DE2652674A1 - N- und carboxylderivate von thienamycin - Google Patents

Description

Patentanwälte:
Dr. Ing. Walter Abitz
Dr. Dieter F. Morf ' </**"' 19. November 1976

Dr. Hans-A. Brauns I5813Y ·

8 München BS₁ Pienzenaiiaisir. 28

MERCK & CO., IMC.

126 East Lincoln Avenue, Rahway, N.J. 07065,

V.St.A.

N- und Carboxy!derivate von Thienamycin

Die Erfindung betrifft gewisse N-Acyl- und Carboxy 1-derivate des.neuen Antibiotikums Thienamycin. Diese Derivate sind als Antibiotika geeignet. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese Verbindungen enthalten. Ausserdem werden Verfahren beschrieben, nach welchen solche Verbindungen und deren Zubereitungen verabreicht werden können, wenn eine antibiotische Wirkung angezeigt ist.

Thienamycin (I) wird beschrieben und beansprucht in der US-PS 3 950 357? Diese Patentschrift wird hiermit in '

die Offenbarung einbezogen, weil Thienamycin als Ausgangsverbindung bei der Herstellung der erfindungsgemSssen Verbindungen verwendet werden kann.

+) (= DT-OS 25 52 638)

15813Y

OH

-Ct

COOH

Die N-acylierten Carboxylderivate des Thienamycins der vorliegenden Erfindung können durch die folgende allgemeine Formel (II) gekennzeichnet werden:

OH

/\ SCH-CH_nNR¹R²

'2^w2^l COXR

II
oder, noch einfacher, "durch das Symbol:

rOH
Th-LNR¹R²

^COXR

II

Darin bedeutet "Th" den bicyclischen Kern des Thienamycins und dessen hydroxyl-, amino- und carboxylfunktionelle Gruppen.

1 2
R und R sind unabhängig voneinander ausgewählt aus der

1 2 Gruppe, bestehend aus Wasserstoff (R und R sind nicht zusammen Wasserstoff) oder einer Acylgruppe. Die am meisten bevorzugten Verbindungen der Erfindung sind solche,

1 2

in denen R Wasserstoff und R Acyl bedeutet.

709 8 2 2*/ 10 2 7

15813Y

Der Ausdruck "Acyl" soll durch Definition einschliessen die Alkanoyle einschliesslieh Derivate und Analoge davon, wie die Thioanaloge, worin der Carbonylsauerstoff ersetzt

1 2

ist durch Schwefel, Diacylreste, worin R und R miteinander verbunden sind, sowie auch die Schwefel- und Phosphoracylanaloge, wie substituierte Sulfonyl-, SuIfinyl- und Sulfenylreste und substituierte P (III und V)-Reste, wie substituierte phosphorig-, Phosphor-, unterphosphorig- und phosphinig-Reste. Solche Reste werden weiter unten erläutert.

X bedeutet Sauerstoff, Schwefel oder NR¹ (R' = H oder R); und R wird unter anderem typischerweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus üblichen Blockierungsgruppen, wie Trialkylsilyl, substituiertes und unsubstituiertes Benzyl, Acyl und den pharmazeutisch annehmbaren Salz-, Ester- und Amidgruppen, wie sie für die bicyclischen ß-Lactam-Antibiotika bekannt sind. Die Definition von R wird ausführlicher weiter unten beschrieben.

Es besteht ein ständiger Bedarf an neuen Antibiotika. Denn unglücklicherweise gibt es keine statische Wirksamkeit für ein gegebenes Antibiotikum, weil die fortwährende Anwendung im breiten Umfang eines solchen Antibiotikums selektiv die Bildung von resistenten Stämmen und Pathogenen erhöht. Darüberhinaus haben die bekannten Antibiotika den Nachteil, dass sie nur gegen gewisse Typen von Mikroorganismen wirksam sind. Deshalb wird weiterhin nach neuen Antibiotika geforscht. ' . ■

Unerwarteterweise wurde nun gefunden, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung Antibiotika mit breitem Spektrum sind, die sowohl für tierische und Humantherapie und in unbeseelten Systemen nützlich sind.

709822/1027

15813Y

Es ist darum ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine neue Klasse von Antibiotika zur Verfügung zu stellen, welche die grundlegende Kernstruktur des Thienamycins haben, die jedoch dadurch gekennzeichnet sind, dass sie N-acylierte Carboxylderivate davon sind. Diese Antibiotika sind aktiv gegen, einen breiten Bereich von Pathogenen, für welche sowohl gram-positive Bakterien repräsentativ sind, wie S. aureus, B. subtilis und Strept. pyogenes, als auch gram-negative Bakterien, wie E. coli und Salmonella. Weitere Aufgaben der Erfindung bestehen darin, chemische Verfahren zur Herstellung von Antibiotika und deren nicht-toxischen, pharmazeutisch annehmbaren Salzen zur Verfügung zu stellen sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, Vielehe solche Antibiotika enthalten. Die Erfindung beschreibt' auch Verfahren zur Behandlung, bei denen solche Antibiotika und Zusammensetzungen verabreicht werden, wenn eine antibiotische Wirkung angezeigt ist.

Die erfindungsgeinässen Verbindungen (II) werden in einfacher Weise nach dem folgenden Schema hergestellt: Zuerst wird Thienamycin (I) N-acyliert unter Ausbildung des N-Acyl-Zwischenproduktes (1), welches dann unter Ausbildung des gewünschten Produktes (II) verestert wird:

OH

Th --NH₀ Th--NR^Xir Th

^l2

Lcooh

-OH

LCOOH

"OH

1„2

-NR R

L COXR

II

- 4 - ■

709822/1027

15813Y

• /19.

Darin haben alle Symbole die vorher angegebene Bedeutung. Die vorstehend angegebene Herstellung wird nachfolgend ausführlicher beschrieben. Dabei ist jedoch zu beachten, dass die beiden Stufen in umgekehrter Reihenfolge vorgenommen werden können oder auch gleichzeitig.

Bei einer allgemeinen Beschreibung der erfindungsgemässen Verbindungen (II» oben) kann der Acylrest, wie er durch entweder R oder R wiedergegeben wird, unter anderem ein substituierter oder unsubstituierter aliphatischer, aromatischer oder heterocycleseher, araliphatischer oder heterocyclylaliphatischer Carboxy1-säurerest sein, ein substituierter oder unsubstituierter Carbamylrest oder ein Carbothiosäurerest. Eine Gruppe von Acylresten kann dargestellt werden durch die allgemeine Formel:

Ii

709822/1027

15813Y

worin X=O oder S bedeutet und R" bedeutet Wasserstoff; Amino; substituiertes Amino, wie Alkyl- und Dialkylamino, worin der Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome umfasst; substituierte oder unsubstituierte Reste, wie: geradkettige oder verzweigtkettige Alkylreste, worin der Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome umfasst; Mercapto, wie Alkylthio, welches typischerweise 1 bis 6 Kohlenstoffatome umfasst; Arylthio, welches typischerweise 6 bis 10 Kohlenstoffatome umfasst; Hydroxy, wie Alkoxy, welches typischerweise 1 bis Kohlenstoffatome umfasst; Aryloxy, welches typischerweise β bis 10 Kohlenstoffatome umfasst; Alkenyl- oder Alkynylgruppen, die typischerweise 2 bis 6 Kohlenstoffatome umfassen; Aryl, wie Phenyl;Äralkyl, wie Benzyl; Cycloalkyl, welches typischerweise 3 bis 6 Kohlenstoffatome umfasst; oder eine Heteroaryl- oder Heteroarälkylgruppe (mono- oder bicyclisch), worin die Alkylgruppe typischerweise 1 bis Kohlenstoffatome umfasst und der heterocyclische Ring typischerweise 4 bis 10 Atome enthält und das Heteroatom oder die Heteroatome ausgewählt sind aus 0, N und S; die vorgenannten Gruppierungen können unsubstituiert sein oder sie können substituiert sein durch Reste, wie OH, SH, SR (R ist Niedrigalkyl oder Aryl, wie Phenyl), Alkyl oder Alkoxygruppen mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen, Halogen, wie Cl, Br, F und J, Cyano, Carboxy, SuIfamino, Carbamoyl, Sulfonyl, Azido, Amino, substituiertes Amino, wie Alkylamino einschliesslich quaternäres Ammonium, worin die Alkylgruppen 1 bis 6 Koahlenstoffatome haben, Halogenalkyl, wie Tri fluorine thy 1, Carboxyalkyl, Carbamoy !alkyl, N-substituiertes Carbamoy!alkyl, worin die Alkylgruppe

709822/1027

15813Y 9Λ

der vorgenannten vier Reste 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome umfasst, Amidino, Guanidino, N-substituiertes Guanidino, Guanidinoniedrigalkyl und dergleichen. Typische Beispiele für solche Acylgruppen, die hier erwähnt werden können, sind solche, bei denen R" bedeutet Benzyl, p-Hydroxybenzyl, ^-Amino-^-carboxybutyl, Methyl, Cyanoinethyl, 2-Pentenyl, n-Amyl, n-Heptyl, Äthyl,3- oder iJ-Nitrobenzyl, Phenäthyl, ß,ß-Diphenyläthyl, Methyldiphenylmethyl, Triphenylmethyl, 2-Methoxyphenyl, 2,6-Dimethoxyphenyl, 2,4,6-Trimethoxyphenyl, 3,5-Dimethyl-4-isoxazolyl, 3-Butyl~5-methyl-4~isoxazolyl, 5-Methyl-3-phenyl-4-isoxazolyl, 3-(2-Chlorphenyl)-5-methyl-ⁱl-isoxazolyl, 3-(2,6-DichlorphenyD-S-methyl-lJ-isoxyzolyl, D-^-Amino-ii-carboxybutyl, D-^N-Benzoylamino-^-carboxy-n-butyl, p-Aminobenzyl, o-Aminobenzyl, m-Aminobenzyl, p-Dimethylaminobenzyl, (3-Pyridyl)-methyl, 2-Äthoxy-l-naphthyl, 3-Carboxy-2-chinoxalinyl, 3-(2,6-Dichlorphenyl)-5-(2-furyl)-i}-isoxazolyl, 3-Phenylii-isoxazolyl, S-Methyl-S-C^-guanidinophenyD-^-isoxazolyl, 4-Guanidinomethy!phenyl,. ^-Guanidinomethylbenzyl, ^Il-Guani-' dinobenzyl, 4-Guanidinophenyl, 2,6-Dimethoxy-4-guanidino, o~Sulfobenzyl, p-Carboxymethylbenzyl, p-Carbamoylmethylbenzyl, m-Fluorobenzyl, m-Brombenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Methoxyberizyl, 1-Naphthylmethyl, 3-Isothiazoly!methyl, 4-Isothiazolylmethyl, 5-Isothiazolylmethyl, Guanylthiomethyl, ^-Pyridylmethyl, 5-Isoxazolylrnethyl, 4-Methoxy-5-isoxazolylmethyl, ^-Methyl-S-isoxazolylmethyl, 1-Imidazolylmethyl, 2-Benzofuranylmethyl, 2-Indolylmethyl, 2-Phenylvinyl, 2-Phenyläthynyl, 1-Aminocyclohexyl, 2- und 3-Thienylaminomethyl, 2-(5-Nitrofuranyl)-vinyl, Phenyl, o-Hethoxyphenyl, o-Chlorphenyl, o-Pheny!phenyl, p-Aminomethylbenzyl,

09822/1027

¹⁵⁸¹³¹ .%%.

l-(5-Cyanotriazolyl)-methyl, Di fluorine thy 1, Dichlormethyl, Dibrommethyl, l-(3-Methylimidazolyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Carboxymethylthienyl)-methyl, 2- oder 3-(^- Carbamoylthienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Methylthienyl)-methyl, 2- oder 3-(Methoxythienyl)-methyl, 2-oder 3~ (4-Chlorthienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Sulfothienyl>methyl, 2- oder 3-(5-Carboxythienyl)-methyl, 3-C1,2,5-ThiadiazolyD-methyl, 3~(ⁱt-Methoxy-l_;,2_i5-thiadiazolyl)-methyl, 2-Fury!methyl, 2-(5-Nitrofuryl)-methyl,- 3-Fury!methyl, 2-Thieny!methyl, 3-Thieny!methyl, Tetrazolylmethyl, Benzamidinomethyl und Cyclohexylamidinoniethyl.

Die Acy!gruppe kann auch ein Rest der Formel sein:

Ii
-C(CH₂)_nZR" ,

worin X 0 oder S bedeutet und η 0 bis A ist und Z Sauerstoff-, Schwefel, Carbonyl oder Stickstoff bedeutet und R" die vorstehend angegebene Bedeutung hat. Typische Glieder des Substituenten

die hier erwähnt sein sollen, sind AllylthiomethyI, Phenylthiomethyl, Butylmercaptomethyl, oü-Chlorocrotylmercaptomethy1, Phenoxymethyl, Phenoxyäthyl, Phenoxybutyl, Phenoxybenzyl, Diphenoxymethyl, Dimethylmethox3«iethyl, DimethyIbutoxymethyl, Di ma thy!phenoxymethyl, ^-Guanidinophenoxymethyl, 4-Pyridylthiomethyl, p-(CarboxymethyI)-

70 9 8 22/1027

15813Ϊ

phenoxy methyl, p-CCarboxymethyD-phenylthiomethyl, 2-Thiazolylthiomethyl, p-(SuIfο)-phenoxymathyl_s p-(Carboxymethyl)-phenylthiomethyl,. 2-Pyrimidinylthiomethyl, Phenäthylthiomethyl·, l-(5,6,7,8-Tetrahydronaphthyl)-oxomethyl, N-Methyl-4-pyridylthio, Benzyloxy, Methoxy, Äthoxy, Phenoxy, Phenylthio, Amino, Methylann.no, Dime thy lamino, Pyridiniummethyl, Trimethylammoniummethy 1, · Cyanomethylthio- ■ methyl, Trifluormethylthiomethyl, *!-Pyridyläthyl, ¹I-Pyridylpropyl, ^-Pyridylbutyl, 3-Imidazolyläthyl, 3-Imidazolylpropyl, 3-Imidazolylbutyl, 1-Pyrroloäthyl, 1-Pyrrolopropyl und 1-Pyrrolobutyl.

Alternativ kann die Acy!gruppe ein Rest der Formel

X ,

Il

-C-CHR"

_Rftt

sein, worin R" die oben angegebene Bedeutung hat und R'^M-ein Rest- ist, wie Amino, Hydroxy, Azido, Carbamoyl, Gua- nidino, Amidino, Acyloxy, Halogen, wie Chlor, Fluor, Brom, Jod, SuIfamino, Tetrazolyl, SuIfo, Carboxy, Carbalkoxy, Phosphono und dergleichen. Typische Glieder des Substituenten . .

— CHR" -'
R"« ,

die hier erwähnt sein sollen, sind oC-Aminobenzyl, oCAmino-(2-thienyl)-methyl, ο^·(Με thy lamino) -benzyl, oG-Amin ome thy 1-

- · · 9 -709822/1027

mercaptopropyl, cC-Amino-3- oder -li-chlorbenzyl, . <£-Amino- · 3- oder -4-hydroxybenzyl, cC-Amino-2,4-di.chlorbenzyl, oC-Amino-^-^-dichlorbenzyl, DC-J-oC-Hydroxybenzyl, eC-Carboxybenzyl, oC^Amino-.O-thienylJ-methyl, D(-)-oC-Amino-3- · chlor-4-hydroxybenzyl, drAmino-(cyclohexyl)-methyl,c(r(5-Tetrazolyl)-benzyl, 2-Thienylcarhoxy!methyl, 3-Thienylcarboxymethyl, 2-Purylcarboxymethyl, 3-Purylcarb oxy methyl, oi?-Sulfaminobenzyl, 3-Thienylsulfaminomethyl, of-(N-Methylsulfamino)-benzyl, . D(-)-2-Thienylguanidinomethyl, D( -)-oC- guanidin oben zyl,. oC-Guanylureidobenzyl, oC-Hydroxybenzyl, cG-Azidobenzyl, cC-Fluorbenzyl, ^-(S-Methoxy-l^-oxadiazolyD-aminomethyl, 4-(5-I^/Iethoxy-l,3-oxadiazolyl)-hydroxyrnethyl, 4-(5-Methoxyl,3-sulfadiazolyl)-hydroxyniethyl, il-(5-Chlorthienyl)-aminoiriethyl, 2-(5-Chlorthienyl)-hydroxymethyl, 2-(5-ChlorfchienyD-carboxymethy-l, 3-(l,2-Thiazolyl)-aminoinethyl, 3-(l,2-Thiazolyl)-hydroxymethyl, 3-(l,2-Thiazolyl)-carb oxy methyl, 2-(l,4-Thiazolyl)-aminoinsthyl, 2-(l,4-ThiazolyD-hydroxymethyl, 2-(1,4-Thiazolyl)-carboxymethyl, 2-Benzothienylaminomethyl, 2-Benzothienylhydroxymethyl, 2-Benzothienylcarboxymethyl, cC- SuI fob en zyl, oC-Phosphonobenzyl, οίτ-Diäthylphosphono und oir-Monoäthylphosphono. .

V/eitere interessante Acylreste in dieser Klasse, bei denen X = Sauerstoff ist, sind:

0
-CCHR^IT , .

3 H 3')

worin R und R nachfolgend definiert werden. R bedeutet

Wasserstoff Halogen, wie Chlor, Fluor, Brom, Jod, Amino, Guanidino, Phosphono, Hydroxy, Tetrazolyl, Carboxy, Sulfo oder Sulfamino und R^'bedeutet Phenyl, substituiertes

- 10 -

7098 22/1027

15813Y. . ■

Phenyl, ein mono- oder txicyclisches Heterocyclyl, enthaltend ein oder mehrere Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatome im Ring, wie Furyl, Chinoxalyl, Thienyl, Chinolyl, Chinazolyl, Thiazolyl, Isathiazolyl, Tetra-. zolyl, Oxadiazolyl, Thiadiazolyl und dergleichen, substituierte Heterocyclen, Phenylthio, Phenyloxy, Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, heterocyclische oder substituierte heterocyclische Thiogruppen oder Cyano. Die Substituenten an den Gruppierungen R^ und R können sein Halogen, Carboxymethy1, Guanidino, Guanidinomethyl, Carboxyamidomethyl, Aminoäthyl,- Nitro, Methoxy oder Methyl. Wird' R''¹ ausgepfählt aus der Gruppe, bestehend aus

1)

Wasserstoff,. Hydroxy, Amino oder Carboxy und R ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phenyl oder einem 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring mit ein oder zwei Schwefel-, Sauerstoff- oder Stickstoffneteroatomen, wie Tetrazolyl, Thienyl, Puryl und Phenyl, so sind die folgenden Acylreste typische Beispiele: Phenylacetyl, 3-Bromphenylacetyl, p-AminomethyIphenylaeetyl, ^-Carboxymethylpheny1-acetyl, Jl-CarboxyamidomethyIphenylacetyl, 2-Purylacetyl, 5-Nitro-2-furylacetyl, 3-Furylacetyl, 2-Thienylacetyl, 5-Chlor-2-thienylacetyl, 5-Methoxy-2-thienylacetyl, cC-Guanidino-2-thi eny lacetyl, 3-Thieny lacetyl, 2-(¹J-Me thy 1-thienyD-acetyl, 3~Isothiazolylacetyl, i{-Methoxy-3-isothiazolylacetyl, 4-Isothiazolylacetyl, 3-Methyl-¹t-isothiazolylacetyl, 5-Isothiazolylacetyl, 3-Chlor-5-isothiazolyla.cetyl, 3-Methy 1-1,2,5-oxadiazolylacetyl, 1,2,5-Thiadiazolyl-4-acetyl, 3-Methy1-1,2,5-thiadiazolylacetyl, 3-Chlor-1,2,5-thiadiazolylacetyl, 3-Methoxy-l,2,5-thiadiazoly1-acetyl, Phenylthioacetyl, ¹I-Pyridylthioacety 1, Cyanoacetyl, Ιτ-Tetrazolylacetyl, oC-Fluorphenylacetyl, D-Phenylglycyl, 4-Hydroxy-D-phenylglycyl, 2-Thienylglycyl, 3~Thienylglycyl,

709822/10 27

Phenylmalonyl, 3-Chlorphenylmalonyl, 2-Thienylmalonyl, 3-Thienylmalonyl, oC-Phosph'onopheny !acetyl, cK-Aminocyclo-. hexadienylaeetyl, cs-Sulfaminopheny !acetyl, o^Hydroxyphenylacetyl, cG-Tetrazolylpheny!acetyl und oC-Sulfopheny !acetyl.

Der Acylrest kann auch ausgewählt sein aus Schwefel (I)- und Phosphor (2)-Resten:'

(O)ia
-S-Y

Il

(0)n

worin hinsichtlich 1, m und η gan2;e Zahlen sind, die

ausgewählt sind zwischen 0 und 1 und Y = CP Γ-i !, -N(R") ^

und R"; vrorin !^ausgewählt ist aus Wasserstoff, Alkalikationen und organischen Basen und R" die obengenannte Bedeutung hat, beispielsweise Alkyl, Alkenyl, Aryl und Heteroaryl. Hinsichtlich 2, ist X = O oder ; η = 0 oder 1; und Y* und Y" sind ausgewählt aus den Gruppen, bestehend aus 0 lP, -N(R")₂j R" und ZR", worin alle Symbole die vorher angegebene Bedeutung haben, und beispielsweise. R" und ZR" typischerweise folgende Bedeutung haben: Alkyl, Alkenyl, Aryl, Heteroaryloxy, Y¹ und Y", einschliesslieh der R"-Gruppen, die miteinander verbunden sein können unter Ausbildung von cyclischen Estern, Ester-Amid und Amid-Punktionen. Typische Beispiele für J^ sind N-(Methylsulfonyl)-thienamycin, N-(o-Nitropheny!sulfonyl^thienamycin, R-(p-Chlorphenylsulfinyl)-thienamycin, N.-(o-Nitro-

- 12 _
709822/1027

phenylsulfenyl)-thienamycin, N-Sulfamoy!thienamycin, N-Dimethylsulfamoy!thienamycin und das Natriumsalz von Thienamycin-N-sulfonsäure. Typische Beispiele für 2^. sind N-(Dirnethoxyphosphino)-thienamycin, N-Dibenzyloxyphosphino)-thienamycin, N-(Dihydroxyphosphino)-thienamycindinatriumsalz, N-(Dimethoxyphosphinyl)-thienamycin, N-(Dimethoxyphosphinothioyl)-thienamycin, N-(DibenzyloxyphosphinyD-thienamycin und N-(DihydroxyphosphinyD-thienamycindinatriumsalz.

Eine Acylklasse von besonderem Interesse sind solche

12·

Acylreste, R und R der Struktur II oben, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus üblichen bekannten N-Acyl-Blockierungs- oder Schutzgruppen, wie Carbobenzyloxy, ringsubstituiertes Carbobenzyloxy, wie o- und p-Nitrocarbobenzyloxy,· p-Methoxycarbobenzyloxy, Chloracetyl, Bromacetyl, Phenylacetyl, tert.-Butoxycarbonyl, Trifluoracetyl, Bromäthoxycarbonyl, 9-Pluorenylmethoxyearbonyl, Dichloracetyl, o-Nitrophenylsulfeny1, 2,2,2-Trichloräthoxycarbony1, Brom-tert.-butoxycarbonyl, Phenoxyacetyl; nicht-acylierte Schutzgruppen, v;ie Triniedrigalkylsilyl, beispielsweise Trimethylsilyl und tert.-Butyldimethylsiiyl _{sind auch von} mteresse.

