität, gemessen gegenüber Salmonella gallinarum MB 1287-Platten.

Die vereinten Fraktionen 5 bis 9 werden auf 150 ml mittels eines Rotationsverdampfers unter vermindertem Druck konzentriert und auf eine Säule (4,9 cm×47 cm) von XAD-2 gegeben, die vorher gewaschen worden war mit 5 l 60%igem (Volumen/Volumen) wäßrigem Aceton und anschließend mit 5 l entionisiertem Wasser und 5 l 50 g/l NaCl in entionisiertem Wasser. Die Probe wird in 20-ml-Anteilen aufgetragen, die man jedesmal bis zum Niveau des Säulenfüllmaterials abfließen läßt. Wenn die Auftragung beendet ist, werden drei 20-ml-Portionen von entionisiertem Wasser zugegeben, die man jedesmal bis zum Niveau des Säulenfüllmaterials abfliessen läßt. Die Probe wird eluiert mit entionisiertem Wasser mit einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/Min. Alle Maßnahmen, bei denen die XAD-Säule verwendet wird, werden durchgeführt bei Raumtemperatur (24°C) und die eluierten Fraktionen werden schnell abgekühlt in einem Eisbad unmittelbar nach dem Sammeln. Fraktionen von 95 bis 230 ml werden gesammelt.

Die antibiotische Aktivität erscheint in Fraktionen 2 bis 21, wie aus einer Probe von Salmonella gallinarum MB 1287- Platten gemessen wurde, mit einem Peak bei Fraktionen 5 bis 7 (die 510 bis 895 ml an eluiertem Volumen ausmachen, gerechnet von der ersten Anwendung des entionisierten Wassers). Fraktionen 6 bis 21 werden zusammengegeben.

Die zusammengegebenen Fraktionen 6 bis 21 werden unter vermindertem Druck auf einem Rotationsverdampfer auf 68 ml konzentriert und dann durch Zugabe von entionisiertem Wasser auf 112 ml verdünnt. Das Konzentrat wird auf eine Säule (2,2 cm×21 cm) von Dowex®-1×4 (Cl^-) (Teilchengröße größer 0,037 mm) gegeben. Die Säule wird mit 20 ml entionisiertem Wasser gewaschen und das Antibiotikum wird eluiert mit 2 l 0,07 m NaCl+0,005 m NH₄Cl+0,0001 m NH₃ entionisiertem Wasser mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,6 ml/Min. Es werden Fraktionen von jeweils 8 ml gesammelt. Fraktionen 157 bis 179 haben die größte Aktivität und werden zusammengegeben.

Diese zusammengegebenen Fraktionen werden konzentriert auf einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck auf 7 ml, der pH wird auf 7,5 durch Zugabe von 20 µl 1 m NaOH eingestellt. Die Lösung wird weiter konzentriert auf 5 ml und auf eine Säule gegeben (2,2×75 cm) von Bio-Gel P-2 (Teilchengröße 0,037-0,074 mm). Die Probe wird in dem Säulenbett mit zwei Waschungen von jeweils 1 ml entionisiertem Wasser gewaschen und eluiert mit entionisiertem Wasser mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,6 ml/Min. Zehn Fraktionen von 3,3 ml und anschließend 60 Fraktionen von 2,65 ml und zehn Fraktionen von 2,0 ml werden gesammelt.

Die Fraktionen werden auf den pH-Bereich zwischen 7,5 und 8,0 durch Zugabe von 1,5 bis 2,5 µl 0,1 m NaOH eingestellt. Die Fraktionen 62, 63, 64 und 65 werden gefroren und einzeln in 14-ml-Glasröhrchen lyophilisiert und bei -20°C unter Vakuum aufbewahrt.

Um das Antibiotikum 890A₃ frei von 890A₁ zu isolieren, macht man von dem Vorteil der relativ höheren Beständigkeit des Antibiotikums 890A₃ gegen Abbau durch Penicillinase in der folgenden Weise Gebrauch:

Bio-Gel Fraktion 63 wird kombiniert mit Fraktionen 61, 66 und 67 aus der Bio-Gel-Säule. Zu diesen vier vereinten Fraktionen werden 0,2 ml 1 m Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, und 0,2 ml Penicillinase gegeben. Nach 113 Minuten bei 23°C werden weitere 0,2 ml Penicillinase hinzugefügt. Nach weiteren 7 Stunden bei Raumtemperatur werden weitere 0,2 ml Penicillinase zugegeben, und nach weiteren 2 Stunden bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch auf einem Eisbad abgekühlt. Das fertige Reaktionsgemisch wird auf 15 ml durch Zugabe von 5 ml entionisiertem Wasser verdünnt.