Die folgenden Reste sind in Übereinstimmung mit der vor-

1 2

genannten Definition von Acyl (Reste R und R der Strukturformel II oben) bevorzugt: Formyl, Propionyl, Butyryl, Chloracetyl, Methoxyacetyl, Aminoacetyl, Methoxycarbonyl, Άthoxycarbonyl, Methylcarbamoyl, Äthylcarbamoyl, Phenylthiocarbonyl, 3-Aminopropionyl, iJ-Aminobutyryl, N-Methyl-

- 13 709822/1027

15813Y

aminoacetyl, Ν,Ν-Dimethylarninoacetyl, Ν,Ν,Ν-Trimethylaminoacetyl, 3-(N,N-Dimethyl)-aminopropionyl, 3-(N₉N,N-TrimethyD-aminopropionyl, Ν,Ν,Ν-Triäthylanilnoacetyl, Pyridiniumacetyl, Guanidinoacetyl, 3-Guanidinopropionyl, N -Methylguanidinopropionylj Hydroxyacetyl, 3-Hydroxypropionyl, Acryloyl, Propynoyl, Malonyl, Phenoxycarbonyl, Amidinoacetyl^ Acetamidinoacetyl, Amidinopropionyl, Acetamidinopropionyl, Guanylureidoacetyl, Guanylcarbamoyl, Carboxymethylaminoacetylj Sulfoacetylaminoacetylj Phos-

■z

phonoacetylaininoacetyl, N -Dimethylaminoacetamidinopropionyl, Ureidocarbonyl, Dimethylaminoguanylthioacetyl, 3-(l-Methyl-¹l-pyridinium)-propionyl, 3-(5-Aminoiinidazol~ l-yl)-propionyl, 3-Methyi-l-Imida2oliumacetyl_s 3-Sydnonylacetyl, o-Aminomethylbensoyl, o-Arainobenzoyl, Guanylthioacetyl,

⁰ S S

1! - II f

-P (OCH₃) ₂ , -. "

E ο ο

H i! Il

I-

-P-N(CH₃)

OKa · >

Ϊ09822/1027

Eine besonders bevorzugte Klasse von Acylresten (R und R der Strukturformel II oben) sind endständig substituierte AcyIe, bei denen der Substituent eine basische Gruppe ist, die substituiert oder unsubstituiert sein kann: Amino, Amidino, Guanidino, Guanyl und Stickstoff enthaltende mono- und bicyclische Heterocyclen (aromatisch und nicht-aromatisch), bei denen das Heteroatom oder die Heteroatome zusätzlich zum Stickstoff ausgewählt sind aus Sauerstoff und Schwefel. Solche substituierten AcyIe können durch die folgende Formel:

-C(CH₂)-A-(CH₂)-Y

gekennzeichnet v/erden, worin m und,η ganze Zahlen von 0 bis 5 sind;

A ist O₃ NR¹ (R' ist Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), S oder A ist eine Einfachbindung; und Y ist ausgewählt aus den folgenden Gruppen:

1.) Amino oder substituiertes Amino:

-N(R)₂ und -

worin die Werte für R unabhängig ausgewählt sind,aus: Wasserstoff; N(RM₂ (R¹ ist Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen); Niedrigalkyl und Niedrigalkoxyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; Niedrigalkoxyniedrigalkyl,-worin die Alkoxylgruppel bis 6 Kohlenstoff atome umfasst und die Alky!gruppe 2 bis 6 Kohlenstoffatome hat;

- 15 709822/1027

15813Y« ' '

Cycloalkyl und Cycloalkylalkyl, worin die Cycloalkylgruppe 3 bis 6 Kohlenstoffatoma umfasst und die Alkylgruppe 1 bis 3 Kohlenstoffatome hat, und wobei zwei R Gruppen miteinander verbunden sein können über das N-Atom, an welches sie gebunden sind unter Ausbildung eines Ringes mit 3 bis 6 Atomen.

2.) Amidino und substituiertes Amidino:

-N=C-N(R)₂
R

worin die Werte für R unabhängig voneinander ausgewählt sind aus den Gruppen: Wasserstoff; N(R')p (R' ist Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis β Kohlenstoffatomen); Niedrigalkyl und Niedrigalkoxyl mit 1 bis 6 Kohlenstoff- atomen, Niedrigalkoxyniedrigalkyl, worin die Alkoxy!gruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält und die Alky!gruppe 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthält (falls der Niedrigalkoxyniedrigalkylrest an ein Kohlenstoffatom gebunden ist, umfasst die Alkylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome); Cycloalkyl und Cycloalky lalkyl, worin die Alkylgruppe 1 bis 3 Kohlenstoff atome umfasst; zwei R-Gruppen können miteinander verbunden sein mit dem Atom, an das sie gebunden sind unter Ausbildung eines Ringes mit 3 bis 6 Atomen;

3.) Guanidino und substituiertes Guanidino:

-NH-C-N(R)₂ ,
.NR

worin R' die oben angegebene Definition unter 2. (oben) hat.

- 16 709822/1027

15813Y '

• 34.

4.) Guanyl und substituiertes Guanyl:

-C=NR - , ■■, . ·

N(R)₂

r *

worin R die Definition, wie vorher in 2. (oben) angegeben^

5.) Stickstoff enthaltende mono- und bicyclische Heterocyclyle (aromatisch und nicht-aromatisch) mit 4 bis Kernatomen, worin das Heteroatom oder die Heteroatome ausser Stickstoff ausgewählt sind aus Sauerstoff und Schwefel. Solche Heterocyclyle werden typischerweise illustriert durch die folgende Aufzählung von Resten (R¹ ist H oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen)

- 17 - . 709822/ 1027

£652674

-5-

70 9 82 2/1027

- 18 -

Die folgenden spezifischen Acylreste, die in diese Klasse fallen, sind zusätzlich repräsentativ und v;erden bevorzugt

O ΐ

H I

-CCH

I Γ

-CCH

O KH

Il I

-CCH^CH

II·

-CCH.

Il Θ

-CCH₀CH₀-NiCHj

O NH

Il ι

-CCH„CH„C

O HH

(CH₃)

Il

CCH₀S-C

■II

CCH₀-O-CH₀C

2 2 ν

15813Y * 3Y.

Es versteht sich jedoch, dass jeder Acylrest bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann und in die Erfindung eingeschlossen ist.

Das N-acylierte Zwischenprodukt /1, oben J wird hergestellt, indem man Thienamycin (I) mit einem Acylierungsmittel behandelt, beispielsweise einem Acylhalogenid oder einem Acylanhydrid, wie einem aliphatischen, aromatischen, heterocyclischen, araliphatischen oder heterocyclischen aliphatischen Carbonsäurehalogenid oder -anhydrid. Andere Acylierungsmittel, die auch verwendet werden können, sind beispielsweise gemischte Carbonsäureanhydride und insbesondere Niedrigalky!ester von gemischten Carboxyl-Carbonsäureanhydriden; auch CarboxyIsäureη in,Gegenwart eines Carbodiimids, wie 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid, und ein aktivierter Ester von Carboxylsäuren, wie p-Nitropheny!ester, sind geeignet.

- 20 -

70 9822/1027

Die AcyIierungsreaktion kann durchgeführt werden bei Temperaturen im Bereich von etwa -20 bis etwa 100°C, aber vorzugsweise wendet man Temperaturen an im Bereich von -8°C bis 25°C. Jedes Lösungsmittel, in dem die Reaktanten · löslich sind und das im wesentlichen inert ist, kann verwendet werden, beispielsweise^polare Lösungsmittel, wie Wasser, Alkohole und polare organische Lösungsmittel, im allgemeinen solche, wie Dimethylformamid (DMP), Hexamethylphosphoramid (HMPA), Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran (THP), Acetonitril, heterocyclische Amine, wie Pyridin, Äthylacetat, wässrige Mischungen der vorgenannten, sowie auch halogenierte Lösungsmittel, wie Methylen- ■ chlorid und Chloroform. Die Umsetzung wird eine Zeitlang durchgeführt, die im Bereich von etwa 5 Minuten bis zu einem Maximum von 3 Stunden dauert, aber im allgemeinen reicht eine Reaktionszeit von etwa 0,5 bis etwa 1 Stunde aus. Die folgende Gleichung beschreibt dieses Verfahren unter Verwendung eines Carbonsäurehalogenids; es ist jedoch selbstverständlich, dass man durch Verwendung eines Carbonsäureanhydrids oder eines anderen funktioneilen äquivalenten Aeylierungsmittels gleiche Produkte erhalten kann:

709822/1027

15813Y

OH

COOE Acy !halogenid -x

Im allgemeinenj wenn bei der oben beschriebenen Acylierungsreaktion ein Säurehalogenid (geeignete Halogenide sind Chloride, Jodide oder Bromide) oder ein Säureanhydrid verwendet wird, wird die Umsetzung in Wasser oder einer wässrigen Mischung eines polaren organischen Lösungsmittels, wie Aceton, Dioxan, THF, DMP, Acetonitril und dergleichen in Gegenwart eines geeigneten basichen Akzeptors, wie NaHCO,, MgO, NaOH, K₂HPO₂J und dergleichen vorgenommen.

Beim Durchführen der hier beschriebenen Umsetzung ist es im allgemeinen nicht notwendig, die 2-Carboxygruppe oder die I¹-Hydroxygruppe zu schützen; in den Fällen, in denen das Acylierungsmittel ausserordentlich wasserempfindlich ist, ist es manchmal vorteilhaft, die Acylierung in einem nicht-wässrigen Lösungsmittelsystem vorzunehmen. TriorganosiIyI (oder Zinn)-Derivate des Thienamycins er- * geben schnell die Tris-Triorganosilylderivate, beispielsweise Tris-TrimethylsiIy!thienamycin Th(TMS),:

!Th__

- OTKS HHTMS COOTiIS

- 22 -

709822/1027

15813Y

Diese Derivate, die leicht löslich in organischen Lösungsmitteln sind, werden auf einfache Weise hergestellt, indem man Thienamycin mit einem Überschuss an Hexamethyldisilazan und einer sböchiometrischen Menge von .Trimethylchlorsilan bei 25°C unter kräftigem Rühren unter einer Np-Atmosphäre umsetzt. Das dabei entstehende NH Cl wird durch Zentrifugieren.entfernt und das Lösungsmittel wird durch Verdampfen entfernt, wobei man das gewünschte SiIylderivat erhält.

Bei einer allgemeinen Darstellung der erfindungsgemässen Verbindungen (II oben) kann der Rest, wie er durch -COXR gekennzeichnet ist, alle solche Reste bedeuten, wie sie wirksam sind als pharmazeutisch annehmbare Ester, Anhydride (R = Acyl) oder Amidreste bei den bicyclischen ß-Lactam-Antibiotika, wie etwa den Cephalosporinen und Penicillinen und den Kernanalogen davon.

Geeignete Reste (R) schliessen ein übliche Schutz- oder CarboxyIblockierungsgruppen. Der Ausdruck "Blockierungsgruppe", wie er hier verwendet wird, wird in gleicher Weise verwendet wie gemäss US-PS 3 697 515, die hiermit für Offenbarungszwecke eingeschlossen wird. Pharmazeutisch annehmbare Thienamycinderivate der vorliegenden Erfindung fallen in die unten angegebene Klasse. Geeignete Blockierungsester schliessen hiermit solche ein, wie sie in der nachfolgenden Aufzählung angeführt werden, die repräsentativ ist aber keineswegs eine erschöpfende Aufzählung der möglichen Estergruppierungen, bei denen X=O und R die angegebene Bedeutung hat, darstellt:

709822/1027

15813Y

• 3*.

Ci) R = CR^aR R^c, worin wenigstens eines von R^a, R und R ein Elektronendonor ist, beispielsweise p-Methoxyphenyl, 2,4,6-Trimethylphenyl, 9-Anthryl, Methoxy, CH₂SCH,, Tetrahydrofur-2-yl, Tetrahydropyran-2-yl oder Fur-2-yl. Die restlichen R^a, R^b und R^c-Gruppen können Wasserstoff oder organische Substitutionsgruppen sein. Geeignete Estergruppen dieser Art schliessen ein p-Methoxybenzyloxycarbonyl und 2,4,6-Trimethylbensyloxycarbonyl.

(ii) R ■ = CR^aR^bR^c, worin wenigstens eine der R^a, R^b und R -Gruppen eine Elektronen anziehende Gruppe ist, beispielsweise Benzoyl, p-Nitrophenyl, 4-Pyridyl, Trichlormethyl, Tribrommethyl, Jodomethyl, Cyanonethyl, Äthoxycarbonylmethyl, Arylsulphonylmethyl, 2-Dimethyl— sulphoniumraethyl, o-Nitrophenyl oder Cyano. Geeignete Ester dieser Art schliessen ein Beηζoylmethoxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, 4-PyridylmethoxycarbonyL, 2,2,2-Trichlöräthoxycarbonyl und 2,2,2-Tribromäthoxycarbonyl. .

(iii) R = CR^aR^bR^c, worin wenigstens zwei der R^a,' R^b und R -Reste Kohlenwasserstoffe sind, wie Alkyl, beispieIs-

709822/1027

1.5813Y

weise Methyl oder lthyl oder Aryl, beispielsweise Phenyl und die restliche R^a, R und R^c-6ruppe₃ falls vorhanden, Viasserstoff bedeutet. Geeignete Ester dieser Art schlies sen ein tert.-Butyloxycarbonyl, tert,-Amyloxycarbonyl, . Diphenylme thoxycarbonyl und Triphenylmethoxycarbonyl.

(iv) R- = R , worin R Adamantyl, 2-Benzyloxyphenyl, 4-Methylthiophenyl oder Tetrahydropyran-2-yI. .

SiIy!ester dieser Kategorie von Blockerungsgruppen können in einfacher Weise hergestellt werden aus Halogensilanen oder Silazanen der Formel:

R⁴^SiX'; R^₀SiX' ; R⁴,Si.NR⁴; R⁴ Si.NH.COR⁴.; R%Si.-NH.CO.NH-SiR' ; R TiH.CO.NH*.SiR ,; oder R C(OSiR ,); HM(SiR ,)_o, viorin X^T Halogen, Chlor oder Brom bedeutet und die verschiedenen Gruppen R , die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoffatome oder Alkyl bedeuten, beispielsweise Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl; Aryl, beispielsweise Phenyl; oder Aralkyl, beispielsweise eine Benzy!gruppe.

Allgemeiner gesagt sind pharmazeutisch annehmbare Carboxy1-derivate der vorliegenden Erfindung solche, die sich ableiten, indem man I oder das N-acylierte Thienamycin (1) umsetzt mit Alkoholen, Phenolen, Mercaptanen, Thiophenolen, Acylierungsmitteln und dergleichen, wobei man die Verbindungen II (oben) erhält, welche bio-labil sind für die Umwandlung in die N-Acy!thienamycine (1), die auch als Antibiotika aktiv sind, oder zum Thienamycin selbst.

Beispielsweise sind interessante Ester und Amide der Verbindungen der Formel II (oben) solche,die folgende Gruppen in der 2-Stellung haben: -COXR, worin X Sauerstoff, Schwefel oder NR' (R-^r hat die obengenannte Bedeutung) bedeutet,

- ²⁵ - 709822/1027

und R Alkyl bedeutet mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und zwar geradlinig oder verzweigt, wie Methyl, Äthyl, tert,-Butyl, Pentyl, Decyl und dergleichen; Carbonylmethyl, einschliesslich Phenacyl, p-Bromphenacyl,p-tert.-Butylphenacyl, Acetoxyacetylmethyl, Pivaloxyacetylmethyl, Carboxymethyl und dessen Alkyl- und Arylester, c£-Carboxy-c£-isopropylj Aminoalkyl einschliesslich 2-Methylaminoäthyl, 2-Diäthylaminoäthyl, 2-Acetamidoäthyl_s Phthalimidomethyl, Bernsteinsäureimidomethyl; Alkoxyalkyl, worin der Alkoxyteil 1 bis 10 und vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatome hat und verzweigt, geradkettig oder cyclisch sein kann, und worin der Alkyl-Teil 1 bis β Kohlenstoffatom hat, wie Methoxymethyl, Äthoxymethyl, Isopropoxymethyl, Decyloxymethyl, Kthoxypropyl, Decyloxypentyl, Cyclohexyloxymethyl und dergleichen; Alkanoyloxyalkyl, worin der Alkanoyloxytei.l geradkettig oder verzweigt ist und 1 bis 6 Kohlenstoff atome hat. und der Alkylteil 1 bis 6 Kohlenstoffatome hat, wie Acetoxymethyl, Pivaloyloxymethyl, Acetoxyäthyl, Propionyloxyäthyl, Acetoxypropyl und dergleichen. Halogenalkyl, worin Halogen Chlor, Brom, Fluor oder Jod ist und der Alkylteil geradkettig oder verzweigt ist und 1 bis 6 Kohlenstoffatome hat, beispielsweise 2,2,2-Trichloräthyl, Trifluoräthyl, 2-Brompropyl, Dijodomethyl, 2-Chloräthyl, 2-Bromäthyl und dergleichen; Alkenyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, das entweder geradkettig oder verzweigt ist, beispielsweise Allyl, 2-Propenyl, 3-Butenyl, *I-Butenyl, Jt-PentenyO^-Butenyl, 3-Pentenyl, 3-Meth'yl-3-butenyl, Methallyl, 1,4-Cyclohexadien-l-yl-methyl und dergleichen; Alkynyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, das entweder geradkettig oder verzweigt sein kann, beispielsweise 3-Pentynyl,. Propargyl, Äthynyl, 3-Butyn-l-yi und der-

709822/102 7

15813Y- ·

gleichen; Alkanoyl, das entweder geradkettig oder verzweigt sein kann, mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, wie Pivaloyl, Acetyl, Propionyl und dergleichen; Aralkyl oder Heteroalkyl, worin das Alkyl 1 bis 3 Kohlenstoffatome hat, und Hetero bedeutet, dass 1 bis k Heteroatome vorhanden sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 0, S oder N, wie Benzyl, Benzhydryl und substituiertes Benzyl, Benzhydryl, beispielsweise Benzyl oder Benzhydryl, substituiert mit 1 bis 3 Substituenten, wie Benzyl, Phenoxy, Halogen, Niedrigalkyl, Niedrigalkanoyloxy mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Niedrigalkoxy, Hydroxy, Nitro, blockiertes Carboxy oder Kombinationen davon, beispielsweise p-Chlorbenzyl, o-Nitrobenzyl, 3,5-Dinitrobenzyl, p-Methoxybenzyl, m-Benzoylbenzyl, p-tert.-Butylbenzyl, m-Phenoxybenzyl, p-Benzoylbenzyl, p-Nitrobenzyl, 3>5~Dichlor-ⁱi-hydroxybenzyl, p~Methoxyearbonylbenzyl, p-Methoxybenzhydryl, p-Carboxybenzyl, xirobei das letztere entv;eder als freie Säure, als Ester oder als . ·

Natriumsalz vorliegt, 2,4,6-Trimethylbenzyl, p-Pivaloyloxybenzyl, p-tert.-Butoxycarbonylbenzyl, p-Methylbenzyl, p-Benzoyloxybenzyl, p-Acetoxybenzyl, p-2-Äthylhexanoylbenzoyl, p-Äthoxycarbonylbenzyl, p-Benzoylthiobenzyl, p-Benzamido- ' benzyl, o-Pivaloyloxybenzyl, m-Pivaloyloxybenzyl, p-Isopropoxybenzyl, p-tert.-Butoxybenzyl sowie auch 'die cyclischen Analoge davon, 2,2-Dimethyl-5-cumaranmethyl, 5-Indanylmethyl, p-Trimethylsilylbenzyl, 3,5-Bis-t-butoxy-i{-hydroxybenzyl; 2-Thienylmethyl, 2-Furylmethyl, 3-tert.-Butyl-5-isothiazolmethyl, 6-Pivaloyloxy-3-pyridazinyläthyl, 5-Phenylthio-ltetrazolylmethyl oder dergleichen (i^obei der Ausdruck Niedrigalkyl oder Niedrigalkoxy in diesem Zusammenhang eine Kette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet); oder Phthalidyl; oder Phenyläthyl, 2-(p-Methylphenyl)-äthyl und die

- 27 -

709822/1027

15813Y

Arylthioalky!analoge, Aryloxyalkyl, worin Aryl vorzugsweise ein Phenylring ist mit 0 bis 3 Substituenten, vorzugsweise 0 oder 1 Substituenten in der ortho- oder paraStellung und das Alkyl 1 bis 6 Kohlenstoffatome hat, beispielsweise (4-Me'thoxy)-phenoxymethyl, Phenoxymethyl,
(4-Chlor)-phenoxymethyl, (.4-Ni tro)-phenoxymethyl,

(4-Benzyloxy)-phenoxymethyl, (¹J-Methy 1)-phenoxymethyl,
(2-Methoxy)-phenoxymethyl, (l-Phenoxy)-äthyl, (4-Amino)-phenoxymethyl, (4-Methoxy)-phenylthiomethyl, (4-Chlor)-phenylthiomethyl, Phenylthioäthyl; Aryl, vorin Aryl Phenyl, 5-Indanyl oder substituiertes Phenyl mit 0 bis 3 Substituenten, vorzugsweise 0 bis 1 Substituenten in der ortho- oder para-Stellung bedeutet, beispielsweise (4-Methyl)-phenyl, (¹I-Hydroxy)-phenyl, (4-tert.-Butyl)-phenyl, p-Nitrophenyl, 3,5-Dinitrophenyl oder p-Carboxyphenyl, wobei das letztere entweder als freie Säure oder als Natriumsalz vorliegt jAralkenyl, worin Aryl Phenyl oder Alkenyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, wie 3-Phenyl-2-propenyl;
Aralkoxyalkyl, worin Aralkoxy Benzyloxy ist und das Alkyl 1 bis 3 Kohlenstoff atome hat, wie Benzyloxymethyl, (ii-Nitro)-benzyloxymethyl, (4-Chlor)-benzyloxymethyl; Alkylthioalkyl, v;orin der Alkylthioteil 1 bis 10 und vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoff atome hat, das aber verzweigt, geradkettig oder cyclisch sein kann und der Alkylteil 1 bis 6 Kohlenstoffatome hat, wie Methylthioäthyl, Äthylthioäthyl, Cyelohexylthiomethyl, Decylthiobutyl, Methylthiopropyl, Isopropylthioäthyl, Methylthiobutyl und dergleichen..

- 28 -

709822/1027

■1(1.

Alkoxycarbonyloxymethyl, Dialkylaminoacetoxymethyl und Alkanoylamidomethyl, worin die Alkylgruppen der letzten drei erwähnten Reste jeweils 1 bis 6 Kohlenstoffatome umfassen.

Zusätzlich zu den Estern(und Thioestern), die oben angeführt sind., werden ebenfalls Amide von der vorliegenden Erfindung umfasst, bei denen X

R'
eine -H- Gruppe ist. Typische Beispiele für solche Amide sind solche, worin R' ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Äthyl, Phenyl, p-Methoxyphenyl, Benzyl, Carboxymethyl, Methylthioäthyl und Heteroaryl; in die Gruppierung -COXR eingeschlossen sind auch Anhydride, bei denen R Benzyloxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, Benzoyl und Pivaloyl bedeutet.

Besonders bevorzugte Ester sind solche, in denen X Sauerstoff, Schwefel oder NR^f (R' = Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen) bedeutet und R die Bedeutung hat Aralkyl, Aryloxyalkyl, Aralkoxyalkyl, Alkylthioalkyl, Halogenalkyl und Alkenyl.

Die am meisten bevorzugten Verbindungen, der vorliegenden Erfindung sind solche, bei denen (in Bezug auf die Struktur II, oben) X Sauerstoff bedeutet und R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Niedrigalkyl, Niedrigalkenyl, wie Methallyl, 3-Methylbutenyl, 3-Butenyl und dergleichen; Methylthioäthyl, Benzyl und substituiertes Benzyl, wie p-tert.-Butylbenzyl, m-Phenoxybenzyl, p-Pivaloyloxybenzyl, p-Nitrobenzyl und dergleichen; Pivaloyloxymethyl, 3-Phthalidyl, Acetoxymethyl, Propionyloxymethyl, Acetylthiomethyl,

- 29 -

709822/1027

• ft-

Pivaloylthiomethyl, Allyl, 4-Pentenyl, 2-Butenyl, 3~Methyl-2-butenyl, Phenacyl, Acetoxyacetylmethyl, Pivaloylacetylmethyl, Diäthylaminoäthyl, Dimethylaminoäthyl, Methoxymethyl, p-Acetoxybenzyl, p-Pivaloyloxybenzyl, p-Isopropoxybenzyl, 5-Indanylmethyl, 5-Indanyl, Benzyloxymethyl, Äthylthioäthyl, Methylthiopropyl, Methoxycarbonyloxymethyl₅ Άthoxycarbonyloxymethyl, Dimethylaminoacetoxymethyl, Crotonlacton-3-yl und Acetamidomethyl.

Die bevorzugten N-Blockierungsgruppen für die Ausgangsverbindungen 1 sind: Carbobenzyloxy, ringsubstituiertes Carbobenzyloxy, wie ο- und p-Nitrocarbobenzyloxy, p-Methoxycarbobenzyloxy, Chloracetyl, Bromacetyl, Pheny!acetyl, t-Butoxycarbonyl_s Trifluoracetyl, Bromäthoxycarbonyl, 9-Pluorenylmethoxycarbonyl, Dichloracetyl, o-Nitrophenylsulfenyl, 2,2,2-Trichloräthoxycarbonyl, Brom-tert.-butoxycarbonylj Phenoxyacetyl; nicht-acylierte Schutzgruppen, wie Alkylidene_s .beispielsxYeise Benzyliden und.SaIicyIiden sind gleichfalls von Interesse»

Wie vorher festgestellt werden die erfindungsgemässen Verbindungen (II, oben) nach dem folgenden Schema hergestellt:

~0H

¹R²

Th-J-NR¹R² — > Th ..-NR¹R

-COOH ' · LCOXR

1 - II

¹R²

- 30 -

709822/1027

15813Y

•ν» ·

worin alle Symbole die vorher angegebene Bedeutung haben und die N-acylierten Ausgangsverbindungen I₁ vollständig beschrieben sind in der US-Patentanmeldung Serial No. 634 291 vom 21. November 1975, welche das interne Aktenzeichen 15775Y hat. Diese Anmeldung wird hiermit zu Offenbarungszwecken für die Herstellung von 1 in die Erfindung mit einbezogen.

Im allgemeinen wird der übergang (1—>II) gemäss der vorliegenden Erfindung nach bekannten Verfahrensweisen vorgenommen. Solche Verfahren schliessen ein:

1.) Umsetzung von 1 mit einem Diazoalkan, wie Diazomethan, Pheny!diazomethan, Dipheny!diazomethan, und. dergleichen in einem Lösungsmittel, wie Dioxan, Äthylacetat, Acetonitril und dergleichen, bei Temperaturen zwischen O⁰C und Rückfluss für eine Zeitdauer von wenigen Minuten bis 2 Stunden.

2.) Umsetzung eines Alkalisalzes von 1 irrit einem aktivierten Alkylhalogenid, wie Methyljodid,, Benzylbromid oder m-Phenoxybenzylbromid, p-tert.-Butylbensylbromid, Pivaloyloxymethylchlorid und dergleichen. Geeignete Reaktionsbedingungen schliessen Lösungsmittel, wie Hexamethylphosphoramid und dergleichen sowie Temperaturen von O⁰C bis 6O⁰C während eines Zeitraumes von wenigen Minuten bis zu k Stunden ein.

- 31 -

70 9 8 22/1027

3. ) Umsetzung von ^l mit einem Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Benzylalkohol und dergleichen. Diese Umsetzung kann durchgeführt werden in Gegenwart eines Carbodiimidkondensierungsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid und dergleichen. Geeignete Lösungsmittel bei Temperaturen zwischen 0 C und der Rückflusstemperatur und Reaktionszeiten von 15 Minuten bis 13 Stunden schliessen ein CHCl,, CH₃CH, CH₂Cl₂ und dergleichen.

k.) Umsetzung von einem N-acylierten Säureanhydrid von ^ hergestellt durch Umsetzung der freien Säure 1 mit einem Säurechlorid, wie Äthylchlorformat, Benzylchlorformat und dergleichen, mit einem Alkohol, wie den unter 3·) aufgezählten, unter den gleichen Reaktionsbedingungen wie unter 3.) genannt. Das Anhydrid wird hergestellt durch Umsetzung von III/und dem Säurechlorid in einem Lösungsmittel, wie Tetrahydrofuran (THP), CH₃Cl₂ und dergleichen, bei Temperaturen von 25°C bis zur Rückflusstemperatur während 15 Minuten bis 10 Stunden.

5·) Umsetzung von labilen Estern von Thienamycin I, wie Trimethylsilylester, Dimethyl-tert.-butylsilylester oder dergleichen mit RX', worin X^f Halogen ist, wie Brom oder Chlor, und R die vorher angegebene Bedeutung-hat, in einem Lösungsmittel, wie THP, CH₂Cl₂ und dergleichen bei Temperaturen und Rückfluss vrährend 15 Minuten bis 16 Stunden. Diese Umsetzung erfolgt beispielsweise nach dem folgenden Schema:

- 32 -

70 9 8 22/1027

15813Y

-OTMS
Th-NHTMS N-AcyUenms»

• -COOTMS
2

milde Hydrolyse'

OTHS 2

Veresterung... _Th

-NR TMS

-COOK

T-OH

Th.

-NHR

LjCOOR

worin TMS Triorganosilyl, wie Trimethylsilyl, bedeutet und alle anderen Symbole die vorher angegebene Bedeutung haben. . '

Die Amide der vorliegenden Erfindung werden in einfacher Weise hergestellt durch Umsetzung des Säureanhydrids von II (X= O; R = Aeyl) mit Ammoniak oder mit dem ausgewählten Amin, beispielsweise den vorher genannten Alkyl-₉ Dialkyl-_s Äralkyl- oder heterocyclischen Aminen,,

Die vorher wiedergegebenen Schemata für die Veresterung sind bekannt bei den verwandten bicyclischen ß-Lactamantibiotika und allgemein bei organischen Synthesen und es soll hier festgestellt werden, dass keine besonderen kritischen Bedingungen hinsichtlich der Reaktionsparameter bei der Herstellung der erfindungsgemässen N-acylierten, Carboxylderivate (II) erforderlich sind.

Es soll hier nochmals festgestellt werden, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können, indem man die N-Acylsubstituenten aus den vorgebildeten Estern bildet:

- 33 -

709822/1027

15813Y

ΌΗ Th-NH

-COOH

Th--1

ΓΟΗ •ΝΗ.

2 -COXR

Th--

-OH

-NR¹R²

L-COXR

Die erfindungsgemässen Verbindungen sind auch geeignet zur Herstellung von anderen Thienamycinderivaten 3 und die als Antibiotika geeignet sind:

SCH₂CH₂NH₂ COOH

COXR

3.

3 3 '

worin bedeuten: R einen Äther (R ist R oder wird durch

1 2

Acylreste R und R definiert, worin die Carbonylgruppe

0 X
it η

-C- oder, allgemeiner gesagt, -C-, fortgelassen ist) oder eine Estergruppe (R wird definiert durch die Acylreste

1 2 1 R und R ) (siehe die vorher angegebene Definition von R ,

2
R und R in Bezug auf die Verbindungen II der vorliegenden Erfindung). Alle anderen Symbole sind vorher angegeben. Die Verbindungen 3 sind vollständig beschrieben in der US-Patentanmeldung Serial No. 634 298 vom 21. November 1975 und den entsprechenden Continuation-in-part-Anme!düngen, die entsprechen der Patentanmeldung mit der internen Nummer 1582IY. Diese Anmeldungen werden hiermit aus Gründen der Offenbarung einbezogen, weil sie die Verwendbarkeit der erfindungsgemässen Verbindungen als Zwischenprodukte für die Herstellung- von 3 belegen. Die Verbindungen 4 sind voll-

709822/1027

ständig beschrieben in der US-Patentanmeldung Serial No. 634 294 vom 21. November 1975, welche das interne Aktenzeichen 15822Y trägt. Auch diese Anmeldung wird vollständig für Offenbarungszwecke hier einbezogen, weil sie die Brauchbarkeit der erfindungsgemassen Verbindungen zur Herstellung von 4^ beschreibt.

Die Verbindungen 3 und 4 werden in einfacher-Weise hergestellt aus II, oben, nach dem folgenden Schema:

SCH₀CH₀NR¹R² _ ... .

2 2 ·. Entblockung

COXR ' > ^ > ^,

II

worin X vorzugsweise Sauerstoff ist und entweder R oder

R Wasserstoff bedeuten. Wenn die Herstellung von 3 erwünscht ist, wird R ausgewählt aus einer der obengenannten

1 2

CarboxyIblockierungs- oder -schutzgruppen und R und R werden ausgewählt aus einfach entfernbaren N-Blockierungs- oder Schutzgruppen, wie Carbobenzyloxy, ringsubstituiertes Carbobenzyloxy, wie o- und p-Nitrocarbobenzyloxy, p-Methoxycarbobenzyloxy, Chloracetyl, Bromacetyl, Phenylacetyl, tert.-Butoxycarbonyl, Trifluoracetyl, Bromäthoxycarbonyl, 9~5^lluorenylmethoxycarbonyl, Dichloracetyl, o-Nitrophenylsulfenyl, 2,2,2-Trichloräthoxycarbonyl, Bromtert.-butoxycarbonyl, Phenoxyacetyl. Nicht-acylierte Schutzgruppen, wie Triniedrigalkylsifcrl, beispielsweise Trimethylsilyl und tert.-Butyldimethylsilyl sind auch von Interesse. In diesem Zusammenhang schliessen bevorzugte Carboxylblockierungsgruppen R solche Untergruppen ein, die vorher

-35- 70 9 822/1027

definiert wurden, wie Aralkyl, Halogenalkyl, Alkanoyloxyalkyl, Alkoxyalkyl, Alkenyl, substituiertes Alkyl, oder Aralkoxyalkyl und schliessen auch ein Alkylsilyl, worin Alkyl 1 bis 10 Kohlenstoffatome hat. Beispielsweise schliessen geeignete R-"Blockierungsgruppen"ein Benzyl, Phenacyl, p-Nitrobenzyl, Methoxymethyl, Trichloräthyl, Trimethylsilyl, Tributylzinn, p-Methoxybenzyl und Benzhydryl. Diese Blockierungsgruppen werden bevorzugt, weil sie im allgemeinen als leicht entfernbare Blockierungsgruppen bei den Cephalosporinen und Penicillinen bekannt sind.

Die Entblockierung k—^3 wird vorzugsweise durchgeführt in einer einzigen Stufe nach bekannten Verfahren; es ist

1 jedoch häufig in Abhängigkeit von der Identität von R /R und R wünschenswert, die Entblockung in getrennten Stufen vorzunehmen. Das am meisten bevorzugte Entblockungsverfahren ist die Hydrierung, bei weIcher die zu entblockende Verbindung in einem Lösungsmittel, wie einem Niedrigalkanol, in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators, wie Pt, Pd oder Oxiden davon, hydriert wird.

Im allgemeinen werden die Verbindungen 3 und k hergestellt nach einer Vielzahl von bekannten Veresterungs- oder Ver ätherungsverfahren (II—>4) an der sekundären Alkoholgruppe des Thienamycins in seiner geschützten Form II. Solche Verfahren (II—^U) schliessen ein:

1. ) Für die Herstellung der Ätherausführungsformen wird die säurekatalysierte Reaktion von II durchgeführt mit einem Diazoalkan, wie einem Diazomethan,

- 36 - 709322/1027

Pheny!diazomethan, Dipheny!diazomethan und dergleichen in einem inerten Lösungsmittel, wie Dioxan, Tetrahydrofuran (THF)₅.Halogenkohlenwasserstoffen ₃ wie CH₂Cl₂, Äthylacetat und dergleichen in Gegenwart einer katalytischen Menge einer starken Säure oder Lewis-Säure, wie Toluolsulfonsäure, Trifluoressigsäure, Fluoroorsäure, Bortrifluorid und dergleichen, bei Temperaturen zvxischen -78°C und 25°C während einiger Minuten bis 2 Stunden.

2.) Für die Herstellung der Äther-Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird die Umsetzung von II mit " einem Älkylierungsmittel durchgeführt, wie einem aktiven Halogenid, beispielsweise MethyIjodid, Benzylbromid, m-Phenoxybenzylbromid und dergleichen; Alkylsulfate, wie Dimethylsulfat, Diäthy!sulfat, Methylfluorsulf onat und dergleichen, in Gegenwart einer starken Base, die in .· der Lage ist, ein Alkohοlatanion von II zu bilden. Geeignete Basen schliessen ein Alkali- und Erdalkalioxide und -hydroxide, Alkalialkoxide, wie Kalium-tert.-butoxid, tert. Amine, wie· Triethylamin, Alkalialkyle und -aryle, wie Phenyllithium, und Alkaliamide, wie Natriumamid. Geeignete Lösungsmittel schliessen ein inerte wasserfreie Lösungsmittel, wie tert.-Butanol, Dimethylformamid (DMF), THF, HexamethyIphosphoramid (HMPA), Dioxan und dergleichen, bei Temperaturen von -78⁰C bis 25°C während eines Zeitraumes von wenigen Minuten bis H Stunden.

709822/1027 - 37 -

15813Y .

3.) Für die Herstellung der Ester-Aus fiihrungs formen der vorliegenden Erfindung findet die Umsetzung von Unit irgendeinem der vorher aufgeführten Acylreste in ihrer Säureform statt. Diese Umsetzung kann durchgeführt werden in Gegenwart eines'Carbodiimid-Kondensierungsmittels, wie einem Dicyclonexylcarbodiimid und dergleichen. Geeignete Lösungsmittel schliessen ein inerte Lösungsmittel, wie CHCl,_s CHpCl-, DMP₉ HMPA, Aceton, Dioxan und dergleichen, bei Temperaturen von 0 C bis 60 C während eines Zeitraums VOn₁ JL5 Minuten bis 12 Stunden. _ ^

1}.) Für die Herstellung der Esterausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird II mit einem Acy!halogenid oder einem Säureanhydrid umgesetzt, wobei die Acy!gruppen vorher beschrieben ttfurde~ Im allgemeinen verwendet man bei der vorher erwähnten Acylierungsreaktion ein Säurehalogenid (geeignete Halogenide sind Chloride, Jodide oder Bromide oder Säureanhydride) und die Umsetzung wird in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Dioxan, Methylenchlorid, Chloroform, DMF oder dergleichen, in Gegenwart eines geeigneten basischen Akzeptors, wie NaHCO,, MgO, Triäthylen, Pyridin und dergleichen, bei Temperaturen zwischen 0°C bis 40⁰C während einer Stunde bis *l Stunden vorgenommen. .

_ ₃₈ _.709822/1027

15813Y

Geeignete Aeylhalogenide und -anhydride schliessen ein: Essigsäureänhydrid, Bromessigsäureanhydrid, Propionanhydrid> Benzoylchlorid, Phenylacetylchlorid, Azidoacetylchlorid, 2-Thienylacetylchlorid, 2-, 3- und ^-Nicotinylchlorid, p-Nitrobenzoylchlorid, 2,6-Dimethoxybenzoylchlorid, k-Guanidinophenylacetylchlorid, Hydrochlorid, Methansulfonylchlorid, Dibenzylphosphorchlorxdat, Dimethylthiophosphorchloridat, 2-Furoyläthylcarbonsaureanhydrid, Methylchlorformat, Bis-(p-Nitrobenzyl)-phosphorchloridat und dergleichen.

5.) Für die Herstellung der Ester-Ausführung?formen der vorliegenden Erfindung wird II umgesetzt mit einem geeigneten substituierten Keten oder Isocyanat, wie Keten, Dimethylketen, Methylisocyanat, Methylisothiocyanat, Chlorsulf onylisocyanat und dergleichen. Geeignete Lösungsmittel schliessen ein Dioxan, Tetrahydrofuran, Chloroform und dergleichen, bei Temperaturen von -70⁰C bis 60°C während eines Zeitraumes von 15 Minuten bis 18 Stunden.

709822/1027 - 39 -

15813Y

Die neuen Verbindungen sind neue wertvolle Antibiotika, die aktiv sind gegen verschiedene gram-positive und gramnegative Bakterien und die deshalb in der Human- und Veterinärmedizin Verwendung finden.Die Verbindungen der Erfindung können deshalb als antibakterielle Arzneimittel für.die Behandlung von Infektionen verwendet werden, die durch gram-positive und gram-negative Bakterien verursacht werden, beispielsweise gegen Staphylococcus aureus,Escherischia coli, Klebsiella pneumoniae, Bacillus subtilis, Salmonella typhos a , Pseudomonas und'Bacterium proteus. Die erfindungsgemässen Bakterizide können weiterhin verwendet werden als Additive für Futtermittel und zum Konservieren von Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel. Sie können beispielsweise in wässrigen Zusammensetzungen in Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 100 Teile des Antibiotikums pro Million Teile Lösung verwendet werden, um das Wachstum von schädlichen Bakterien auf medizinischen und dentaltechnischen Ausrüstungen zu zerstören oder zu inhibieren und auch als Bakterizide bei industriellen Anwendungen, beispielsweise bei auf Wasser aufgebauten Anstrichmitteln, beim Weißwasser von Papiermühlen, um das Wachstum von schädlichen Bakterien zu inhibieren.

Die erfindungsgemässen Produkte können allein verwendet werden oder in Kombination mit aktiven Bestandteilen In einer· Vielzahl von pharmazeutischen Zubereitungen. Diese Antibiotika und ihre entsprechenden Salze können in Form von Kapseln oder als Tabletten, als Pulver oder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen und Elexiere verwendet werden. Sie können oral, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden.

Solche pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzungen"können in aus dem Stand der Technik bekannter Weise hergestellt

werden. ·

- iio - 709822/1027

Die Zusammensetzungen werden vorzugsweise in einer solchen Form zubereitet, dass sie im Magen-Darm-Kanal absorbiert vrerden. Tabletten und Kapseln für eine orale Verabreichung können in Einzeldosierungsform vorliegen und können übliehe Excipientien, wie Bindemittel, enthalten, beispielsweise Sirup, Gummi arabicum, Gelatine, Sorbose, Traganth oder Polyvinylpyrrolidon; Füllstoffe, beispielsweise Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbose oder Gylcerin; Schmiermittel, beispielsweise Magnesiumstearat, Talkum, Polyäthylenglykol, Siliciumdioxid; Zerfallmittel, beispielsweise Kartoffelstärke oder geeignete Befeuchtungsmittel, wie Natriumlaurylsulfat. Die Tabletten können.in bekannter Weise beschichtet werden. Orale flüssige Präparationen können in Form von wässrigen oder öligen Suspensionen» Lösungen, Emulsionen, Sirupen, Elixieren und dergleichen vorliegen oder können als trockenes Produkt hergestellt werden, damit sie dann mit Wasser oder einem anderen ' geeigneten Trägermaterial vor ihrer Verwendung angemacht vrerden können- Solche flüssigen Zubereitungen können übliche Additive, wie Suspensionsmittel, beispielsweise Sorbose, Sirup, Me thy!cellulose, Glukose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxyäthylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel oder hydrierte essbare öle enthalten, beispielsweise Mandelöl, fraktioniertes Kokosnussöl, ölester, Propylenglykol oder Äthylalkohol enthalten; Konservierungsmittel, beispielsweise Methyl- oder Propylp-hydroxybenzoat oder Sorbinsäure. Suppositorien enthalten die üblichen hierfür geeigneten Substanzen, beispielsweise Kakaobutter oder andere Glyceride.

709822/1027

- "in -

Zusammensetzungen für Injektionen können in Einzeldosierungen in Form von Ampullen hergestellt werden oder in Behältern mit zugesetzten Konservierungsmitteln für Mehrfachdosierungen. Die Zusammensetzungen können in Form von Suspensionen Lösungen oder Emulsionen in Öl oder wässrigen Trägermaterialien und sie können Formulierungsmittel, wie Suspensionsmittel, Stabilisierungsmittel und/ oder Dispergiermittel enthalten. Alternativ können die aktiven Beatandteile in Form von Pulver-vorliegen, damit sie mit einem geeigneten Trägermaterial, beispielsweise sterilem, keimfreien Wasser vor der Anwendung angemacht werden können.

Die Zusammensetzungen können auch in geeigneten Formen für die Absorption zubereitet v/erden durch die Schleim-· häute der Nase und das Hals- und Bronchialgewebe und sie können in einfacher Weise auch in Form von pulvrigen oder flüssigen Sprays für Inhalationen zubereitet werden, oder in Form von Pastillen oder Zubereitungen für Halspinselung. Für die medizinische Anwendung an den Augen oder Ohren können die Zubereitungen als besondere Kapseln in flüssiger oder halbflüssiger Form vorliegen oder sie können als Tropfen und dergleichen verwendet werden. Für topische Anwendungen kann man hydrophobe oder.hydrophile Basen als Salben, Cremes, Lotionen, Salbungsmittel oder Pulver formulieren. ·

Ausser einem Trägermaterial können die erfindungsgemässen Zusammensetzungen auch weitere Bestandteile, wie Stabilisatoren, Bindemittels Antioxidantien, Konservierungsmittel, Schmiermittel, Suspensionsmittel, Viskositätsmittel oder Geschmacksstoffe und dergleichen enthalten. Darüberhinaus können in<fen Zusammensetzungen auch andere aktive Bestandteile vorhanden sein, um ein breiteres Spektrum der antibiotischen Aktivität zu bewirken.

709822/1027

15813Y .Λ

Für die Veterinärmedizin können die Zusammensetzungen beispielsxieise als innerhalb der Brust einlegbare Zubereitungen mit einer enttfeder schnellen, oder langsamen Abgabewirkung formuliert werden.

Die zu verabreichenden Dosierungen hängen zu einem erheblichen Teil von dem Zustand des behandelten Patienten ab und von dem Gewicht des Patienten, der Verabreichungsroute und der Häufigkeit der Verabreichung, wobei die parenterale Route für allgemeine Infektionen bevorzugt wird und die orale Route für Infektionen der Eingeweide. Im allgemeinen enthält eine tägliche orale Dosierung etwa 15 bis etwa 600 mg aktiven Bestandteil pro kg Körpergewicht des Patienten bei einer oder mehreren Verabreichungen pro Tag. Eine bevorzugte tägliche Dosierung für Erwachsene liegt im Bereich von etwa. 80 bis 120 mg an aktivem Bestandteil pro kg Körpergewicht.

Die vorliegenden Zusammensetzungen können in verschiedenen Einzeldosierungsformen verabreicht werden, beispielsweise in festen oder in flüssigen oral aufnehmbaren Dosierixngsformen. Die Zusammensetzungen pro Einzeldosierung, ob sie flüssig oder fest ist, soll etwa 0,1 % bis 99 % an aktivem Material enthalten, wobei der bevorzugte Bereich zwischen etwa 10 und 60 % liegt. Die Zusammensetzungen enthalten im allgemeinen etwa 15 mg bis etwa 15ΟΟ mg an aktivem Bestandteil; im allgemeinen ist e3 jedoch bevorzugt, eine Dosierungsmenge im Bereich von etwa 250 bis 1000 mg zu verwenden. Bei einer parenteralen Verabreichung ist die Einzeldosierung im allgemeinen die reine Verbindung in einer leicht angesäuerten wässrigen sterilen Lösung oder in Form eines löslichen Pulvers, das zum Auflösen bestimmt ist.

709822/1027 - 113 -

Die nachstehenden Beispiele sollen die Verbindungen, das Verfahren und die Arzneimittel der Erfindung näher erlaubtem; sie sind jedoch nicht im einschränkenden Sinne aufzufassen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden durch die vorgenannte allgemeine Formel

-OH

Th--NR¹R²

-COXR

deren 3 funktioneile Reste vorstehend definiert wurden, dargestellt.

Beispiel 1

ΓΟΗ

TlH-NH-C-CH-/""^ ff t \—/ O O

CHO
LCOONa

Herstellung von N-CO-Formylj-D-mandeloylthienamycin-Natriumsalz 40 mg Thienamycin in 10 ml Wasser werden bei O C nacheinander mit 124 mg Natriumbicarbonat, 8 ml Dioxan und danach unter Rühren mit 1,2 Äquivalenten IT-(0-Formyl)-1-mandeloylchlorid innerhalb von 1 Minute versetzt. Nach 6 Minuten langer Gesamtreaktionsdauer extrahiert man das Gemisch dreimal mit kaltem Diäthyläther. Die Elektrophorese eines wäßrigen Anteils (0,05 m wäßriger Phosphatpuffer, pH 7, 50 V/cm, 20 Min.) ergibt einen Umwandlungsgrad zum gewünschten Produkt von 67 ^. Jüan stellt den pH-Wert mit 1 m Phosphorsäure auf 2,2 ein und extrahiert die Lösung danach dreimal mit Äthylacetat. Die erhaltene Äthylacetatlösung wird über Magnesiumsulfat getrocknet und zweimal mit Natriumbicarbonatlösung (jeweils 2 Äquivalente NaHCO ^) extrahiert. Der wäßrige Extrakt ergibt nach Gefriertrocknung bei der UV-Analyse (pH 7,0) 164 optische Dichteeinheiten (ODU) bei 302 mn, wovon nach einstündiger Behandlung mit Hydroxylamin 95 io ausgelöscht werden. Die Ausbeute beträgt 53 ^. Die in der vorgenannten V/eise vorgenommene Elektrophorese ergibt

709822/1027

einen durch den Bio autograph bestimmten Fleck, der um 4 cm in Richtung der Anode verschoben ist; Kernresonanz NMR (S D₂O) 1,30 Cd, J= 6 Hz, CH₃CH); 2,8 bis 3,7 (m, CH₂), 4,0 bis 4,5 (m, CH ß-Lactam), 77^3, HDO; 5,97 (s, C₆H₅CHOCHO), 7,53 (s, C₅H₅), 8,30 (s, C₆H₅CHOCHO).