Das Reaktionsgemisch wird adsorbiert an einer Dowex®-1×4 (Cl^-) Säule (Teilchengröße größer 0,037 mm), Bettdimension 2,15×40 cm. Das Antibiotikum 890A₃ wird eluiert mit 0,07 m NaCl+ 0,005 m NH₄Cl+0,0001 m NH₃ in entionisiertem Wasser mit einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Min. Fraktionen von 13,8 ml werden jeweils gesammelt. Fraktionen 187 bis 200 werden zusammengegeben.

Die vereinigten Fraktionen werden konzentriert auf 4 ml mittels eines Rotationsverdampfers unter vermindertem Druck und das Konzentrat wird auf eine Säule (2,2×70 cm) Bio-Gel P-2 (Teilchengröße 0,037-0,074 mm) aufgegeben. Das Antibiotikum 890A₃ wird mit entionisiertem Wasser eluiert mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,6 ml/Min. 30 Fraktionen von 3,3 ml und anschließend 50 Fraktionen von 2,65 ml werden gesammelt.

Fraktionen 66 bis 70 werden vereint und die vereinten Proben werden auf 1,5 ml unter vermindertem Druck mittels eines Rotationsverdampfers konzentriert und das Konzentrat wird gefroren und gefriergetrocknet, wobei man 5,4 mg eines Feststoffes erhält, der das Antibiotikum 890A₃ und restliches Salz enthält. Die N-Acetylgruppe wird abgespalten, wie vorher beschrieben, so daß man die freie Base erhält:

Das Antibiotikum Thienamycin und seine Herstellung sind beschrieben in DT-OS 25 52 638. Es ist erhältlich durch Züchten des Mikroorganismus Streptomyces cattleya (MA-4297), von dem eine Kultur bei der Kultursammlung der Northern Regional Research Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U. S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V. St.A. hinterlegt und mit NRRL 8057 bezeichnet ist.

Claims

1. Substituierte N-Methylenderivate von Thienamycin der allgemeinen Formel und deren pharmazeutisch annehmbare, für β-Lactamantibiotika übliche Salz- und Esterderivate der Carboxylgruppe, worin bedeuten

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R Methyl und R¹ und R² Wasserstoff sind.

3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R und R¹ Methyl und R² Wasserstoff sind.

4. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R Amino und R¹ und R² Wasserstoff sind.

5. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R und R¹ Wasserstoff und R² Benzyl sind.

6. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R und R¹ Wasserstoff und R² Methyl sind.

7. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R Ethyl und R¹ und R² Wasserstoff sind.

8. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R und R¹ Wasserstoff und Ethyl sind.

9. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R und R² Wasserstoff und R¹ Phenyl sind.

10. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) zur Herstellung einer Verbindung, worin R Wasserstoff und C_1-3-Alkyl bedeutet, eine Verbindung der Formel: oder ein pharmazeutisch annehmbares, für β-Lactamantibiotika übliches Salz- oder Esterderivat der Carboxylgruppe davon mit einem Inidoester oder einem Imidohalogenid: worin -X⁰R′′ die austretende Gruppe, X′ Halogen und X⁰ O der S ist, sowie R¹, R² die Bedeutungen des Anspruches 1 haben, in an sich bekannter Weise behandelt,
oder eine Verbindung der Formel oder ein pharmazeutisch annehmbares,für β-Lactamantibiotika übliches Salz- oder Esterderivat der Carboxylgruppe davon mit einem Amin, NHR¹R², worin X′ die austretende Gruppe -OR und -SR ist und R¹, R² die Bedeutungen des Anspruches 1 haben, in an sich bekannter Weise behandelt, oder
(b) zur Herstellung einer Verbindung, worin R Amino bedeutet, eine Verbindung der Formel oder ein pharmazeutisch annehmbares, für b-Lactamantibiotika übliches Salz- oder Esterderivat der Carboxylgruppe davon mit worin X′′ O der S und -X′′R⁰ die austretende Gruppe ist und R¹, R² die Bedeutungen des Anspruches 1 haben, in an sich bekannter Weise behandelt,
oder eine Verbindung der allgemeinen Formel oder ein pharmazeutisch annehmbares, für β-Lactamantibiotika übliches Salz- oder Esterderivat der Carboxylgruppe davon mit NH₃, worin X′ die austretende Gruppe -OR oder -SR ist und R¹, R² die Bedeutungen des Anspruches 1 haben, in an sich bekannter Weise behandelt.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und einen pharmazeutischen Träger.