Beispiel 2

L-COONa

Herstellung; von IT-D-Mandeloylthienamycin-Natriumsalz Man stellt die gewünschte Verbindung gemäß Beispiel 1 her, wobei man jedoch den wäßrigen Extrakt vor der Extraktion mit Äthylacetat 1 Stunde bei 25°C stehen läßt. Die Elektrophorese (50 V/cm, 20 Min., 0,05 m wäßriges Phosphat, pH 7) ergibt einen durch den Bioautogräph bestimmten Fleck, der 4 cm in Richtung der Anode verschoben ist; HMR (S, D₂O) 1,50 (d, J=6 Hz, CH₃CH); 2,8 bis 3,8 (m, CH₂), 4,2 bis 4,6 (m, CH ß-LactamTT4,96 (s, HDO); 5,40 (s, C₆H₅CH).

Beispiel 3 N-Propionylthienamycin-Natriumsalz

25 mg Thienamycin in 6 ml Wasser werden bei O⁰C nacheinander mit 38,6 mg Ifatriumbicarbonat, 5 ml Dioxan und danach unter Rühren mit 1 Äquivalent Propionsäureanhydrid innerhalb von 3 Min. versetzt. Nach 10 Min. extrahiert man das Gemisch dreimal mit kaltem Diäthyläther. Die Elektrophorese des wäßrigen Extrakts (0,05 m Phosphatpuffer, pH 7, 50 V/cm, 20 Min.) ergibt, daß kein freies Thienamycin vorhanden ist. Man stellt den wäßrigen Extrakt auf einen pH-Wert von 6,8 ein; die UV-Analyse ergibt 600 ODU bei 302 nm, wovon 95 % nach einstün-

709822/1027

15813Y

.diger Behandlung mit Hydroxylamin ausgelöscht werden; NMR (S₁ D₂O) 1,42 (m, CH₂CH₃, CH₃CH); 2,48 (q, CH₂CH₃); 2,86 Ms

2,90 (m, CH₂), 4,30 bis 4,70 (m, CH ß-Lactam), 4,86 (HEO).

Beispiel 4

N-(Methoxyacetyl)-thienamycin-Natriumsalz

55 mg Thienamycin in 6 ml Wasser werden bei O⁰C nacheinander mit 68 mg Natriumbicarbonat, 6 ml Dioxan und danach unter Rühren mit 1,1 Äquivalenten Methoxyacetylehlorid innerhalb von 1,5 Minuten versetzt. Danach rührt man das Gemisch weitere 10 Min. und extrahiert es dann dreimal mit kaltem Diäthyläther. Die Elektrophorese des wäßrigen Extrakts (0,05 m pH 7-Phosphatpuffer, 50 V/cm, 20 Min.) ergibt, daß kein freies Thienamycin vorhanden ist. Der auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellte wäßrige Extrakt weist bei der UV-Analyse 105 ODU bei 302 mn auf, wovon 95 $> nach einstündiger Behandlung mit Hydroxylamin ausgelöscht werden; NMR (S₁ D₂O) 1,56 (m, CHCH₃), 2,84 bis 3,60 (CH₂), 3,72 (s, OCH₃), 4,29 (s, OCH₂), 4,98 (s HDO).

Beispiel 5

N-(p-Nitrobenzyloxycarbonyl-thienamyein-Lithiumsalz 220 mg Thienamycin in 60 ml Wasser werden bei O⁰C nacheinander mit 679 mg Natriumbicarbonat, 60 ml Dioxan und danach unter Rühren mit 1,1 Äquivalenten Chlorameisensäure-p-nitro— benzylester innerhalb von 1,5 Minuten versetzt. Man läßt das Gemisch 10 Minuten reagieren und extrahiert es dann dreimal mit kaltem Diäthyläther. Die Elektrophorese (0,05 m Phosphatpuffer, pH 7, 50 V/cm, 20 Min.) ergibt, daß kein freies Thienamycin vorhanden ist. Der wäßrige Extrakt wird mit 1 m Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 2,2 eingestellt und dreimal mit Äthylacetat extrahiert.

709822/1027

Der Extrakt wird über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und mit 0,1 η LiOH reextrahiert (bis zum pH.8,2). Der endgültige pH-Wert wird mit 1 m Phosphorsäure auf 7,0 eingestellt und die Probe gefriergetrocknet. Die Ausbeute beträgt 205 mg (54 #).

Beispiel 6

Herstellung von N-ip-NitrobenzyloxycarbonylJ-thienamycin-ptert.-butylbenzylester

205 mg H"-(p-Iiitrobenzyloxycarbonyl)-thienamycin-Littiiumsalz (das Produkt von Beispiel 5) in 2 ml Hexamethylphosphoramid (HMPA) wird während 2 1/2 Std. mit 0,1625 ml p-tert.-Butylbenzylbromid versetzt. Die Ausgangsverbindung ist (zunächst) in HMPA unlöslich, geht jedoch nach 30 Min. in Lösung.

Man verdünnt das Reaktionsgemisch mit Äthylacetat, wäscht nacheinander mit Wasser, wäßrigem KpHPO., nochmals Wasser und gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung, trocknet über Magnesiumsulfat, filtriert, dampft das Filtrat ein und unterwirft den Rückstand der präparativen Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Elution mit CHCl^/lthylacetat (1:2). Man erhält 160 mg (58 <f>) des Produkts; R_f 0,38; IR (μ Film) 2,98 NH und OH 5,63, ß-Lactam; 5,86 breit, Ester und Urethan; NMR (<ft CDC1,), 1,24 (s, CHCH₅, tert,-Butyl), 2,59 bis 3,27 (m, CH₂), 3*83 bis 4»47 (m, CH ß-Lactam), 5,15 (8,OCH₂C₆H₄NO₂), 5»22 (s, 0CH₂C₆H₄-tert.-Butyl), 7.45 und 8,12 (AB Quartett, J = 8 Hz, CgH)

709822/1027

Beispiel 7

Herstellung von N-Cp-NitrobenzyloxycarbonylJ-thienamycin-mphenoxyb enzyle st er

Man stellt die gewünschte Verbindung analog Beispiel 6 her, wobei man anstelle von p-tert.-Butylbenzylbromid die äquivalente Menge m-Phenoxybenzylbromid einsetzt. Die Ausbeute beträgt 11 $; IR (μ Film).3,0 NH₂ und OH 5.63 ß-Lactam; 5,86 breites Maximum Ester und Urethan; NMR (J",CHCl₅) 1,33 (d, CHCH₅ J = 6); 2,60 bis 3,62 (m, CH₂); 7,45 und 8,13 (AB Quartett, J = 8, CgH₄NO₂); 7,26 (3, C₆H₄OC₆H₅); Massenspektrum (M.S.) m/e 589, 559, 547, I83.

Beispiel 8 ·

Herstellung von:

-j) u_(o-Ponay3)-D-niandeloyl-thienamycin-p-tert.-butylbenzylester

2) Jf- ( o-IOrmyl) -D-mandeloyl-thienamycin-m-phenoxybenzylester

3) K-(D-Mandeloyl)-thienamycin-p-tert.-butylbenzylester

4) K-D-Mandeloyl-thienamycin-m-phenoxybenzylester

5) U-Propionyl-thienamycin-p-tert.-butylbenzylester

6) N-Propionyl-thienamycin-m-phenoxybenzylester

7) ir-Methoxyacetyl-thienamycin-p-tert.-butylbenzylester

8) IJ-Methoxyacetyl-thienamyein-m-phenoxybenzylester.

Die Verbindungen 1), 3), 5). 7) bzw. 2), 4), 6) und 8) werden gemäß Beispiel 6 und 7 hergestellt, wobei man jedoch anstelle des dort verwendeten N-(p-lTitrobenzyloxycarbonyl)- thienamycins jeweils die äquivalente Menge der passenden IT-Acyl-thienamycin-Ausgangsverbindungen (von Beispiel 1 bis

4) einsetzt.

7098 22/1027

- 48 -

Beispiel 9 *

Herstellung von N-ip-MethoxybenzyloxycarbonyO-thienamycin p-tert .-butylbenzylester .

STUPE A: N-ip-MethoxybenzyloxycarbonylJ-thienamycin-Natriumsalz (I) und -Lithiumsalz (II)

20 mg !Thienamycin in 5 ml Wasser werden bei O⁰C mit 105 (20 Äquivalenten) Natriumbicarbonat, 5 ml Dioxan und danach . tropfenweise unter Rühren innerhalb von 1 Min. mit 10 Äquivalenten Chlorameisensäure-p-methoxybenzylester versetzt. Nach

15 Min. stellt man den pH-Wert mit 1 m H₅PO₄ auf 7»5 ein und extrahiert die Lösung dreimal mit Äther. Der wäßrige Anteil wird danach bei O⁰C auf einen pH-Wert von 2,2 eingestellt und dreimal mit Äthylacetat extrahiert. Man trocknet den Extrakt rasch über Magnesiumsulfat» filtriert und extrahiert das Filtrat mit einigen ml Wasser, welche 6,3 mg. Natriumbicarbonat enthalten. Der wäßrige, gefriergetrocknete Extrakt enthält 172 ODU bei 303 nm aufgrund der UY-Analyse

in HgO beim pH 7,0. Nach 1-stündiger Behandlung mit Hydroxylamin erfolgt eine 95$ige löschung. Die Ausbeute beträgt

16 mg. Bei der Elektrophorese (50 Y/cm, 20 Min., wäßriges Phosphat pH 7» 0,05 m) zeigt sich am Bioautograph ein Fleck (4 cm in Richtung der Anode); NMR (d", D₂O): 1,49 (d, J = 6 Hz, CH₃CH), 2,8 bis 3,7 (m, CH₂), 3,99 (3,OCH₃), 4,0 bis 4.6 (m, ß-Lactam, CH), 4,92 (s, HDO), 5,20 (s, OCH₂), 7,13 (d, J = 8 Hz, CgH.) (ODU = optische Dichteeinheiten).

Das lithiumsalz (II) wird in derselben Weise erzeugt, wobei man jedoch die Äthylacetatlösung mit 0,1n IiOH bis zum pH 7,8 (anstatt mit wäßriger Natriumbicarbonatlösung) extrahiert und gefriertrocknet. Die spektralen und elektrophoretisch^ Eigenschaften von (II) sind gleich wie bei (I).

STUFE B: N-fp-MethoxybenzyloxycarbonylJ-thienamycin-p-tert.-butylbenzylester

37 mg des lithiumsalzes von Stufe A in 0,4 ml Hexamethyl-

709822/102 7

_ 49 -

15813Y

phosphoramid (HMPA)werden während 2 1/5 Std. mit 0,033 ml p-tert.-Butylbenzylbromid umgesetzt. Bas Lithiumsalz ist (zunächst) im HMPA unlöslich, geht jedoch nach 15-minütiger Reaktionsdauer in Lösung.

Man verdünnt das Reaktionsgemisch mit A'thylacetat, wäscht es nacheinander zweimal mit Wasser, wäßrigem KgHPO.', nochmals Wasser und Natriumchloridlösung, trocknet es über Magnesiumsulfat und filtriert. Das Piltrat wird eingedampft und der Rückstand der präparativen Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Elution mit CH01,/ithylacetat (1:2) unterworfen. Man erhält 47 mg der reinen Verbindung (II); R_f = 0,3; IR (μ, PiIm): 3,0, NHf 5»63» ß-lactam; 5»87 breit, Ester und Urethan; IiMR (cT, CDCl.,): 1,21 (s, Me und tert,-Butyl); 2,6 bis 3»6 (m, CH₂); 3»72 (s, OMe); 3.8 bis 4,4 (m, ß-Iactam, CH); 4,97 (-OCH₂-^)-OCH₃), 5»18 (-0CH₂-^-t-Bu), 6,84 und 7»20 (AB Quartett, CgH₄OMe), 7,32 (s, CgH^-t-Bu)? MS: 582, 538, 496 (Me = Methyl, t-Bu = tert.-Butyl).

Beispiel 10

Herstellung von N-ip-MethoxybenzyloxycarbonylJ-thienamycinbenzhydrylester

23,5 mg Thienamycin in 5 ml Wasser werden nacheinander-mit '■-4 ml Dioxan, 62 mg Natriumbicarbonat und danach bei O⁰C unter Rühren portionsweise mit 4 Äquivalenten Chlorameisensäurep-methoxybenzylester während 4Min-.-versetzt, Nach insgesamt .10 Minuten langer Umsetzung stellt man den pH-Wert des Gemisches mit 1 m Η,ΡΟ^, auf 7»0 ein und extrahiert das Gemisch dreimal mit Äther. Die Elektrophorese des wäßrigen Anteils (0,05 m wäßriger Phosphatpuffer vom pH 7» 50 V/cm, 20 Min.) ergibt eine 50#ige Umwandlung szu N-(p-Methoxybensyloxycarbonyl)-thienamycin.

-50 -

709822/1027

15&13Y

Man stellt die wäßrige Lösung bei O⁰C mit 1 m H₃PO. auf einen pH-Wert von 2,2 ein und extrahiert sie dreimal mit Äthylaeetat. Der Extrakt wird mit 50 mg Diphenyldiazomethan versetzt und eingedampft. Man nimmt den Rückstand in CEUCH auf und fügt weiteres Diphenyldiazomethan "bis zur bleibenden !Purpurfarbe hinzu. Nach 30 Min. dampft man die lösung ein und chromatographiert den Rückstand an Kieselgel'unter Elution mit CHC1-/Xthylacetat (1:2). Dabei erhält man 10 mg der reinen gewünschten Verbindung; R_f 0,25; IR (μ, Film); 3»0, NH; 5»63» ß-Laetam; 5»85» 5»89» Ester und Urethan; NMR (ef, CDCl₃): 1,23 (s, OH); 1,30 (d, J = 6 Hz, CH₅CH); 2,6 bis 3*6 (m, CH₂); 3»78 (s, OMe); 5»O2 (s, OCH₂); 3,8 bis 4,4 (m, ß-laetam CH); 6,9 und 7,35 (AB Quartett,-J = 9 Hz, CgH,), 7*3 s, CHPh₂ (Ph = Phenyl).

Beispiel 11

Herstellung von N-Co-NitrobenzyloxycarbonylJ-thienamycinbenzylester · _________

STUFE Αϊ N-(o-Nitrobenzyloxycarbonyl)-thienamycin-Natriumsalz '

43 mg Thienamycin werden bei O⁰C mit 10 ml eines Tetrahydrofuran/Wasser-G-emisches (1st) versetzt. Man versetzt die erhaltene Mischung unter raschem Rühren mit 102 mg (10 Äquivalenten) Natriumbicarbonat und anschließend innerhalb von : 2 Minuten tropfenweise unter Rühren mit 4 Äquivalenten Chlorameisensäure-o-nitrobenzylester. Nach 30 Min. stellt man den pH-¥ert mit 25#iger wäßriger Phosphorsäure auf 7 ein und extrahiert die Lösung dreimal mit Ither. Die wäßrige Schicht wird bei 25⁰C im Vakuum eingedampft und danach bei O⁰C auf einen pH-¥ert von 2,2 eingestellt. Dann fügt man festes Natriumchlorid hinzu und extrahiert die kalte, saure Lösung dreimal mit kaltem Äthylacetat. Die Extrakte werden vereinigt, rasch mit kalter Natriumchloridlösung rückgewa-

- 51 - . 709822/1027

15813Y

sehen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und mit 10 ml Wasser, dem 1,75 Äquivalente festes Natriumbicarbonat einverleibt wurden, rückexfcrahiert. Der Extrakt wird bei 25⁰C im "Vakuum gefriergetrocknet; dabei erhält man die gewünschte Verbindung.

STUPE B: N-(o-Mtrobenzyloxycarbonyl)-thienamyein-benzyl ester

Das Produkt von Stufe A in 7»5 ml Ä'thylacetat (aus der pH 2,2-Extraktion) wird während 2,3 Std. bei.4⁰C mit überschüssigem Phenyldiazomethan (4 ml einer Lösung mit einem Gehalt von 20 mg/ml Äther) umgesetzt. Dann dampft man das Gemisch bei 20⁰C unter vermindertem Druck zu einem nassen Rückstand ein. Die gewünschte Verbindung wird durch Dünnschichtchromatographie unter Slution mit Äthylacetat/Äther (9:1) isoliert; man erhält 17,5 mg K-(o-Nitrobenzyloacycarbonyl)-thienamycin-benzylester.

Beispiel 12

Herstellung von lf-(o-Fitrobenzyloxycarbonyl)-thienamycinp-methoxybenzylester

Han versetzt 70 mg If-(o-EFitrobenzyloxycarbonyl)-thienamycin in 8 ml Äthylacetat bei 4⁰C mit 4 ml p-Methoxyphenyldiazomethan (9 mg/ml Acetonitril). Das Gemisch wird 90 Min. bei 4⁰C gerührt und anschließend bei 20⁰C unter vermindertem Druck zu einer nassen Paste eingedampft. Die gewünschte Verbindung (42 mg) wird durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter ELution mit Äthylacetat/Äther (9:1) isoliert.

- 52- - 709822/1027

15813Y

B ei spiel

13

Herstellung von !!-(o-NitrobenzyloxycarbonylJ-thienamycinp-bromphenacylester

-O (TMS)

Th —

Th]-NH(TMS) ν L-COO(TMS)

(D TMS = Trimethylsilylgruppe

(II)

24 mg gemäß Beispiel 17 hergestelltes Th(TMS)₃ (I)-in 0,8 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran werden mit 23 mg o-Nitrocarbobenzyloxychlorid und danach mit 0,015 ml Triäthylamin versetzt. Nach 30 Min. langer Schwingungs-Durchmischung bei 25⁰C wird das Gemisch in einem trockenen Stickstoffstrom zu einem pastösen Rückstand eingedampft, der dreimal mit Petroläther gewaschen wird. Anschließend wird der Rückstand in 1 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran suspendiert und die Suspension mit 14 mg p-Bromphenacylbromid und danach mit 0,03 ml Triäthylamin versetzt. Nach 30 Min. langer Schwingungs-Durchmischung bei 25⁰C dampft man das Gemisch bei 20⁰C im Vakuum zur Trockene ein. Man löst den Rückstand in 2 ml Äthylacetat und schüttelt die Lösung 5 Min. mit 0,3 ml pH 4-Puffer. Die organische Schicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Man dampft das Piltrat zu. einem pastösen Rückstand ein und isoliert das gewünschte Produkt (44 mg) durch präparative Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Elution mit Äthylacetat/CHClj (7:3).

- 53 _

709 8 2 2/1027

15813Y

Beispiel 14 ^w

Herstellung von N-iTrichloräthoxycarbonylJ-thienamycinbenzylester

STUPE A: N-(Trichloräthoxycarbonyl)-Lithiumsalz

40 mg Thienamycin in 18 ml Tetrahydrofuran/Wasser (1:1) werden bei O⁰C unter Rühren mit 225 mg (15f2 Äquivalenten) Na-" triumbicarbonat und danach innerhalb von 2 Min. tropfenweise unter Rühren mit einer Lösung von 1,8 Äquivalenten Chlor-· ' ameisensäuretrichloräthylester in 0,6 ml Tetrahydrofuran versetzt. Nach 6 Min. stellt man den pH-Wert "mit 255&iger wäßriger Phosphorsäure auf 7,2 ein und extrahiert die Lösung mit Äther. Der wäßrige Anteil wird, nachdem jeglicher mitgeschleppte Äther im Vakuum entfernt wurde, bei O⁰C auf einen pH-Wert von 2,5" eingestellt und mit kaltem Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, rasch mit kalter Natriumchloridlöeung riickgewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird mit 0,01 m LiOH rückextrahiert (bis sum pH 6,8). Der wäßrige Extrakt wird im Vakuum γοη jeglichem Äthylacetat befreit und gefriergetrocknet. Das Rückstandsprodukt enthält 936 ODH (39 »7 $>) aufgrund der UV-Analyse bei 302 mn, wobei nach 1-stündiger Behandlung mit Hydroxylamin in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) eine 90#ige Löschung erfolgt. Die Ausbeute beträgt 32 mg. Die Elektrophorese (50.V/cm» 20 Min., 0,05 m wäßriges Phosphat pH 7) ergibt eine Zone durch den Bioautograph (MB 108, Staph. aureus), 2,4 cm in Richtung der Anode. Die Flüssigkeitschromatographie mit Cig Bondapak (Waters Assoc.) in 1Obigem wäßrigem Tetrahydrofuran ergibt einen von jeglichem nicht-umgesetztein Thienamycin freien Haup'tpeak.

STUFE Bi N-(Trichloräthoxycarbonyl)-thienamycin-benzylester

32 mg der Verbindung von Stufe A) in 2 ml wasserfreiem, destilliertem Dimethylformamid mit einem Gehalt von 7 £ HMPA

' ■' - 51 - 7 09822/1027

15813Y

(wasserfrei, pH 6,3) wird während 2 Std. bei 15⁰C mit 0,015 ml Benzylbromid zur Umsetzung gebracht (wobei der Ansatz im Verlauf der Reaktion auf 25⁰C erwärmen gelassen wird). Man verdünnt das Reaktionsgemisch mit Äthylacetat, wäscht die Mischung nacheinander mit kaltem Wasser, 1#iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, nochmals Wasser und kalter gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung, trocknet sie über Magnesiumsulfat, filtriert, dampft das Filtrat ein und unterwirft den Rückstand der präparativen DünnschichtChromatographie an Kieselgel unter Elution mit 1 $> CH^CE in Äthylacetat. Dabei erhält man 10 mg der gewünschten Verbindung; R_f = 0,63; IR (μ» CHCl₃) 5»63, ß-Lactam; 5,78 und 5»88 breit Ester und Urethan; NMR (cf CDCl₃); 1,35 (d, Me), 2,8 bis 3.7 (m, CH₂), 3,51 und 4»27 (dd, J = 6 Hz,-ß-Lactam, CH), 4,79 (a, OCH₂CCl₅), 5»42 S(OCH₂C₆H₅) und 7,41 (m,

Beispiel 15 · ■

Herstellung von N-Bromacetyl-thienamycin-msthyl- und -benzylester

STUFE A: N-Bromacetyl-thienamycin

Eine gekühlte Lösung von 28,8 mg Thienamycin und 0,3 g Natriumbicarbonat in io ml Wasser und 8 ml Dioxan wird während 20 Min. unter Rühren mit einer Lösung von 0,25 g Bromessigsäureanhydrid in 2 ml Dioxast versetzt. Der pH-Wert wird bei 8,0 gehalten. Man rührt das Gemisch dann weitere 5 Min., überschichtet es mit 10 ml Äther und stellt den pH-Wert mit 8?5iger Phosphorsäure auf 7 ein. Die Ätherschicht wird abgetrennt und die wäßrige Schicht noch zweimal mit Äther extrahiert. Die wäßrige Schicht wird unter vermindertem Druck bis auf 0,5 ml eingedampft, mit 2. ml Wasser verdünnt und auf eine 50 ml XAD-2-Harz enthaltende Säule aufgegeben. Man eluiert die Säule mit Wasser, verwirft die ersten 80 ml und fängt die

709822/1027

' - 55 -

nächsten 100 ml auf. Dann ändert man das lösungsmittel in 1Obiges Tetrahydrofuran und fängt weitere 100 ml auf. Die vereinigten Eluate werden auf einen pH-Wert von 7 eingestellt, unter vermindertem Druck auf 5 ml eingedampft und gefriergetrocknet. Dabei erhält man das Natriumsalz von N-Bromacetyl-thienamycin (Ausbeute 60 $>); UV^ ^^ 302 ΐημ.

STUPE B: N-Bromacetyl-thienamycin-methyl- und -benzylester

Eine wäßrige Lösung des Natriumsalzes wird bei O⁰C mit Äthylacetat überschichtet und auf einen pH-Wert von 2 eingestellt. Dann trennt man die Äthylacetatphase ab und extrahiert die wäßrige Phase nochmals mit Äthylacetat. Die vereinigten Äthylacetatlösungen werden über Magnesiumsulfat getrocknet und danach,mit einer Diazomethanlösung versetzt. Der nach der lösungsmittelabdampfung erhaltene Rückstand wird an einer Kieselgelplatte chromatographiert; R_f = 0,11 in Äthylacetat/Chloroform (2:1); Pp. = 118 bis 120⁰C. Das Massenspektrum zeigt M⁺ bei m/e 406^!sowie ausgeprägte Pragmente bei m/e 362, 320, 183 und 164.

Der entsprechende Benzylester wird in analoger Weise aus Phenyldiazomethan hergestellt; Pp* = 142 bis 143⁰Cj IR: 5i65 \it 5t89 μ und 6,1 μ. Massenspektrum M⁺ m/e 482, auch m/e 438, 396, 316, 259 und 164.

Beispiel 16

Herstellung von N-CGuanylthioacetamidoJ-thienamycin-methylester und -benzylester ._

r—OH Th

R = CH₃bzw. -CH₂-(J)

H ^NH

-N-C-CH₉-S-G tt *- >*

L.COOR

709 8 22/1027

- 56 -

-¹W.

Eine Lösung von 20 mg N-Bromacetyl-thienamycin-methylester in 5 ml 80prozentigem wäßrigem Dioxan wird mit 10 mg Thioharnstoff versetzt· Anschließend wird die Lösung 5 Tage bei 4⁰C gehalten und danach an 80 ml XA.D-2-Harz chromatographiert. Man entfernt den Thioharnstoff durch Elution mit 400 ml Wasser. Bei der Elution mit 120 ml lOprozentigera wäßrigem Tetrahydrofuran erhält man eine den N-Guanylthioacetamido-thienamycin-methylester enthaltende Lösung. Die Analyse durch Hochdruck-Plüssigkeitschromatographie an Bondapak Cjo-Porasil unter Verwendung von lOprozentigem wäßrigem Tetrahydrofuran als Lösungsmittel ergibt einen Hauptpeak mit gOprozentiger Reinheit. Die Lösung wird bis auf 15 ml (pH 5,5) eingedampft und gefriergetrocknet. Der entsprechende N-Guanylthioacetamido-thienamycin-benzylester wird nach derselben Methode hergestellt, außer daß man anstelle des vorgenannten Methylesters den Benzylester von Beispiel 15 einsetzt·.

Beispiel. 17

- OTMS OJh-IiHTMS oder

- COOTMS

TMS = Trimethylsilylgruppe Herstellung von silyliertem Thienamycin

Man suspendiert 80 mg Thienamycin unter Stickstoff in 40 ml Tetrahydrofuran, engt die Suspension auf 10 ml ein und fügt 1 ml Hexamethyldisilazan sowie 300 μΐ Trimethylchlorsilan hinzu. Man läßt das Gemisch 20 Min. unter kräftigem Rühren bei 25⁰C reagieren und zentrifugiert anschließend das

709822/1027

- 57 -

Ammoniumchlorid von der Suspension ab. Der Überstand wird im Stickstoffstrom zu einem öl ,eingedampft, welches zur weiteren Umsetzung dient.

Beispiel 18

Herstellung von N-(Brom-tert.--butoxycarbonyl)-thienamycinr p-bromphenacylester

STUPE A: Herstellung von N"-(Brom-tert.-butoxycarbonyl}-0-TMS-thienamycin-TMS-ester

Man löst 16 mg Th(TMS),, in 0,4 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran und versetzt die Lösung mit 20 μΐ (28 mg; 0,13 mMol) Chlorameisensäure-brom-tert.-butylester (Kp. 35°C/O,9 mm) sowie 8 μΐ (5,67 mg* 0,057 mMol) Triäthylamin (redestilliert von BaO). Pas Gemisch wird 20 Min. bei 25⁰C geschüttelt. Beim Abdampfen des Lösungsmittels und der überschüssigen Reaktionskomponenten erhält man das rohe, gewünschte Produkt; Xj₇^CiH₃CO₂GH₂CH_{3 52O} ^_n (£.₉ooo). ^vmax

STUPE B: Herstellung von N-(Brom-tert.-butoxycarbonyl)-thienamycin

3 mg des Produkts von Stufe A) werden in 0,5 nil pH 7-Phosphatpuffer und 0,1 ml Tetrahydrofuran gelöst. Man läßt die Lösung 20 Min. bei 25⁰C stehen und läßt sie dann durch eine Säule (5 ml) mit Dowex 50x8 (Na⁺-IOrm) hindurchlaufen. Die Eluatfraktionen werden durch UV überwacht bzw. untersucht. Die richtigen Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Dabei erhält man das gewünschte Produkt; UvA5?£^fer 304 nm (£ = 9300). Die Elektrophorese (50 V/cm, 20 Min.) in einem pH 7,0-Puffer ergibt eine einzelne bioaktive Zone, welche um. 31 »5 mn in Richtung der Anode wandert·

-_R 709822/1027

- 58 -

15813Y

STUFE C: Herstellung von N-(Brom-tert.-butoxycarbonyl)-thienamyein-p-bromphenacylester

Man löst 13 mg (0,022 mMol) des Produkts von Stufe B) in 0,4 ml !Tetrahydrofuran und versetzt die Lösung mit 9»6 mg (O»035 mMol) p-Bromphenacylbromid und 20 μΐ (14,4 mg, 0,14 mMol) Triäthylamin. Das Gemisch wird 30 Min. bei 25⁰C geschüttelt und dann zur trockene eingedampft. Man versetzt den Rückstand mit 10 ml Äther. Die Mischung wird mit 0»2 ml Of1 m pH 7,0-Phosphatpuffer versetzt.

Die organische Schicht wird abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, auf 0,5 ml eingeengt und auf zwei 20 χ 20 cm große 250 μ-Kieselgel-Gi^ι-Dünnschichtchromatographieplatten aufgegeben, welche mit 20 # Äthylaeetat in Chloroform entwickelt werden (R^ = 0,65)» das gewünschte Produkt (6f7 mg) wird in 42 #iger Ausbeute isoliert.

B e i s ρ i e 1 18a

Herstellung von N-Brom-tert.-butyloxycarbcnyl-thienamycin-Natriumsalz Methode A;

Eine lösung von 190 mg Thienamycin in 15 ml 0,1 m pH 7-Phosphatpuffer und 15 ml Dioxan wird bei O⁰C gehalten und mit 1 η NaOH auf einen pH-Wert von 8,5 bis 9,0 eingestellt sowie in diesem pH-Bereich gehalten, wobei sie während 5 Minuten mit 48Ο mg Chlorameisensäure-brom-tert.-butylester versetzt wird. Anschließend rührt man das Gemisch 30 Minuten, neutralisiert es mit 1 η HCl (bis zum pH 7,0) und extrahiert es mit Äther. Die wäßrige Schicht wird abgetrennt, auf 5 ml eingeengt und an einer Dowex-50x8 (Natriumform) enthaltenden Säule (3,81 χ 25,4 cm bzw. 1,5 x 10 in) chromatographiert, wobei die Elution mit Wasser erfolgt. Man erhält 113 mg des gewünschten Produkts. Durch Gefriertrocknung der Lösung erhält man ein festes Produkt.

- 59 -

709822/1027

15813Y

Methode Bt * Vf.

Eine Lösung von 95 mg Thienamycin in 10 ml 0,1 ra Phosphatpuffer und 10 ml Dioxan wird bei O⁰C gehalten, auf einen
pH-Wert von 8,5 bis 9,0 eingestellt und in diesem pH-Bereich gehalten, wobei 240 mg Chlorameisensäure-brom-tert.-butylester zugesetzt werden. Anschließend rührt man das Gemisch 30 Minuten und säuert es danach mit Phosphorsäure (bis zum pH 2,0) an. Man extrahiert die saure Lösung zweimal mit jeweils 25 ml Äthylacetat. Die organische Schicht wird abgetrennt und mit 10 ml Natriumbicarbonatlösung, welche 30 mg NaHCO, enthält, rückextrahiert. Die 30 mg des gewünschten
Produkts enthaltende wäßrige Schicht wird gefriergetrocknet, wobei man ein festes Produkt erhält; NMR (60 MHz, D₂O):
δ 1,26 (d), 1,60(s), 2,65 bis 3,5O(m), 3,70(s) und 3,90
bis 4,20(m);UvX°|° 303 nm.

Beispiel 18b

Herstellung von N-Brom-tert.-butyloxyearbonyl-thienamycinp—nitrobenzylester

100 mg des gefriergetrockneten N-Brom-tert.-butyloxycarbonyl-thienamycin-Natriumsalzes werden 1 Stunde bei 25⁰C mit 300 mg p-Nitrobenzylbromid in 2 ml Hexamethylphosphoramid
gerührt. Das Gemisch wird dann mit 10 ml Äthylacetat verdünnt und hierauf gründlich mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und an zwei 250/u-Kieselgelr-GP-Dünnschichtchromatographieplatten unter Verwendung von Äthylacetat als Lösungsmittel chromatographiert (R^ 0,45), wobei man 50 mg des gewünschten Produkts erhältι IR (CDCl^): 1777 (ß-Lactam) und 1711 cm"¹ (Ester); UVX^anol 270 nm und 322 nm; NMR (CDCl., 60MHz): 61,38 (d), 1,58(s), 2,60 bis 3,8O(m), 3,78(s), 3,90 bis 4,20(m), 5,3O(s), 7,55(d) und 8,30 ppm (d).

-60- 709 8 2 2/1027

Beispiel I8c

Herstellung von N-iDimethocyTphosphinothioy^-thienamycinpivaloxymethylester

r-OH

S
ΐ
Th-I-NHP-(OCHO₂

O LCOOCH₂OCC(CH₃)₃

Man versetzt 32 mg N-(Dimethoxyphosphinothioyl)-thienamycin-Natriumsalz in 2 ml wasserfreiem Hexamethylphosphoramid (HMPA) ■unter Stickstoff mit 2,2 Äquivalenten (25 mg) Chloräthylpivalat in 0,3 ml HMPA (die Zugabe erfolgt während 15 "bis 20 Minuten in Form von drei Teilmengen). Anschließend wird das Reaktionsgemisch 2 Stunden bei 25 C gerührt, mit 20 ml Äthylacetat verdünnt, fünfmal mit jeweils 6 ml Wasser, einmal mit jeweils 4 ml KH₂PO,, noch zweimal mit jeweils 6 ml Wasser und einmal mit 7 ml kalter Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Danach wird der Äthylacetatextrakt im Vakuum zu einem Öl (70 mg) eingedampft. Die präparative Dünnschichtchromatographie (1 $> Me~ thanol/Äthylacetat) ergibt 14,5 mg (37 f<>) N-ÖDimethoxyphosphinothioyl)-thienamycin-pivaloxymethylester. R_f 0,67; UV-Maximum bei 325 nm; IR (CHCl^C=O 1785 (5,60) und P-OCH₃ asymmetrische Streckung bei 970 cm" (10,3/U·)» NMR (CDCl₃ 100 MHz) zeigt ein ausgeprägtes Singulett 1,15 für D(CH₃)V (9H) ein Düblett bei 8,71 ppm für P-OCH₃ (J=13Hz).

Beispiel 18d

Herstellung von N-p-Nitrobenzyloxycarbonyl-thienamycinbenzylester

Eine Lösung von 115 mg Thienamycin in 2 ml Wasser und 2 ml Dioxan wird unter Eidbadkühlung mit 1 η H₂SO* bis zum pH-Wert 5 titriert. Dann versetzt man die Thienamycinlösung innerhalb

_ ₆₁_ 709822/1027

15813Y

von 2 Minuten unter raschem Rühren mit einer Lösung von 0,8 mMol Phenyldiazomethan in 2 ml Dioxan. Der pH-V/ert wird mit Hilfe einer automatischen Tariervorrichtung bei 5 bis 5,5 gehalten. Anschließend setat man eine Lösung von 100 mg NaHCO, in 2 ml Wasser zn und stellt den pH-Wert mit 1 η NaOH auf 8,2 ein. Hierauf wird während 2 Minuten eine Lösung von 300 mg p-Nitrocarbobenzyloxychlorid in 2 ml Dioxan zugesetzt, wobei der pH-Wert bei 8,2 gehalten wird. Nach weiteren 10 Minuten gießt man das Reaktionsgemisch in ein Gemisch aus 50 ml Wasser und 50 ml Äthylaeetat ein. Die Äthylacetatschicht wird abgetrennt, mit Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft· Man chromatographiert den Rückstand an 7,β2 χ 20,32 cm (3x8 in) großen 1000/u-Kieselgelplatten, welche man mit Äthylacetat/Chloroform (1s 1) entwickelt. Die Banden (Streifen) bei 1,5 bis 3,0 cm werden mit Äthylaeetat eluiert» Beim Abdampfen des Äthylacetats erhält man den kristallinen N-p-Nitrobenzyloxycarbonyl-thienamycin-benzylester (Ausbeute 30 mg) vom Fp. 165 bis 170°Cj Dünnschichtchromatographie Äthylacetat/Chloroform (1 : 1) H-. 0,15; UV ^thylacetat _2?0 ^_{0 =} Π4, X_min = 294 m/u Ef₀ = 146, \_&χ 3i9m,u Ef₃ = 1?4? IR 5,65/u (Lactam).

Beispiel 19

Herstellung von N-Azidoacetyl-thienamycin-Natriumsalz (I) und -Lithiumsalz (II)

I) Natriumsalz

Man löst 48 mg (0,18 mMol) Thienamycin in 10 ml kaltem Wasser und versetzt die Lösung bei O⁰C mit 147 mg (17,6 mMol) Natriumbicarbonat und 10 ml Dioxane, Dann versetzt man die Lösung während 2 Minuten mit 60 mg (0,5 mMol) Azidoacetylchlorid. Man rührt das Reaktionsgemisch 15 Minuten, neutralisiert es mit 30prozentiger Phosphorsäure (bis zum pH 7,0) und überträgt es in einen Scheidetrichter. Die Lösung wird zweimal mit jeweils 50 ml Äther extrahiert. Die auf 5 ml eingeengte wäßrige Schicht wird auf eine Dowex AG-5Ox8 (Natriumform) enthaltende .lonenaustauschersäule aufgegeben. Die gewünsch-

- 62 - 709822/1027

• Tf*

ten Fraktionen (UV-Kontrolle) werden vereinigt und gefriergetrocknet. Dabei erhält man 21 mg des Produkts. Die Elektrophorese (50 V/cm, 20 Min., in pH 7-Phosphatpuffer) des Produkts ergibt eine einzelne bioaktive Bande (Zone), die im pH 7-Phosphatpuffer um 40 mm in Richtung der Anode wandert; UVX^ 300 nmj Protonenresonanz (PMR) (100 Mhz, D₂O) 1,26 (d, CH₃CH), 2,92 bis 3,43 (m, 3Cg₂ und Cg-H), 4,01 (s, CH₂N₃) und 4,20 ppm (m, C₅-H und C₇-H).

II) Iiithiumsalz

Man löst 76,2 mg (0,28 mMol) Thienamycin in 10 ml kaltem Wasser und versetzt die Lösung bei 0⁰C mit 0,6 ml 1 η Lithiumhydroxidlösung und 10 ml Dioxan. Nach 1 Minuten langem Rühren fügt man während 2 Minuten 33,6 mg (0,28 mMol) Azidoacetylchlorid hinzu.Dann wird das Reaktionsgemisch eine weitere Minute gerührt und hierauf mit 30prozentiger Phosphorsäure neutralisiert (bis zum pH 7,0). Nach Extraktion mit Äther engt man die wäßrige Lösung auf 5 ml ein und gibt sie auf eine Dowex AG-5Owx8 (Lithiumform) enthaltende Ionenaustauschersäule auf. Die gewünschten Fraktionen (UV-Kontrolle) werden vereinigt und gefriergetrocknet. Dabei erhält man 38 mg des Produkts} UVX^g⁰, 300 nm.

Beispiel 20

i-OH O

Th

-NHCCH₀NH

Herstellung von N-Glycyl-thienamycin

60 mg Platinoxid und 2 ml Wasser werden in einen Hydrierkolben gegeben und 20 Minuten bei 25°C und einem Wasserstoffdruck von 1 mm gerührt. Dann gibt man 6 mg (0,02 mMol) N-Azidoacetyl-thienamycin-Natriumsalz in 4 ml V/asser in den Kolben. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten bei 25°C und einem Wasserstoffdruck von 1 Atm. gerührt. Man stellt die erhaltene

709822/1027

■ - 63 -

^15813Y OCC0C7/

Mischung (pH 8,7) mit 30prozentiger Phosphorsäure auf einen pH-V/ert von 7,0 ein und filtriert anschließend den Katalysator ab. Die auf 2 ml eingeengte wäßrige Lösung wird sodann auf eine Dowex AG—50wx8 (Natriumform) enthaltende Ionenaustauschersäule aufgegeben. Die gewünschten Fraktionen (UV-Kontrolle) werden vereinigt und gefriergetrocknet. Dabei erhält man 3,8 rag des Produkts. Die Elektrophorese (50 V/cm, 20 Min.) des Produkts in pH 7-Phosphatpuffer ergibt eine einzelne bioaktive Bande am Ursprung: UVλ. 2

χ-»» max

300 nm; PMR (100 MHz, D₂O): 1,27 (d, CH₃CH), 2,96 bis 3,37 (m, 3CH₂ und C₅-H), 3,70 (s COCH₂NH₂), und 4,20 ppm (m, C₅-H und C₇-H)♦

Beispiel 21

Herstellung von N-Azidoacetyl-thienamycin-benzylester

-OH
Th-I-NHCCH₉N-

Il *- -

3 mg N-Azidoacetyl-thienamycin-Lithiumsalz werden 30 Minuten bei 25⁰C mit 1 ml Hexamethylpho spho ramid (HMPA) und 30 mg (0,21 nMol) Benzylbromid gerührt. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 5 ml Äthylacetat verdünnt und gründlich mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Das Produkt (2 mg) wird durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie isoliert (R^ = 0,18 in... Äthylacetat); IR (CHCl₃): 2125 (N₃), 1777 (ß-Lactam) und 1687 cm~¹ (Ester und Amid); PMR (CDCl₃, 100IiHz); 1,34 (d, CH₃CH), 2,80 bis 3,60 (m, 3CH₂ und Cg-H), 3,97 (s, CH₂N₃), 4,21 (m, C₅-H und C₇-H), 5,19 und 5,35 (d, CH₂C₆H₅), 6,63 (m, NH) und 7,32 (m, CgH₅).

30 mg"(0,08 mMol) N-Azidoacetyl-thienamycin-Natriumsalz werden 30 Minuten bei 25⁰C mit 3 ml HMPA und 120 mg (0,07 mMol)

709822/1Ö27 - 64 -

Benzylbromid gerührt. Das Produkt (30 rag) wird nach der vorstehend beschriebenen Methode isoliert.

Beispiel 22

Herstellung von N-Azidoacetyl-thienamycin^-methyl-^-buten-1-ylester

11 mg (0,029 mMol) N-Azidoacetyl-thienamycin-Natriumsalz werden 30 Minuten bei 25⁰C mit 1 ml HMPA und 39 mg (0,026 ' mMol) 1-Brom-3-methyl-2-buten gerührt. Anschließend wird das Gemisch mit 10 ml Äthylacetat verdünnt und gründlich mit Wasser gewaschen. Das gewünschte Produkt (10 mg) wird durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie isoliert (R^ = 0,18 in Äthylacetat). IR (CHCl₃): 2121 (N₃), 1777 (ß-Lactam) und 1685 cm"¹ (Ester und Amid)? PMR (CDCl₃, 100 MHz): 1,34 (d, CH₃CH), 1,73 (s,=C(CH₃)₂, 2,80 bis 3,80 (m, 3CH₂ und Cg-H) , 3,98 (s, CH₂N₃), 4,20 (m, C₅-HundC₇-H), 4,72 (d, CH₂CH=), 5,40 (t, CH₂CH=) und 6,70 (breit, NH); Massenspektrum (E.I.): m/e 423 (Molekülion), 405 (M⁺-H₂O) , 395 (M⁺-N₂) und 337 (M⁺-86) .

Beispiel 23

Herstellung von N-inycyl-thienamycin-3Hnethyl-2-buten-1--yl· ester

.- „β.

-NH

ScH-N, ^Th

2 3

^J XH

LcO₂CH,CH=c

-NHCCH₂NH₂ .CO₂CH₂CH=C

CH₃

Man löst 10 mg N-Azidoacetyl-thienamycin-3-methyl-2-buten--1-yl-ester in 1 ml Ithylacetat und gibt die Lösung in einen Hydrierkolben, welcher 10 mg Palladium (aus Palladiumoxid) und 0,5 ml 50#iges Methanol in Ithylacetat enthält. Das Gemisch wird 1 Std. bei 25⁰C und einem Wasserstoffdruck von 1 atm gerührt. Danach filtriert man den Katalysator ab, isoliert das gewünschte Produkt düiinschiclitchromatograpliisch. (E_f = 0,16 in 20 $> Methanol/Chlorof orm). Die Elektrophorese

WSPECTED - 65 - 709822/1027

15813Y

des Produkts in einem pH 7»0-Puffer (50 Y/cm, 20 Min.) ergibt eine "bioaktive Bande, welche um 34 mm in Richtung der Kathode wandert; ^X^^⁰¹ 315 mn; IR (CHCl₃): 3300 1777 (ß-Lactam) und 1672 cnT¹ (Ester und Amid).

Beispiel 24

Herstellung von U-Azidoacetyl-thienamyein-p-tert.-butylbenzylester

136 mg (0,36 mMol) lT-Azidoaeetyl-thienamycin~Hatriumsalz werden 30 Min. bei 25⁰C mit 5 ml HMPA und 180 mg (0,79 mMol) p-tert.-Butylbenzylbromid gerührt. Anschließend verdünnt man die lösung mit 10 ml A'thylacetat und wäscht sie gründlich mit Wasser. Die organische Schicht wird abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Man isoliert das gewünschte Produkt (80 mg) durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie (R_f = 0,18 in Äthylacetat); IR (CHCl₃): 2121 (Ii₃), 1777 (ß-Iactam) und 1684 cm"¹ (Ester und Amid); Protonenresonanz (PMR) (CDCl₃, 60 MHz): 1,32 (s, t-Bu), 1,34 (d, CH₃CH), 2,60 bis 3,75 (m, 3CH₂ und Cg-H), 3»90 (s, CH₂U₃)J 4»30 (m, C,--H und C„-H), 5,21 (s, CH₂-^ ), 6,90 (breit, KH) und 7,33 ppm (s, aromatische Protonen).

Beispiel 25

Herstellung von IT-G-lycyl-thienamycin-p-tert.-butylbeniaylester

Man löst 10 mg N-Azidoacetyl-thienamycin-p-tert.-butylbenzylester in 0,5 ml Ithylacetat« Die Lösung wird in einen Hydrierkolben gegeben, welcher 50 mg Palladium (aus Palladiumoxid) und 0,5 ml Äthylaeetat enthält. Das Gemisch wird 10 Min. bei 25⁰C und einem Wasserstoffdruck von 1 atm gerührt. Die Dünnschichtchromatographie zeigt (wie in Beispiel 24)» daß das gesamte Ausgangsmaterial verbraucht wurde. Der Katalysator wird vom Reaktionsgemisch abfiltriert und das

. ₆₆ _ 709822/1027

15813Y

Filtrat zur Trockene eingedampft. Auf diese Weise erhält man das Rohprodukt; IR (CHCl₅): 1776 (ß-Lactam) und 1675 (Eater und Amid); UvAmax^⁰¹ 520 nm und 275 nm; PMR (CHCl₃, 60 MHz): 1,32 (s, t-Bu), 1,34 (d, CH₅CH), 5,23 (CHg~^3) t*²¹«³· 7,33 ppm (s, aromatische Protonen).

Beispiel 26

Herstellung von IJ-Azidoacetyl-thienamyein-pivaloxymethylester

ΓΟΗ

Th-

_CO₂CH₂-O-C-C-(CH₃)

11 mg (0,04 mMol) N-Azidoacetyl-thienamycin-Natriumsalz werden 30 Min. bei 25⁰C mit 1 ml HiCPA und 36 mg (0,24 mMol) Chlormethylpivalät gerührt. Danach verdünnt man das Gemisch mit Ithylacetat und wäscht mit Wasser. Das gewünschte Produkt wird durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie isoliert; (R_f = 0,18 in A'thylacetat); IR (CHCl₅): 2121 (N₅), 1777 cm~¹ (ß-Lactam); PMR (CDCl₅, 60 MHz)| 1,22 (s, t-Bu), 1,32 (d, CH₅CH), 3,98 (s, CH₂N₅) und 5.83 ppm (dd, CO₂CH₂O-).

- 67 -

709822/1027

15813Y

Beispiel 27

Herstellung von N-Azidoacetyl-thienamycin^-methyl^-propen-1-yl-ester

Th _.

-OH O

NHCCH₂N₃

-CO₀CH₀-C=CH-, ^{2 2} CH ²

20 mg (0,055 mMol) N-Azidoacetyl-thienamycin-Lithiumsalz werden 30 Min. bei 25⁰C mit 1 ml HMPA und 27 mg (0,30 mMol) 3-Chlor-2-methylpropen gerührt. Man verdünnt das Gemisch mit Äthylacetat und wäscht mit Wasser. Das gewünschte Produkt wird durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie isoliert (R_f = 0,18 in Äthylacetat); IR (CHCl₃): 2121 (N₃), 1777 (ß-lactam) und 1684 cm"¹ (Ester und Amid).

Beispiel 28

Herstellung von N-Glycyl-thienamycin-estern (I bis IV)

-OH Th- -NHCCE

-COOR R

-CH₂-CH=C

JH-

JH-

-6S-

709822/1 027

III -GH₀-O-G-C(CH₃)

IV -CH₂G=CH₂

Die Verbindungen I Ms IV werden nach der Keduktionsraethode von Beispiel 23 hergestellt, wobei man jedoch anstelle von N-Äzidoacetyl-thienamycin-3-methyl-2-buten-1-ylester jeweils die passenden Ausgangsverbindungen (aus den Beispielen 22, 24, 26 bzw. 27) in äquivalenten Mengen einsetzt.

Beispiel 29

Herstellung von N-Benzyloxycarbonyl-thienamycin und N-Benzyloxycarbonylbenzylcarbonsäureanhydrid

— OH
HO

I ti

NC-O-CH

Eine Lösung von 16,6 mg Thienamycin in 4 nil 0,05 m pH 7-Phosphatpuffer und 2 ml Dioxan, welche sich in einem mit Rührer, Thermometer» pH-Elektrode und dem Zufuhrleitungsende einer automatischen Titriervorrichtung ausgestatteten Dreihalskolben befindet, wird in einem CH-sOH/Eis-Bad auf -8⁰C abgekühlt. ■

- 69 -

709822/1027

15813Y

Man stellt den pH-Wert durch Zugabe von O_t2n Natriumhydroxid in 50#igem wäßrigem Dioxan auf 8,2 ein.und fügt eine lösung von 0,015 ml .Carbobenzyloxychlorid in 2 ml Chloroform hinzu. Dann rührt man das Gemisch 10 Min. bei -6⁰C (pH 8,2), tiberschichtet es mit Äther und stellt den pH-Wert mit 1n Salzsäure auf 7 ein. Hierauf trennt man die Schichten durch Zentrifugieren und extrahiert die wäßrige Phase noch zweimal mit Äther. Danach wird die wäßrige Phase mit Äthylacetat überschichtet und angesäuert (bis zum pH 2). Das Äthylacetat wird abgetrennt und die wäßrige Schicht neuerlich mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetatextrakte werden mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Man rührt das Piltrat mit Wasser und stellt es mit verdünnter Natriumbicarbonatlösung auf einen pH-Wert von 7 ein. Dann wird die wäßrige Phase abgetrennt und gefriergetrocknet. Man erhält 10 mg (46 i>) des Natriumsalzes von N-Benzyloxycarbonylthienamycin. Das UV-Spektrum [A_max 3°3 ¹³¹H* ^E $ ¹47 (£=6290)J ergibt einen Reinheitsgrad von etwa 80 #. Eine 20-minütige Elektrophorese bei 50 V/cm und einem pH-Wert von 7 und anschließende Sioautographie an S. aureus ergibt eine Hemmzone bei +2,5 cm.

Die Ätherextrakte des Reaktionsgemisches enthalten die gewünschte Verbindung N-Benzyloxycarbonyl-thienamycin-benzylcarbonsäureanhydrid; UV/I 335

Beispiel 30

Herstellung von N-Benzyloxycarbonyl-thienamycin-benzylester

Das N-Benzyloxycarbonyl-thienamycin (Beispiel 29) in Äthylacetat wird dem Verfahren von Beispiel 2 9 unterworfen, außer daß man der getrockneten Äthylacetatlösung aus der pE 2-Ex-

- 70 -

709822/1027

15813Y

traktion die äquivalente Menge Phenyldiäzomethan zusetzt und die lösung 2 Std. "bei 4⁰C stehen läßt. Beim Eindampfen zur Trockene erhält man den rohen N-Benzyloxycarbonyl-thienamycinbenzylester» welcher durch Dünnschichtchromatographie mit Hilfe von Äthylacetat/Chloroform (3:1) isoliert wird. (R^ = 0,24). Der Ester kristallisiert aus Äther aus; IR 5»63 μ (Lactam-Carbonyl); Schulter 5»8 μ (Eeter); B,88 μ (Urethan-Carbonyl); UV, Dioxan, }„„ 318 ιημ, E $> (6 = 10900); m/e M⁺ 496.

Beispiel 31

Herstellung von N-Carbomethoxy-thienamycin-p-pivaloyloxybenzylester

STUPE A: N-Carbomethoxy-thienamycin

Man löst 49 mg (148 μΜοί) Thienamycin in 14 ml 0,05 m pH 7-Phosphatpuffer und kühlt die Lösung im Eisbad. .Anschließend stellt man den pH-Wert mit Hilfe einer automatischen Bürette unter Rühren auf 8,2 ein. Man setzt eine Lösung von 46 μΐ (600 μΜοί) Chlorameisensäuremethylester in 580 μΐ p-Dioxan auf einmal zu, wobei man eine homogene Lösung erhält. Anschließend hält man den pH-Wert mit Hilfe der automatischen Bürette bei 8,2. Nach 10 Min. stellt man die Lösung mit verdünnter Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 7 ein und wäscht sie dreimal mit dem gleichen Volumen Diäthyläther. Dann wird die wäßrige Lösung auf 4,5 ml eingeengt und an einer XAD-2-Harzsäule chromatographiert. Das Produkt wird (nach Elution mit Wasser) mit 5#iger wäßriger Tetrahydrofuranlösung eluiert und gefriergetrocknet. Man erhält 28,9 mg Produkt; UV (0,1n pH 7-Phosphatpuffer); /^_max 303 nm (£s645O); Elektrophorese (20 Min., 0,1n pH 7-Phosphatpuffer, 50 V/cm), Beweglichkeit 3,5 cm zur Kathode.

- 71 -

709822/1027

• ere·

STUZE B: N-Carbomethoxy-thienamycin-p-pivaloyloxybenzyl ester

Man stellt die gewünschte Verbindung gemäß Beispiel 24 her, wobei man jedoch anstelle von N-Azidoacetyl-thienamycin-ITatriumsalz bzw. p-tert.-Butylbenzylbromid N-Carbomethoxythienamycin (in Form des Natriumsalzes) bzw. p-Pivaloyloxybenzylbromid in jeweils äquivalentem Anteil einsetzt.

Beispiel 32

Herstellung von N-Benzolsulfonyl-thienamycin^-methyl^- propan-1-yl-ester

r—OH

L-COOS
E β -CH₂C=CH₂

STUFE A: N-Benzolsulfonyl-thienamycin

Man löst 52 mg (148 μΜοΙ) Thienamycin in 25 ml 0,1n pH 7-Phosphatpuffer. Die lösung wird unter Eisbadkühlung magnetisch gerührt. Man stellt den pH-Wert unter Verwendung einer automatischen Bürette mit 2,5n NaOH auf 8,2 ein und setzt auf einmal 227 μΐ (226 μΜοΙ) Benzolsulfonylchlorid in 500 ml p-Dioxan zu. Dann hält man den pH-Wert mit Hilfe der auto- ^ matischen Bürette 30 Min. bei 8,2 und stellt ihn dann mit verdünnter wäßriger Phosphorsäure auf 7,0 ein. Dann wird die Eeaktionslösung auf 15 ml eingeengt und an 50 ecm XAD-2-Harz chromatographiert. Man eluiert die Säule mit Wasser und

- 72 -

709822/1027

hierauf mit 1Obigem wäßrigem Tetrahydrofuran, durch welches das Produkt ausgewaschen wird. Das mit dem 1Obigen wäßrigen Tetrahydrofuran erhaltene Eluat wird auf ein Drittel seines Volumens eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 28 mg des Produkts, dessen elektrophoretisch^ Beweglichkeit (50 V/cm, 20 Min., pH 7, 0,05n Phosphat puff er) 3» 5 cm in Richtung der Kathode ausmacht; ^ _max 303 (C 3650) in 0,1 η pH 7-Phosphatpuffer.

STUPE B: tf-Benzolsulfonyl-thienamycin^-methyl^-propen-iyl-ester

Man erhält die gewünschte Verbindung gemäß Beispiel 24, wobei man jedoch anstelle von N-Azidoacetyl-thienamycin-Natriumsalz "bzw. p-tert.-Butylbenzylbromid die äquivalenten Mengen N-Benzolsulfonyl-thienamycin (in Form des Natriumsalzes) bzw. 2-Methyl-2-propen-1-yl-chlorid einsetzt.

Beispiel 33 :

Herstellung von O-Methyl-thienamycin

Th--₂
-COOH

STUPE A: O-Methyl-N-ip-nitrobenzyloxycarbony^-thienamycinp-nitrobenzylester

Eine Lösung von 135 mg N-p-CNitrobenzyloxycarbonylJ-thienamycinp-nitrobenzylester in 50 ml Methylendichlorid wird bei O⁰C unter kräftigem Rühren mit 0,5 ml 0,006 m Fluoborsäure in Äther/ Methylendichlorid (3 : 1) und danach sofort mit 10 ml einer gekühlten 0,6 m Lösung von Diazomethan in Methylendichlorid versetzt. Das Diazomethan entfärbt sich innerhalb von 1 Minute. Man extrahiert die Lösung mit 10 ml 0,1 η pH 7-Phosphatpuffer, trocknet den Extrakt und engt ihn stark ein.

- 73 -

709822/1027

15813Y

Dann wird die Lösung auf zwei 20,32 χ 20,32 cm (8 χ 8 in.) große 1000/u-Kieselgelplatten aufgegeben, welche mit Äthylacetat/Chloroform (3 : 1) entwickelt werden. Die Bande bei 3 bis 4,5 cm ergibt 12 mg wiedergewonnene Ausgangsverbindung. Die Bande bei 6 bis 8 cm liefert 20 mg kristallinen O-Methyl-N-ip-nitrobenzyloxycarbonylJ-thienamycin-p-nitrobenzylester, Fp. 172 bis 174 ⁰Cj MS m/e 600 (M⁺), 568, 542, 5OQ, 447, 389, 304 und 59.

STUFE B: O-Methyl-thienamycin

20 mg O-Methyl-N-Cp-nitrobenzyloxycarbonylJ-thienamycin-pnitrobenzylester werden in Form einer Lösung in 2 ml Tetrahydrofuran und 1 ml Äthanol während 2 1/2 Stunden bei 23⁰C und einem Überdruck von 3» 51 kp/cm (50 psig) in Gegenwart von 20 mg Platinoxid hydriert. Anschließend filtriert man den Katalysator ab und versetzt das Filtrat mit 1 ml 0,1 η pH 7-Phosphatpuffer. Die Lösung wird unter vermindertem Druck bis auf 2 ml eingedampft. Man nimmt das Gemisch in 5 ml Wasser und 5 ml Äthylacetat auf und zentrifugiert die erhaltene Mischung. Die Äthylacetatschicht wird abgetrennt und die wäßrige Schicht nochmals mit Äthylacetat sowie mit Äther extrahiert. Nach Filtration durch Celite wird die wäßrige Lösung auf eine Säule (20 ml) mit XAD-2-Harz aufgegeben. Die Säule wird zuerst mit Wasser und danach mit 10prozentigem Tetrahydrofuran eluiert. Das Tetrahydrofuraneluat wird eingedampft und gefriergetrocknet, wobei man im wesentlichen reines O-Methyl-thienamycin erhält.

Beispiel 34 Herstellung von Thienamycin-O-phosphatester

t ONa
r-OP^

ONa
Th- -NH₂

-COOH

709822/1027

STUFE A: CTJ.

Eine Lösung von 50 mg N-Cp-Nitrocarbobenzyloxy^thienamycinp-nitrobenzylester in 5 ml Tetrahydrofuran wird "bei 3 C mit 30 mg Dibenzylphosphorchloridat und danach mit 14/ul Triäthylamin versetzt. Man rührt das Gemisch 2 Stunden bei 25⁰C und "befreit es danach im Vakuum vom Tetrahydrofuran. Man nimmt den Rückstand in Methylendichlorid auf und wäscht mit Wasser. Danach wird die Methylendichloridlösung über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird an Kieselgel chormatographiert, wobei man O-Dibenzylphosphoryl-N-benzyloxycarbonyl-thienamycin-benzylester erhält.

STUPE B:

20 mg des vorgenannten Produkts werden in Form einer Lösung mit 10 ml 80prozentigem wäßrigem Dioxan mit einem Gehalt von 8 mg NaHCO^ während 6 Stunden in Gegenwart von 20 mg eines Katalysators (5 i° Pd auf Holzkohle) hydriert. Anschließend filtriert man den Katalysator ab, engt das Filtrat auf 2 ml ein, extrahiert die Lösung zweimal mit Methylendichlorid und dampft die Extrakte ein. Bei der Gefriertrocknung verbleibt das Produkt, d.h. Thienamycin-O-phosphat-Dinatriumsalz.

Beispiel 35 Herstellung von O-(Methylcarbamoyl)-thienamycin

.0

Th-

r-OCNHCH,

-NH₂ L-COOH

Eine Lösung von 20 mg N-(p-Nitrobenzyloxycarbonyl)-thienamycinp-nitrobenzylester und 20 mg Methyliso cyanat in 5 ml Methylendichlorid wird 18 Stunden bei 23°C gerührt. Anschließend dampft man das Lösungsmittel ab und extrahiert den Rückstand mit Hexan. Der in Hexan unlösliche Rückstand wird an Kieselgel chromategraphiert, wobei man im wesentlichen reinen

" ^Ί5 ~ 709822/1027

15813Y

O-CMethylcarbamoy^-N-p-nitrobenzyloxycarbonyl-thienamycinp-nitrobenzylester erhält. Wenn man den Ester der Hydriermethode von Beispiel 34 Stufe B) (anstelle der dortigen Ausgangsverbindung) unterwirft, erhält man das gewünschte Produkt.

Beispiel 36 Herstellung von O-(Methoxymethyl) -thienamycin

Th--NH₂
-COOH

STUFE A:

Eine Lösung von 58 mg p-Nitrobenzyloxycarbonyl-thienamycinp-nitrobenzylester in 5 ml Tetrahydrofuran und 1 ml HIiIPA wird auf -78⁰C abgekühlt und unter Rühren mit 0,1 ml einer 2 η Lösung von Phenyllithium und sofort danach mit 0,2 ml Methylchlormethyläther versetzt. Das Gemisch wird während 1 Stunde auf 25 C erwärmen gelassen und danach mit 25 ml Methylendichlorid versetzt. Dann extrahiert man die Lösung mit 25 ml 0,1 η pH 7-Phosphatpuffer und viermal mit jeweils 25 ml Wasser. Die MethylendiChloridlösung wird eingedampft und der Rückstand mit Hexan angerieben. Der in Hexan unlösliche Rückstand wird an Kieselgel chromatographiert, wobei man 0-Methoxymethyl-N-( p-nitrobenzyloxycarbonyl-thienamycinp-nitrobenzylester erhält.

STUFE B:

Wenn man den vorgenannten Ester der Hydriermethode von Beispiel 34, Stufe B) (anstelle der dortigen Ausgangsverbindung) unterwirft, erhält man die gewünschte Verbindung.

Beispiel 37

Unter Anwendung der in den vorstehenden Beispielen sowie in der Beschreibung erläuterten Methoden erhält man folgende

~⁷⁶ 709822/1027

15813Y

U.

erfindungsgemäße Verbindungen:

Λ_

.SCH₂CH₂R¹R²
COXR

verbindung χ

1.)

-C-0

CH=CH₂-

2.)

3.)

4.)

5.)

O	-CH2CH2N QCH3) 2 .	■Η ■	-C-H Il 0
O	-CH2-O-C-CH3 ' Ö	H-	-C-O-CH3 . Ö
O	pTT Q Π Π /ΓΉ \ XT '6	H	-C-CH2N(CH3)3 Ö
O	-CH0-N-C-CH^ ^ I M O HO	H	0

6.)

0 -CH₂-^fVo-CH (CH₃) ₂ H C-CH₀-N-C-NH₀

O ^HN H

7.)

0 -CH₂-C=CH₂ CH₃

Il

8.)

9.)

0 -CH₂-CH₂-C

H ' -C-CH₂OH

-C-N-C-NH₀

Il It M ^

0^HN H

- 77 - 709822/1027

15813Y

Verbindung X

-ρ-(OCH₃)₂ S

12.)

0 -CH₂-O-CH₃

—G—(jtLj — ο — ο JJ V

-C-S-CH₃ 0

13.)

0 SiC

iC(CH₃)₃

-C-N-CH. 0^H

14.) 0 -CH₂-CH=CH₂ H

-S-CF,

15.) 0 -CH₂CH₂-S-CH₃ H

-C-O-' Il

-ND,

16.)

17.)

-C-O-C- (CR,),,

it ι OZ

0 CH₂Br

-C-O-CH₂CH₂Br 0

18.)

19.)

^NV-NO₂ . H

xx>..

-C-CH₂B 0

-C-CH₂N(CH₃) Ö

20.)

M I 0 Br

21.)

22.)

'TV

►OCH-

-C-O-CH₂-^ __/^_ι,₃ 0

-S

- 78 -

709822/1027

ORIQINAL INSPECTED

Beispiel 38 Herstellung von Arzneimitteln

Man erhält eine solche Einzeldosierungsform, indem man 120 mg N-Glycyl-thienamycin-pivaloyloxymethylester mit 20 mg Milchzucker und 5 mg Magnesiumstearat vermischt und die Mischung (145 mg) in eine Gelatinekapsel Nr.3 einfüllt. Analog können unter Verwendung einer höheren Wirkstoff- und geringeren Milchzuckermenge andere Zubereitungen in Gelatinekapseln Nr.3 eingegeben werden. Wenn es erforderlich ist, mehr als 145 mg der Komponenten zusammenzumischen, kann man auch größere Kapseln sowie Preßtabletten und Pillen erzeugen. Die nachstehenden Beispiele sollen die Herstellung von Arzneimitteln erläutern:

Tablettenrezeptur ' mg pro Tablette

N-Glycyl-thi enamyc in-pivaloyloxy-	125
methylester _ — ·	6
Maisstärke, U.S.P.	192
Dicalciumphosphat	19Ö
Milchzucker, U.S.P.

Der Wirkstoff wird mit dem Dicalciumphosphat, dem Milchzucker und etwa der Hälfte der Maisstärke vermischt. Das Gemisch wird mit 6mg 15#iger Maisstärkepaste granuliert und das Granulat grob ausgesiebt, bei 45⁰C getrocknet und neuerlich durch Siebe Nr.16 gesiebt. Dann fügt man den Rest der Malsstärke und des Magnesiumstearats hinzu und preßt die Mischung zu Tabletten, welche jeweils einen Durchmesser von etwa 1,27 cm (etwa 0,5 in.) ,und ein- Gewicht von 800 mg aufweisen.

⁷⁹ " 709822/1027

15813T

Parenterale Lösung

Ampulle

N-Glycyl-thienamycin-pivaloyloxy-

methylester 5OO mg

Verdünnungsmittel: steriles Wasser für Injektionszwecke 2 ml

Augenlösung

N-GIyc yl-thi enamyc in-p ivalo ylo xy-

methylester 100 mg

Hydroxypropylmethylcellulose 5 mg

steriles Wasser £.s. auf 1 ml

Ohrenlösung

N-Glycyl-thienamycin-pivaloyloxy-

methylester 100 mg

Benzalkoniumchlorid 0,1 mg

steriles Wasser q.s. auf 1 ml

Lokale Salbe

N-G-lycyl-thi enamyc in-p i valo ylo xy-

methylester 100 mg

Polyäthylenglykol 4000 TJ.S.P. 400 mg Polyäthylenglykol 4OO U.S.P. 1,0g

D er Wirkstoff der obigen Rezepturen kann allein oder in Kombination mit anderen biologisch aktiven Substanzen, z.B. anderen antibakteriellen Mitteln, wie Lincomycin, einem Penicillin, Streptomycin, Novobiocin, Gentamicin, Neomycin, Colistin und Kanamycin, oder mit anderen therapeutischen Mitteln, wie Probenecid, verabreicht werden.

' ⁸⁰ " . 709822/1027

Herstellung von alternativen Ausgangsmaterialien

Ausser Thienamycin ist es für den Fachmann ersichtlich, dass dessen verschiedene Isomere allein oder als Mischungen als Ausgangsstoffe bei der Herstellung der erfindungsgemässen Verbindungen verwendet werden können. Einige dieser Isomeren sind aus natürlichen Produkten der Fermentation erhältlich (siehe unten). Durch Totalsynthese werden jedoch alle Isomere erhältlich (siehe unten) in Form einer Mischung von M Diastereoisomeren, welche bacterizide Aktivität aufweisen und die nach üblichen technischen Verfahren aufgetrennt werden können. Die M Diastereoisomere (2 eis, 2 trans) können chromatographisch getrennt v/erden. Die Auftrennung von jeweils einem gegebenen d/1 Paar mit optisch aktiven Säuren oder Basen läuft nach üblichen Verfahren ab. Dabei soll festgehalten werden, dass die absolute Konfiguration des zuerst identifizierten Ausgangsmaterials (I). 5R 6S 8R ist.

- 81 -

709822/1027

Herstellung von Thienamycin durch Totalsynthese

OH

JLJ

COOH

Stufe A:

Herstellung von fr-(2-Acetoxyvinyl)-azetidin-2-on

HoC=CH-CH=CHOC-CHo + O=C=N-SO^Cl

CH=CHOCCH.

SO₂Cl

CH=CHOCCH-

Eine Lösung aus 1,0 ml destilliertem Chlorsulfonylisocyanat (1,65 g, 11j7 mMol) in 2,5 ml wasserfreiem Diäthyläther wird unter N₂ in einem Bad von -20⁰C gekühlt.

Eine Lösung von 2,5 g L-Acetoxybutadien (22 mMol) in 2,5 ml wasserfreiem Äther wird ähnlich gekühlt unter Stickstoff in einem -20⁰C Bad.

Die Chlorsulfonylisocyanat lösung wird tropfenweise zu der Acetoxybutadienlösung hinzugegeben mittels eines in die CSI-Lösung eintauchenden Polytetrafluoräthylenrohres und

-⁸²- 7 0 9 8 2 2/1027

- JV-

wird mit Np unter Druck gesetzt. Die Zugabe dauert 10 Minuten. Wenig oder keine Farbe ist erkennbar und die Reaktion wird 0,5 Stunden bei -20⁰C gerührt. Die Lösung ist klar und hat eine hellgelbe Farbe.

Eine Lösung aus 2 g Natriumsulfit und 5 g K₃HPO₂₁ in 20 ml HpO wird hergestellt während der vorerwähnten 0,5 Stunden Reaktionszeit und auf einem Eisbad gekühlt; 20 ml Äther werden zu der Mischung unter heftigem Rühren auf einem Eisbad hinzugegeben. Nach Ende der 30-minütigen Reaktionszeit wird das Reaktionsgemisch, wiederum unter Anwendung von Np-Druck und einem Polytetrafluoräthylenrohr aus dem Reaktionskolben, der in einem Bad von -20⁰C gehalten wird, zu der heftig gerührten Hydrolysemischung überführt. Die schnelle, tropfenweise Zugabe ist nach 5 Minuten beendet. Man lässt die Hydrolyse weitere 5 Minuten stattfinden. Die Hydrolysemischung hat einen pH von 6-8, vorzugsweise pH 8.

Die Phasen werden getrennt, wobei ein gelb-orange Harz in der wässrigen Phase verbleibt. Die Ätherphase wird direkt über MgSO₂J getrocknet. Die wässrige/Harzphase wird dreimal mit 50 ml-Anteilen Äther extrahiert, wobei jeder Anteil zu der Ausgangs-Äther/MgSOjj-Mischung gegeben wird.

Die getrockneten Extrakte werden filtriert und unter einem Ν,,-Strom auf 5 ml konzentriert; ein Teil des Produktes -ist kristallisiert in diesem Stadium.

Man stellt eine Säule aus 10 g Baker-Kfeelgel, gepackt in Äther, her und das Ätherkonzentrat wird obenauf gegeben und durchlaufen gelassen. Der im Kolben enthaltene Rückstand wird dreimal mit 2 ml Äther gespült, jedesmal abpipettiert und auf die Säule gegeben. Dann wird mit Äther eluiert.

- 83 -

709822/1027

Die ersten 25 ml sind hauptsächlich Leervolumen. Die nächsten 5 10-ml-Fraktionen werden gesammelt und anschliessend daran 3 50-ml-Fraktionen und alle werden unter einem Np-Strom im Volumen vermindert. Das Produkt kristallisiert aus den Fraktionen H bis 6 mit Spuren in 3 und 7. Die Fraktionen 1 bis 3 enthalten ein gelbliches, scharf-riechendes Material, das beim Stehen harzförmig wird. Ausbeute: 100 mg als Mischung aus den eis- und transisomeren.

Stufe B:

Herstellung von fr-(2-Acetoxyäthyl)-2-acetidinon

OCCH₃

Eine Lösung von li-(2-Acetoxyvinyl)-2-azetidinon (10,0 g, 0,065 Mol) in 200 ml Äthylacetat, enthaltend 100 mg eines 10 % Palladium/C-Katalysators, wird in einem Parr-Schütt- ler hydriert bei 25°C unter einem Druck von 2,8 kg/cm im Laufe von 15 Minuten. Die Mischung wird durch ein Bett aus Supercel filtriert und mit zusätzlichem Äthylacetat gewaschen. Das vereinte FiItrat wird im Vakuum gewaschen, wobei man als kristallinen Feststoff 4-(2-Acetoxyäthyl)-2-azetidinon (10,0 g) erhält. Beim Umkristallisieren aus Äther erhält man weisse Kristalle: F. HH bis Hl°C; IR (CHCl₃) 5,66, 5,7¹J; KMR (CDCl₃) Tl₉HH (breites s? 1, NH), 5,82 (m, 2, CH₀OCOCH,), 6,29 (m, 1, C-lJH, 6,87 (1/2 AB Muster wird weiterhin vierfach

-8H-

709822/1027

SS.

aufgeteilt durch C-4H und NH, 1, J _em = 12,8Hz, J = 4,5 H H_NH =1,9 Hz, 7,38 (1/2 AB Muster wird weiterhin vierfach aufgeteilt durch C-4H und NH, 1, J = 12,8Hz, J = 2,3Hz₉ J_NH = 1,0Hz). 7,93 und 8,02 (s an m, total 5, OCOCH, und CH₀CH₀OCOCH,, entsprechend).

Stufe C;

Herstellung von 4-(2-Hydroxyäthyl)-2-azetidinon

Unter Stickstoff bei 0°C wird eine Lösung aus 4-(2-Acetoxyäthyl)-2-azetidinon (2,2*1 g, 0,014 Mol) in 25 ml wasserfreiem Methanol mit einer Lösung von Natriummethylat (77 mg, 1,4 mMol) in 5 ml wasserfreiem Methanol behandelt. Nach einstündigem Rühren wird die Lösung mit Eisessig neutralisiert. Die Entfernung des Methanols im Vakuum ergibt das rohe 4-(2-Hydroxyäthyl)-2-azetidinon als ein öl. Das Produkt wird chromatographisch über Kieselgel gereinigt, indem man es mit 10 % Methanol/CHCl, eluiert, wobei man 1,55 g des Alkohols erhält: F. 50⁰C;

IR (CHCl₃)P 5,67; KMR (CDCl₃)T^,20 (breites s, 1, NH), 6,24 und 6,28 (m an t, total 3, C-4H und CH₃OH entsprechend), 6,90 (breites s an 1/2 AB Muster spaltet weiter auf in vier durch C-4H und NH, total 2, OH und C-3H entsprechend,

^Jgem ⁼ !3.0Hz, J_vic = 4,2Hz, J_NH = 1,6Hz), 7,^2 (1/2 AB Muster spaltet weiter auf in vier durch.C-4H und NH, 1, C-3H, ^Jgem ^{= 1}SjOHz, J_v±c = 2,2Hz, J_NH= 1,1Hz), 816 (m, 2,

- 85 -

709822/1027

Stufe D:

Herstellung von 8-Oxo-2,2-dimethyl-3-oxa-l-azabicyclo-/3₃2,o7-octan

OH

-NH

Eine Lösung aus *l-(2-Hydroxyäthyl)-2-azetidinon (1,87 g, 0,016 Mol) und 2,2-Dimethoxypropan (1,69 g, 0,016 Mol) in 25 ml wasserfreiem Methylenchlorid wird mit Bortrifluoridätherat (0,201 ml, 0,002 Mol) bei 25°C behandelt. Die erhaltene Lösung wird 10 Minuten gerührt. Beim Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhält man ein öl (2,5 g). Die Chromatographie des Rohproduktes über einer Kieselgelsäule unter Verwendung von 2:1 Äthylacetat/Benzol als Eluierungsmittel ergibt 8-Oxo-2,2-dimethyl-3-oxa-l-azabicyclöyl}_J2,o7-octan (1,59 g) als kristallinen Peststoff. Beim Umkristallisieren aus Äther/ Hexan erhält man ein Produkt mit dem P. 60 bis 6l°C. IR (CHCl₃)U: 5,73 (ß-Lactam)

KMR (CDC1₃)7: 6,02 - 6,28, m, 2H, C-4 Methylen 6,22 - 6,62, m, IH, C-6 Methin 6,90, dd, IH, J_{7 7} = ItHz, Jf- _n - 4,5 Hz

C-7 Proton eis bis C-6H

7,47, dd, IH, J_{7 7} = 14 Hz, Jg _?

C-7 Proton trans bis D-6H

7,82 - 8,68, m, 2H, C-5 Methylen

8,23, s, 3H 8,57, s, 3H.

= 2Hz

C-2 Methyle

- 86 -

709822/1027

Stufe E;

Herstellung von 8-Oxo-2,2-dimethyl-7oC- und ß-(l-hydroxyäthyl)-(3-oxa-l-azabicyclo-/i,2,₃o7-octan

Zu einer Lösung aus 1,1 Äquivalenten von frisch hergestelltem Lithiumdiisopropylamid in wasserfreiem Tetrahydrofuran unter einer Stickstoffatmosphäre bei -78⁰C wird eine Lösung aus 8-Oxo-2,2-dimethyl-3-oxa-l-azabicyclo-/4_i2_Jo7-octan in wasserfreiem Tetrahydrofuran, das auf -78⁰C gekühlt worden ist, zugegeben. Nach 2 Minuten wird das erhaltene Lithiumenolat mit überschüssigem Acetaldehyd behandelt. Die Lösung wird 30 Minuten bei -78 C gerührt und dann in Wasser gegossen. Die wässrige Phase wird mit Natriumchlorid gesättigt und mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatlösungen werden über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Piltrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man das rohe Produkt erhält. Durch Rei-' nigung mittels Chromatographie über Kieselgel unter Verwendung von Äthylacetat/Benzol erhält man 8-Oxo-2,2-dimethyl-7oi"- und ß-(l-hydroxyäthyl)-3-oxa-l~azabicyclo-/Tj,2,o7-octan.

Daten für 8-Oxo-2,2-dimethyl-7ß-(l-hydroxyäthyl)-3-oxal-azabicyclo-/3,2,o7-octan:
IR (CH₂Cl₂)U : 5,72u (ß-Lactam)

KMR (CDCl₃)T' : 5,53 - 6,^3, m, 4H, C-H Methylen +

C-6 Methin + C-9 Methin

- 87 -

709822/1027

P 26 52 67¹J. 9 Merck & Co., Inc.

1*1. Dezember 1976 15&23Ϊ

⁴ /οχ*

6,90, dd auf breitem s, 2H, J_{7 o} = 9r

6 7

⁰I

7,70 - 8,83, m, 2H, C-5 Methylen

8,27, s, 3H)

8,60, s, 3h]^C-^{2 meth}^

8,78, d, 3H, J_{9 10} - 6,5Hz, C-IO Methyl

Daten für 8-Oxo-2,2-dimethyl-7cC-(l-hydroxyäthyl)-3-oxa-l~ azabicyclo-/*i,2,07-octan:
IR (CHCl₃)p : 2,9.breites 0-H

5,73 ß-Lactam

KMR (Aceton - d^)«/': ^,23 - 3,33, m, C-9 Methin + C-4

Methylen + C-6 Methin

3,33, breites s, OH

2,83, dd, J=2Hz, 6Hz λ _c__{7 Methin}

2,67, dd, J=2Hz, 8HzJ

1,93 - 1,63, m, C-5 Methylen C-2 MethyIe

1,23, d, H=6,5Hz, C-IO Methyl

1,63, sj 1,40, sj

Stufe P:

Herstellung von 8-Oxo-2,2-dimethyl-7o£-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-3-oxa-l-azabicyclo-,A._>2,o7-pctan

OR

neue Seite

709822/1027

Unter wasserfreien Bedingungen wird eine Lösung aus 8-0x0-2,2-dimethyl-7oC-( 1-hydroxyäthyl )-3-oxa-l-azabicy c lo-/3,2,07-octan (60 mg, 0,302 mMol) in 0,6 ml Äther mit pulverisiertem Kaliumhydroxid (19 mg, 0,332 mMol) behandelt. Nach 15 Minuten wird p-NitrobenzyIchlorformat (65 mg, 0,302 mMol) zu der Reaktionsmischung gegeben. Man rührt weitere 15 Stunden bei 25°C. Die Mischung x*ird aufgeteilt zwischen Im pH 7 Phosphatpuffer und weiterem Äther. Die Ätherphase wird mit Wasser und Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Beim Abdampfen des Filtrates unter vermindertem Druck erhält man 67 mg eines farblosen Öls. Reinigung durch präparative Dickschicht-Chromatographie über Kieselgel und Entwickeln mit 1:9 Äthylacetat/Benzol ergibt 8-Oxo-2,2-dimethyl-70C-(l-pnitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-3-oxa-l-azabicyclo-/i,2,07-octan (¹IO mg) als Mischung der Diastereomeren.

IR (CHpClp) u:. 5,68 (ß-Lactam und Carbonat), 6,19 und

6,5¹I (Nitro)

KMR (CDCl₃) : 1,67, d, 2H, ArH

2,37, d, 2H, ArH
4,67, s, 2H, ArCH₂
4,67 - 5,22, m, CH₃CH 5,98-6,25, m, 2H, C-4 Methylen 6,25 - 6,62, m, IH, C-6 Methin 7,75 - 8,83, m, 2H, C-5 Methylen 8,22, s, 3H, C-2 Methyl 8,50 - 8,59, m, 5H₉ C-2 Methyl + CH,CH

Die 7ß-Diastereoisomeren oder die 7oC- und 7ß-Mischungen werden in analoger Weise erhalten.

- 89 - .

70Q822/1027

Stufe G:	OR	_,Λ	/ 2
	0 .
Herstellung von Cis- und. Trans-3-(l-p-Nitrobenzylcarbonyl- diöxyä thy I)-*!- (2-hydroxyäthyl)-2-azetidinon
OR A
Γ
i_
_/\
1 I
X

8-Oxo-3-oxa-2,2-dimethyl-7°^-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-l-azabicyclo-/i,2,o7-octan (1,0 g) wird in 8 ml Essigsäure und 2 ml Wasser gelöst und 1,25 Stunden auf 65 C erhitzt. Die Essigsäure und das Wasser werden unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wird aufgenommen in Benzol und eingedampft, wobei man Trans-3-(1-p-NitrobenzylcarbonyldioxyäthyI)-4-(2-hydroxyäthyl)-2-azetidinon als Mischung der Diastereoisomeren erhält. IR (CH₂CIp)μ : 5,67 (ß-Lactam), 5»72 Schulter, 6,20 und .

6,57 (Nitro)

: 1,73, d, 2H, H=8,5 Hz, ArH . 2,*»3, d, 2H, J = 8,5 Hz, ArH

3,63, breites s, IH, NH

4,37 - 5,13, m, IH, CH₃CH

4,72, s, 2H, ArCH₂

6,07 - 6,53, m, IH, C-4 Methin

6,23, t, 2H, J=5,5 Hz, CH₂OH

6,73 - 6,93, η, IH, C-3 Methin

7,63 - 8,97, m, 3H, CH₂CH₂OH

8,53, d, J=6,5 Hz, CH₃CH

KMR (CDCl₃)

- 9o -

709822/1027

/of-

Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

Stufen p¹, E¹, P¹ und G' als Alternative zu den Stufen D, E, F und G für die Herstellung von 3-(l-p-Nitrobenzylcarb ony ldi oxyäthy 1) - *t- (2-hydroxyäthy1)-azeti dinon

OR

<Γ

OH

JIH

R »

NO

Stufen D', E', P» und G'

Herstellung von l-(2-Tetrahydropyranyl)-ii-/2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl7-2-azetidinon

,OH

Unter Stickstoff und bei 25 C wird eine Lösung aus 4-(2-Hydroxyäthyl)-2-azetidinon (62 mg, 0,539 mMol) in 0,5 ml wasserfreiem p-Dioxan mit 2,3-Dihydropyran

709822/1027

(0,98 ml, l,08 mMol) und p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (19 mg, 0,10 mMol) behandelt. Die erhaltene Lösung wird während 60 Minuten gerührt und dann zwischen 10 ml eines 0,5m pH 7 Phosphatpuffers und 10 ml Äthylacetat geteilt. Die wässrige Phase wird ein zweites Mal mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatlösungen werden mit Salzwasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Piltrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man 216 mg des Rohproduktes erhält. Reinigung durch präparative Dickschicht-Chromatographie und Entwickeln mit Äthylacetat ergibt 80 mg !-^-Tetrahydropyranyl)· 4-/2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl?2-azetidinon als ein öl. : 5,13-5,60, m, OCH

5,83-6,85, m, C-iJH + OCH₂

6,95, dd, J = 5Hz und 15 Hz _c__{3 Kethylen}

7,35, dd, J = 3Hz und 15 Hz

7,62-8,95, m, CHCH₀CH₀CH₀CH,, +

KMR (CDCl₃)

Herstellung von Cis- und Trans-l-(2-Tetrahydropyranyl)-3-(l-hydroxyäthyl)-¹i-/2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl7-2-

azetidinon

Arbeitet man in der für die Herstellung von 8-Oxo-2,2-dimethyl-7o^- und ß-(l-hydroxyäthyl)-3-oxa-l-azabicyclo-/3,2,07-octan aus 8-Oxo-2,2-dimethyl-3-oxa-l-azabicyclo-/3,2,o7-octan beschriebenen V/eise und verwendet l-(2-Tetra-

- 92 -

709822/1027

hydropyranyl)-iW2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl7-2-acetidinon, so erhält man eine diastereomere Mischung von sowohl Cis- und Trans-l-(2-Tetrahydropyranyl)-3-(l-hydroxyäthyl)-¹l-/2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl7-2-azetidinon.

Herstellung von Cis- und Trans-l-(2-Tetrahydropyranyl)-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-ⁱi-/2-(2-tetrahydropy rany1)-οxyäthyl7-2-azetidinon

Arbeitet man wie bei der Herstellung von 8-0x0-2,2-

dimethyl-To^-Cl-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyD-S-oxa-l- · azabicyclo-Ä,2₃o7-octan aus 8-Oxo-2,2-dimethyl-7 -(1-hydroxyäthyl)-3-oxa-l-azabicyclo-/i,2,07-octan und vervrendet Trans-l-(2-Tetrahydropyranyl)-3-(l-hydroxyäthyI)-¹I-/2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl7-2-azetidinon, so erhält man Trans-l-(2-Tetrahydropyranyl)-3-(l~p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-¹t-/2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl7-2-azetidinon. Das Cis-Diastereoisomere wird in analoger V/eise erhalten.

- 93 -

709822/1027

Herstellung von Cis- und Trans-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-^-(2-hydroxyäthyl)-2-azetidinon

OR

OR

/Χ/ Ni

.NH

Eine Lösung aus Trans-l-(2-tetrahydropyranyl)-3-(l-pnitrobenzylcarbonyldioxyät.hyl)-l}-/2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl7-2-azetidinon in Methanol bei 25°C wird mit einem 0,1 molaren Äquivalent von p-ToluolsulfonsSuremonohydrat behandelt. Die Lösung wird 2 Stunden gerührt und dann mit Im pH 7 Phosphatpuffer neutralisiert. Das Produkt wird in Xthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatlösung wird mit Salzwasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man Trans-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-ll-(2-hydroxyäthyl)2-azetidinon erhält. Das Cis-Diastereoisomere wird in analoger Weise erhalten.

-■94 -

709822/1027

Stufe H:

Herstellung von Cis- und Trans-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-/2,2-bis-(2-hydroxyäthyl)-thioäthyl72-

azetidinon

.NH

R =

Unter Stickstoff bei 25 C wird eine Mischung aus wasserfreiem Pyridin (0,146 ml, l,8l mMol) und wasserfreiem, gepulvertem Chromtrioxid (92 mg, 0,916 mMol) in 8 ml wasserfreiem Acetonitril 30 Minuten gerührt. Zu der erhaltenen dunkelbraunen Lösung werden 250 mg trockenes Supercel gegeben und anschliessend daran eine Lösung von Trans-3-(1-p-nitrob enzylcarb onyldi oxyäthy1)-H-(2-hy droxyäthyl)-2-azetidinon (186 mg, 0,550 mMol) in 1 ml wasserfreiem Acetonitril. Nach einstündigem Rühren wird das Reaktionsgemisch durch ein gemischtes gepacktes Bett aus 2 g von jeweils Kieselgel und Magnesiumsulfat filtriert.

- 95 -

709822/1027

Das Bett wird wiederholt gewaschen mit insgesamt 30 ml zusätzlichem Acetonitril. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck bei 25°C auf ein Volumen von 3 ml konzentriert. Durch Dünnschicht-Chromatographie (Kieselgel; Äthylacetat/Benzol 2:1) wird festgestellt, dass diese Lösung ein Produkt enthält (R„ = 0,38), das weniger polar ist als das Ausgangsmaterial (R- = 0,21).

Die Acetonitrillösung von Trans-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-(2-oxoäthyl)-2-azetidinon, die wie oben hergestellt worden ist, wird unter Stickstoff bei 0⁰C mit 2-Mercaptoäthanol (0.386 ml, 5,5 mMol) behandelt und unmittelbar darauf mit Bortrifluorid-ätherat (0,176 ml, 1,43 mMol). Nach 15-minütigem Rühren wird diese Lösung geteilt zwischen wässrigem Dikaliumhydrogenphosphat (1,5 g in 4 ml Wasser) und 12 ml Äthylacetat. Die wässrige Phase wird ein zweites Mal mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetat- lösungen werden mit Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das PiItrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man 229 mg eines Öles erhält. Das Produkt wird durch präparative DickschichtChromatographie über Kieselgel gereinigt und mit Äthylacetat entwickelt, wobei man 118 mg Trans-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-/2,2-bis-(2-hydroxyäthyl)-thioäthyl7-2-azetidinon als ein farbloses öl erhält.

IR (CH₂Cl₂)U : 5,75 (5,79 Schilter) ß-Lactam und Carbonat

6,20, 6,55 Nitro

KMR (Aceton-dgJT·· 1,70, d. J = 8,5 Hz, 2H, ArH

2,28, d, J = 8,5 Hz, 2H, ArH 2,48-2,88, m, IH, NH 4,63, s, ArCH₂ -j

4,63-5,12, m, CH₃CH /

- 96 - 709822/1027

* ΛΑΊΙ. ς

5,80, t, J = 7 Hz, CH₂CH^g

5,80-7,45, m, C-4H + C-3Η;+

7,63-8,33, m, 2H, CH₃CH

8,5-3, d, J = 6,5 Hz 3 H, CH,CH

Die Cis-Diastereoisomeren werden in analoger Weise hergestellt. Alternativ werden die gemischten Diastereoisomeren erhalten, wenn man als Ausgangsmaterial eine Mischung der Diastereoisomeren verwendet.

- 97 - 709822/1027

Stufe I; * /4?.

Herstellung von Trans^-Cl-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-/2,2-bis-(2-azidoäthyl)-thioäthyl7-2-azetidinon

oh

oh

S^/Xs/ + 2CH-SO₉Cl

OCOOPNB

■Stfri

.NH

Zu einer Lösung aus 211 mg (Molgewicht = 47*1; 0,445 mMol) Trans-3-(1-p-nitrobenzylcarb onyIdi oxyäthy1)-4-/2,2-b is-(2-hydroxyäthyl)-thioäthyl7-2-azetidinon in 5 ml Tetrahydrofuran (THP) (destilliert aus Lithiumaluminiunihydrid) bei 0⁰C werden 103 mg Mesylchlorid (Molgewicht = 114; 0,904
mMol) in 1 ml Tetrahydrofuran gegeben und unmittelbar
darauf 134 ul Triäthylamin (Molgewicht 101;β = 0,729;
0,967 mMol). Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde unter Np gerührt. Das Triäthylamin-hydrochlorid wird unter N₃
filtriert und mit einigen ml zusätzlichem THF gewaschen. Das klare farblose Filtrat wird unter einem Strom von Np konzentriert und anschliessend im Hochvakuum 10 Minuten gepumpt. Das Dimesylat wird unmittelbar darauf aufgelöst in 5 ml DMSO (destilliert aus CaHp bei 8 mm und gelagert über einem 4A Linde Molekularsieb) in Gegenwart von 347 mg NaN, (Molgewicht = 65; 5,34 mMol). Nach Rühren über Nacht und unter N- werden 10 ml H-O und 20 ml Äthylacetat (EA) zugegeben. Die Schichten werden getrennt und die wässrige Schicht wird dreimal mit 10 ml EA gewaschen, wobei jede

- 98 -

709822/1027

«Ml

organische Schicht noch einmal gewaschen wird mit 10 ml HpO und 10 ml Salzlösung. Die vereinten Ä'thylacetatschichten werden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert ' und unter einem Np-Strom konzentriert, wobei man das rohe Diazid erhält. Durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel erhält man Trans-3-(l-pnitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-ⁱl-/2,2-bis-(2-azidoäthyl)-thioäthyl7-2-azetidinon. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung werden in analoger Weise erhalten.

Stufe J:

CO₂H

C(OH)₉

I ■

CO₂H

-+ 2NO

Vy. CHN₂ EA/Et₂O

OCOOPNB

OCOOPNB

ToI.

CO₀PNB

! ²

C(OH)₂

CO₂PNB

ο'

SCH₂CH₂N₃

_N OH *

Y . ^H

(CO₂PNB)₂

PNB = CH,,-// \V-N0.

- 99 -

709822/1027

Eine frisch zubereitete (H. Davies und M. Schwarz, J.O.C, 3O₃ 12lJ2 (1965)) Lösung aus p-Nitrophenyldiazomethan (29 mMol) in 150 ml Äther wird unter Rühren zu einer Lösung aus 1,0 g Oxomalonsäuremonohydrat (Molgewicht = 135; 7,35 mMol) in 50 ml Äthylacetat (EA) bei 0 C gegeben. Nach 2 1/2 Stunden wird die gelbe Lösung auf einem Drehverdampfer unter schwachem Erhitzen auf ungefähr das halbe Volumen konzentriert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und wie oben beschrieben, zu einem öl konzentriert. Zu dem rohen p-Nitrobenzy!ester in 50 ml Toluol (ToI.) gibt man 3,5¹J mg Trans-3-(l-p-Nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-/2,2-bis-(2-azidoäthyl)-thioäthyl7-2-azetidinon (Molgewicht = 524; 6>,75 mMol). Das Reaktionsgemisch wird unter Rühren erhitzt auf einem ölbad, wobei man ungefähr 1/3 des Toluols abdestillieren lässt. Toluol (getrocknet über einem 3A I/I6" Linde Molekularsieb) wird wiederum zugegeben, um das Volumen auf 50 ml aufzufüllen und der Azeo-Trocknungs-, prozess x/ird dreimal wiederholt. Die Lösung wird dann unter N₂ eine Stunde rückflussbehandelt und d?r Azeo-Trocknungsprozess wird ein letztes Mal wiederholt und die Rückflussbehandlung wird eine weitere Stunde fortgesetzt. Beim Konzentrieren der erhaltenen Lösung unter einem Strom von M_n erhält man rohes 1. Das Rohmaterial wird chromatographiert über Kieselgel, wobei man 1 erhält. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

- 100 -

709822/1027

Stufe K:

OCOOPNB

j N. D Litiy

H OH (CO₉PN

SOCl,

₂PNB)₂ THF

OCOOPNB

Cl

SCH₂CH₂N₃ SCH₂CH₂N₃

(CO₂PNB) ag. DMF

OCOOPNB

SCH₉CH₉N,

223

(CO₂PNB)₂

- 101 -

709822/1027

Zu einer Lösung aus 2,80 g I^ (Molgewicht= 912; 3,07 mMol) in 35 ml THF (destilliert aus Lithiumaluminiumhydrid) bei -20⁰C werden 0,3 ml Pyridin (Molgewicht = 79;e = 0,982; 3,73 mMol) (destilliert aus NaH und gelagert über einem l\k Linde Molekularsieb) gegeben. Unter Rühren unter Np werden tropfenweise 0,^38 g Thionylchlorid (Molgewicht = 119; 3,68 mMol) in 1 ml THF zugegeben. Die Reaktionsmischung wird unter Np 5 Minuten bei -20°C gerührt und dann 1/2 Stunde bei 0 C und schliesslich 1 Stunde bei 25°C. Das Pyridinhydrochlorid wird unter Np abfiltriert und zweimal mit Benzol (getrocknet über einem 3A I/I6" Linde Molekularsieb) gewaschen. Die vereinten Filtrate und Waschlösungen werden unter einem Np-Strom konzentriert, in einem geringen Volumen Benzol mit wasserfreiem MgSO^ aufgeschlammt, unter Np filtriert und dann unter einem Np-Strom konzentriert. Beim Pumpen unter Hochvakuum während 1/2 Stunde erhält man ein öl. Zu dieser frisch zubereiteten Chlorverbindung gibt man unter Rühren 0,885 g Tripheny!phosphin (Molgewicht = 262; 3,38 mMol) in 66 ml 9:1 Dimethylformamid (DMF)/HpO und anschliessend 550 mg K₂HPO₁J (Molgewicht = 17¹J; 3,16 mMol). Das Reakti ons gemisch wird 35 Minuten bei 25 C gerührt. Nach Verdünnen mit EA und Kochsalzlösung werden die Schichten getrennt und die wässrige Schicht wird dreimal mit EA extrahiert. * Die vereinten EA-Schichten werden mit Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter einem Np-Strom konzentriert, wobei man rohes 2 erhält. Das Material wird über Kieselgel chromatographiert, wobei man 2 erhält. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

- 102 -

709822/1027

Stufe L:_
OCOOPNB

I ^^S-CH₂CH₂N₃ + Br₂ Et₂O/C₅H₁₂

(CO₂PNB)₂

OCOOPNB

_N H

(CO₂PNB)₂ (D

(2) NaH,DMF

OCOOPNB

,SCH₂CH₂N₃

(CO₂PNB)₂ SCH-

Br

- 103 -

709822/1027

Zu 7»8 ml Pentan (getrocknet über einem ¹JA Linde Molekularsieb) werden 0,2 ml Br, (Molgewicht = ΙβΟ; ?= 3,12; 3,9 mMol) gegeben. Zu einer Lösung aus 950 mg J^ (Molgewicht = 896; 1,06 mMol) in 15 ml Diäthylather (getrocknet über einem 3A 1/16" Linde Molekularsieb) gibt man bei 0⁰C und unter Np unter Rühren tropfenweise 2,3 ml der obigen 0,49m Br,,-Lösung (1,13 mMol). Nach'lOminütigem Rühren bei 0⁰C werden 114 jil Cyclohexen (Molgewicht = 82, S- 0,8l; 1,13 mMol) zugegeben. Nach 5 Minuten bei O⁰C werden 53 mg 57#iges NaH (57 % von 53 mg = 30,2 mg, Molgewicht 24, 1,26 mMol) in Mineralöl zu der gerührten Reaktionsmischung gegeben. Darauf unmittelbar gibt man 14 ml eiskaltes DMP (destilliert aus wasserfreiem CaSO₁. bei 40 mm und gelagert über einem 4A Linde Molekularsieb). Das Rühren wird unter N« bei 0⁰C 3 Stunden fortgeführt. Das Reaktionsgemisch wird auf eine gerührte eiskalte Mischung aus 2,5 ml Im KHpPO₂.-40 ml HpO-75 ml EA gegossen. Nach Trennung der Schichten wird die wässrige Schicht mit NaCl gesättigt und nochmals mit EA extrahiert. Die vereinten organischen Schichten werden einmal mit Kochsalzlösung extrahiert, über wasserfreiem MgSO₁. getrocknet, filtriert und unter einem Np-Strom konzentriert und anschliessend in einem Hochvakuum gepumpt, wobei man das rohe 3 erhält. Durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel erhält man 3. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung erhält man in analoger Weise.

- 104 -

709822/1027

Stufe M:

OCOOPNB

Äther /C^H^2

OCOOPNB

Br

i:

:hch.

-Br

"SCH₂CH₂N₃

(CO₂PNB),

+ NaH DHF \

OCOOPNB Br

SCH₂CH₂N₃

(CO₂PNB)₂

- 105 709822/1027

Zu 9,16 ml Pentan (getrocknet über einem 4A Linde Molekularsieb) gibt man 0,2 ml Br₂ (Molgewicht = l60; 3,9 mMol), Zu W mg J5 (Molgewicht = 793; 0,598 mMol) in 13 ml Diäthylather (getrocknet über einem 3A 1/16" Linde Molekularsieb) bei 0 C unter N_? gibt man tropfenweise unter Rühren 1,52 ml der obengenannten 0,42m B^-Lösung (0,63 mMol). Nach 15 Minuten bei 0⁰C werden 33 mg 57#iges NaH (57 % von 33 mg = 18,8 mg; Molgewicht = 24; 0,78 mMol) zugegeben und unmittelbar daran gibt man 6,35 ml eiskaltes DMP (destilliert aus wasserfreiem CaSO^ bei 40 mm und aufbewahrt über einem 4A Linde Molekularsieb) hinzu. Das Reaktionsgemisch wird 1 1/2 Stunden bei 0⁰C gerührt, dann zu einer gerührten eiskalten Mischung von 1,6 ml Im KH₂P0_i{-20 ml HpO und 20 ml EA gegossen. Die Schichten werden getrennt und die wässrige Schicht wird mit NaCl gesättigt und nochmals mit weiterem EA extrahiert. Die vereinten organischen Schichten werden einmal mit Salzwasser gewaschen, getrocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und filtriert. Das Piltrat wird konzentriert unter einem Np-Strom und dann an ein Hochvakuum gelegt, wobei man das rohe J^ erhält. Durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel erhält man 4. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

- 106 -

709822/1027

Stufe N: ^;

OCOOPNB

(CO₂PNB)₂

OCOOPNB

DMSO ^ _N

(CO₂PNB)₂

JL

Zu 210 mg J^ (Molekulargewicht = 87I; 0,241 mMol), gelöst in 0,5 ml DMSO (destilliert aus CaHp bei 8 mm und aufbewahrt über einem 4A Linde Molekularsieb) werden bei 25°C ' unter Rühren 40 mg l,5~Diazobicyclo-/5,4,o7-undec-5-en (destilliert bei 8O°C/2 mm) (Molekulargewicht = 152; 0,263 mMol) in 0,7 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gegeben. Die Lösung wird 4 Stunden unter Np gerührt und dann zu einer gerührten eiskalten Mischung von 0,48 ml Im KHpPO₁., 7 ml HpO und 10 ml EA gegeben. Nach Trennung, der Schichten wird die wässrige Schicht wiederum mit EA extrahiert. Die vereinten organischen Schichten werden einmal mit Salzwasser gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter einem Np-Strom

" ^10? " 709822/1027

konzentriert und anschliessend an ein Hochvakuum gelegt, wobei man das rohe 5 erhält. Durch präparative Dünnschicht· Chromatographie über Kieselgel erhält man 5. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

Stufe 0:

OCOOPNB

Γ '^_SCH₂CH₂N₃+LiI s-ColIidin (CO₂PNB)₂

H CO₂PNB

Zu einer Lösung aus I87 mg 5 (Molekulargewicht = 791; 0,236 mMol) in 2,5 ml s-Collidin (destilliert aus gepulvertem KOH bei 30 mm Druck) werden 4 5 mg wasserfreies LiJ (getrocknet für einige Stunden bei 100⁰C über P₃O unter Vakuum) (Molekulargewicht = 13**; 0,336 mMol) gegeben. Unter Rühren unter N₂ wird das Reaktionsgemisch auf einem ölbad auf 120 C erhitzt. Nach insgesamt 25 Minuten wird die Reaktionsmischung auf 25°C abgekühlt, mit CHpCl₂ verdünnt und in einen Rundkolben überführt, um unter einem Np-Strom und im Hochvakuum zu konzentrieren. Der Rückstand

- 108 -

709822/1027

vrird zwischen 10 ml EA und 1,8 ml Im KHpPO^ in 10 ml HpO geteilt und anschliessend wird die wässrige Schicht 'zwei weitere Male mit EA extrahiert. Die vereinten organischen Schichten werden mit Salzwasser extrahiert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter einem Stickstoffstrom konzentriert, wobei man rohes 6 erhält. Durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel erhält man j5. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

Stufe P:

OCOPNB

T)MSO

SCH₂CH₂N₃ . CO₂PNB

Zu einer Lösung der gemischten Diastereoisomeren 6 (3^ mgj Molekulargewicht = 612; 0,055 mMol) in 0.2 ml DMSO (destilliert aus CaHp bei 8 mm und aufbewahrt über einem HA Linde Molekularsieb) werden unter Rühren zugegeben 9,5 ul 1,5-Diazobicyclo-/5,4,07-undec-5-en (destilliert bei -8O°C/2mm) (Molekulargwicht = 152; C- 1; 0,0625 mMol). Die Lösung

- 109 -

709822/1027

wird unter Stickstoff 15 Minuten gerührt und zu einem Gesamtvolumen von 1 ml mit CHC1„ verdünnt und unmittelbar auf 2 bis ΙΟΟΟμ Kieselgelplatten gegeben. Die Bande des Produktes zeigt 7 an als Mischung von Cis- und Transdiastereoisomeren.

Stufe Q:

OH

2,8 kg/cm*

-CO₂H

In Gegenwart von 6l mg PtO^ werden 6l mg 7 (Molekulargewicht

612; 0,1 mMol) in 6 ml Dioxan, 6 ml THP, 3 ml H₀O H Stun-

den bei einem Druck von 2,8 kg/cm mit Wasserstoff hydriert. Das Reaktionsgemisch wird durch ein Celite-Filter filtriert und mit 2 ml 0,ln pH 7 Phosphatpuffer gewaschen. Nach dem Konzentrieren im Vakuum bis zum Trübungspunkt wird die wässrige Mischung mit Äthylacetat extrahiert. Die wässrige Schicht wird zu einem geringen Volumen konzentriert und auf eine Säule von 100 g XAD-2 Harz gegeben. Beim Eluieren mit H₂O und Verwerfen der Anfangsfraktionen werden die Fraktionen, welche das Produkt enthalten, gefriergetrocknet, wobei man 8 als Mischung von Cis- und Trans-Diastereoisomeren erhält.

- 110 -

709822/1027

Die nachfolgend beschriebene Verfahrensweise für die enzymatische N-Deacylierung von Thienamycin ist anwendbar für alle Isomeren des Thienamycins, besonders für die ausgeprägten N-Acetyl-Isomeren 89OA und 89OA,, die nachfolgend beschrieben sind.

Deacetylierung von N-Acety!thienamycin

Eine 1/Sige (Gewicht/Volumen) Suspension von fruchtbarer Rasenerde wird hergestellt, indem man 1 g der Rasenerde in 100 ml sterile Phosphatpuffer-Salzlösung gibt, wobei die Phosphatpuffer-Salzlösung die folgende Zusammensetzung hat:

Phosphatpuffer-Salzlösung
NaCl · 8,8 g

Im Phosphatpuffer, pH 7,5⁺ 10 ml

destilliertes V/asser 1000 ml

Im Phosphatpuffer, pH 7,5

16 ml Im KHpPOj. werden gemischt mit 84 ml Im K-HPO^. der pH des Phosphatpuffers wird durch Zugabe einer geringen Menge von entweder Im KH₃PO₁. oder Im KpHPOj, auf 7,5 eingestellt.

Aliquote dieser l#igen Vorratserde-Suspension werden hergestellt zur Zubereitung von 1Ox, lOOx und lOOOx-Verdünnungen.

1-ml-Anteile der Vorratssuspension oder 1-ml-Anteile der 1Ox, lOOx und lOOOx-Verdünnungen werden zu 2-ml-Anteilen von sterilen, 1,Obigen Agarlösungen bei 48°C gegeben. Die Mischung wird schnell über die Oberfläche von sterilen Petrischalen von 85 mm Durchmesser, enthaltend 20 ml des Mediums A, gegossen. Medium A hat die folgende Zusammensetzung:

- 111 -

. 709822/1027

Medium A	3,0	g
KH2PO4	7,0	g
K3HPO4	0,1 1000	g ml
MgSO4 destilliertes H„0	8,5	ml
N-Acetyläthanol- aminlösung		N-Acetyläthanolaminlösung

N-Acetyläthanolamin wird lox in HpO verdünnt und membransterilisiert. Diese Lösung wird nach der Autoklavenbehandlung zugegeben. Für feste Medien: Man gibt 20 g Agar zu.

Die Petrischalen werden 18 Tage bei 28°C inkubiert. Eine gut isolierte Kolonie wird aufgenommen und auf einer Petrischale, enthaltend Medium B, ausgebreitet. Medium B hat die folgende Zusammensetzung:

Medium B

Tomatenpaste HO g

gemahlenes Weizenmehl 15 g

dest. Wasser 1000 ml

pH: eingestellt auf pH 6 unter Verwendung von NaOH

Für feste Medien: gibt man 20 g Agar hinzu.

Eine einzelne Kultur wird ausgewählt und 2 Tage bei 28°C auf einer Agarkultur des Mediums B wachsen gelassen. Ein Teil des Wachstums dieser Kultur wird auf die Oberfläche von 6 Kulturen, die aus dem Medium B hergestellt worden sind, ausgebreitet. Diese Kulturen werden 2 Tage bei 28°C inkubiert. Diese Kultur wurde identifiziert als Protaminobacter ruber und bezeichnet mit MB-3528 in der Kulturkollektion von Merck & Co., Ine, Rahway, N.J., USA und eine Probe wurde hinterlegt beim Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Accession No. NRRL B-

- 112 -

709822/1027

/ay

Ein Teil des Wachstums der Agarkultur von Protaminobacter ruber MB-3528 wird verwendet, um einen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 50 ml des Mediums C, zu beimpfen. Medium C hat die folgende Zusammensetzung:

Medium C

Dextrose 20g

Pharmamedia 8g

Flüssigkeit von eingeweichtem Mais (Nassbasis) 5g

destilliertes Wasser 1000 ml

pH: eingestellt auf 7 mit NaOH oder HCl N-Acetyläthanolaminlösung 8,5 ml

N-Acetyläthanolaminlösung"

N-Acetyläthanolamin wird 1Ox in HpO verdünnt

und membransterilisiert. Diese Lösung wird nach der Autoklavenbehandlung zugegeben.

Der Kolben wird bei 28°C und 220 U/Min auf einem Rüttler 4 Tage geschüttelt. Eine 25-ml-Portion aus dem Kolben vrird 15 Minuten mit 8000 U/Min zentrifugiert. Das Überstehende wird entfernt und die Zellen an der Oberflächen des festen Mediums werden abgekratzt und zu einem 0,5 ml 0,05ra Kaliumphosphatpuffer, pH l,h, gegeben. Die erhaltene Suspension wird einer Ultraschallbehandlung unterworfen unter Verwendung eines Branson Instruments Modell LS-75 Sonifier mit einer 1/2 Inch Sonde bei einer Einstellung 4 mit vier 15-Sekunden-Intervallen, während die Suspension vrährend und zwischen den Unterbrechungen in Eiswasser gekühlt wird. Ein 10-ul-AntiLl des schallbehandelten Produktes wird mit 25 ul Lösung, enthaltend 840 μg/ml N-Acety!thienamycin in 10 mMo.l Kaliumphosphatpuffer, pH 7, vermischt und über Nacht bei 28°C inkubiert. Kontrollen, welche das Antibiotikum und Puffer allein enthalten und beschallte Zellen und Puffer

- 113 -

709822/1027

ohne Antibiotikum wurden auch vorgenommen. Nach einer Inkubierung über Nacht bei 28⁰C xirerden 2-pl-Mengen auf cellulosebeschichtete Dünnschichtehromatographie-Platten gegeben, die entwickelt wurden in Äthanol:Η_?0, 70:30. Nach dem Trocknen an der Luft wird die Dünnschichtehromatographie-Platte auf eine mit Staphylococcus aureus ATCC 6538P infizierte Platte 5 Minuten gegeben.

Die infizierten Platten sind wie folgt hergestellt worden: Das über-Nacht-Wachstum des für die Infizierung verwendeten Organismus Staphylococcus aureus ATCC 6538P in Fleischbrühe plus 0,2 % Hefeextrakt wird mit Fleischbrühe plus 0,2 % Hefeextrakt zu einer Suspension verdünnt, die eine 60#ige Durchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 66Ο nm hat. Diese Suspension wird zu Difco-Nähragar, ergänzt mit 2,0 g/l Difco-Hefeextrakt, bei 37 bis 48⁰C gegeben, um eine Zusammensetzung zu erhalten₃ die 33₉2 ml der Suspension pro Liter Agar enthält. HO ml dieser Suspension werden auf Petrischalen, 22,5 cm χ 22,5 cm, gegossen und diese Platten werden gekühlt und bei k°C gehalten bis sie verwendet \*erden (5 Tage Maximum).

Die Dünnschichtchromatographie-Platte \iird entfernt und die den Organismus enthaltende Platte wird über Nacht bei 35°C inkubiert. Ausser dem nicht umgesetzten bio-aktiven N-Acety!thienamycin mit einem Punkt bei R~ 0,7-0,89 wurde ein bio-aktiver Punkt beobachtet bei R_f 0,HH-O₉Hl₃ der dem Thienamycin zugeschrieben wird. Kontrollinkubationsmischungen des Antibiotikums plus Puffer, schallbehandelte Zellen plus Puffer und Antibiotikum plus Puffer, zu denen schallbehandelte Zellen zugegeben worden waren kurz vor der Dünn schi cht chromatografie- Anwendung, zeigten, kein bio-aktives Material bei R_f O,HH-O_SH7.

709822/1027

Herstellung von 89OA₁, einem speziellen Isomeren

OH
/\ /Λ- SCH₂CK₂NHCCH.

N__LL_ COOH

Ein Röhrchen einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces flavogriseus VIA-Hk3^ (NRRL 8139) wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in ein Röhrchen suspendiert, welches 0,8 ml steriles Davis-Salz der folgenden Zusammensetzung enthält:

Davis-Salz

Natriumeitrat 0,5 g

K₂HPO₄ 7,0 g

KH₂PO₄ 3,0 g

3SO₁₁ 1,0 g

^.7H₂O 0,1 g

destilliertes Wasser 1000 ml

Diese Suspension wird verwendet zum Bebrüten von vier Kulturen des Mediums A mit der folgenden Zusammensetzung:

Medium A

Glycerin 20,0 g

primäre Hefe 5,0 g

Fischmehl 15,0 g

destilliertes Wasser 1000 ml

Agar 20,0 g

pH: eingestellt auf 7,2 unter Verwendung von NaOH

Die beimpften Kulturen werden eine Woche bei 27-28⁰C bebrütet und dann bis zur Verwendung bei ty-6 C aufbewahrt.

- 115 -

709822/1027

Eine 1/3-Portion des Wachstums von drei Kulturen wird verwendet, um 9 mit einem Stopfen versehene Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung, zu beimpfen:
Medium B

HefeautoIysat ( Ardamire) 10,0 g

Glukose 10,0 g

Phosphatpuffer ⁺ 2,0 ml

MgSO₁₁^H₂O 50 mg

destilliertes Wasser 1000 ml

pH: eingestellt auf 6,5 unter Verwendung von HCl oder NaOH

Ardamine: Yeast Products Corporation

Phosphatpufferlösung

KH₂PO₄ 91,0 g

Na₂HPO_n 95,Og

destilliertes Wasser 1000 ml

Die die Keime enthaltenden Kolben werden 1 Tag bei 27-28°C auf einem Rüttler mit 220 U/Min geschüttelt. Die Kolben und die Inhalte werden 1 Tag bei h°C aufbewahrt.

2-1-Erlenmeyer-Kolben, jeder enthaltend 250 ml des Mediums C, werden mit 8 ml pro Kolben des Wachstums aus dem die Keime enthaltenden Kolben beimpft. Das Medium C hat die folgende Zusammensetzung: Medium C

Tomatenpaste 20,0 g

primäre Hefe 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

CoCl₂-SH₂O · ' 5,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml

pH: eingestellt auf 7,2-7,4 durch NaOH

- 116 -

709822/1027

21552674

Nach der Beimpfung werden die Produktionskolben bei 24°C bebrütet unter Schütteln auf einem Rüttler, der mit 212 U/Min betrieben wird und zwar für ¹I Tage. Die Kolben werden dann entleert und der Inhalt auf Aktivität untersucht unter Verwendung von Standard Salmonella gallinarum MB1287 und Vibrio percolans ATCC 846l-Platten unter Anwendung von 1,25-cm-Scheiben, welche in die zentrifugierten Brüheproben eingetaucht wurden. Die Proben werden mit 0,02m Phosphatpuffer, pH 7,0, nötigenfalls verdünnt. Die Ergebnisse werden nachfolgend angegeben:

Zeitpunkt der Ernte (Harvest Age

hours )h 96

pH 7,2

Salmonella gallinarum (mm Zone) 29,5

Vibrio percolans 1/10-Verdünnung

(mrn Zone) 31

89O Prüfeinheiten MO

.7 1 der gesamten Fermentationsbrühe werden auf 3°C abgekühlt und in 200-ml-Anteilen mit 9000 U/Min 15 Minuten jeweils zentrifugiert.

Zu den vereinten überstehenden Flüssigkeiten werden 7 ml 0,1m neutrales EDTA gegeben und die ganze Probe wird auf eine Dowex-1 χ 2 (Cl"), 50-100 Maschen-Säule gegeben mit Bettdimensionen von 5*1 x 25 cm und einer Fliessgeschwindigkeit von ¹JO ml/Min. Die Säule wird mit 500 ml entionisiertem Wasser, enthaltend 5 ml Im Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 25 juMol neutrales EDTA, gewaschen. Das Antibiotikum wird mit 1 Liter entionisiertem Wasser, enthaltend 50 g Natriumchlorid, eluiert und die Säule wird dann mit 300 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Fraktionen von 100 ml werden gesammelt, ausgehend vom ersten Auftreten des Salzes am Säulenausgang. Die Bio-Aktivität liegt in den Fraktionen

- 117 -

709822/1027

bis 10 mit einem Peak bei der Fraktion 2 vor. Die Fraktionen 2 bis 5, welche 17 % der angewandten Aktivität enthalten 9 werden zusammengegeben.

Die zusammengegebenen Fraktionen werden auf 110 ml konzentriert mittels eines DrehVerdampfers unter vermindertem Druck und der pH wird auf 5,8 eingestellt durch Zugabe von H_S2 ml Im HCl. Das so eingestellte Konzentrat wird auf eine Säule von XAD-2 gegeben mit einer Bettdimension von 3,8 χ 50 cm, die vorher gewaschen worden war mit 3 1 60#igem wässrigem Aceton (Volumen/Volumen) und anschliessend mit 3 1 entionisiertem Wasser, 3 1 von 5^igem (Gewicht/Volumen) Natriumchlorid und 1 1 25^igem (Gewicht/Volumen) Natriumchlorid in entionisiertem Wasser. Das angewendete Konzentrat lässt man auf das Niveau des Bettes abfliessen. Das Antibiotikum wird eluiert mit entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 15 ml/Min. 22 Fraktionen von jeweils 100 ml v/erden gesammelt, gerechnet von der ersten Anwendung der Probe. Die Bio-Aktivität erscheint in den Fraktionen 6 bis 22 mit einem Peak bei den Fraktionen 9 und 10. Fraktionen 9 bis 20 v/erden für die weitere Verar-. beitung vereint. Ähnlich hergestellte Fraktionen werden vereint und die vereinten Fraktionen werden auf 70 ml konzentriert mittels eines DrehVerdampfers unter vermindertem Druck.

Das Konzentrat wird auf eine Dowex-1 χ H (Cl") 400 Maschen ' Säule mit einer Bettdimension von 2,2 χ 27 cm gegeben. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser gewaschen unddas Antibiotikum eluiert mit 2 1 0,070m NaCl + 0,005m NHhCl + 0,0001m NH, in entionisiertem Wasser mit einer Fliess ges chwindigkeit von 2 ml/Min. Fraktionen von '; 9,5 ml werden gesammelt.

- 118 -

709822/1027

Der Hauptpeak des Antibiotikums wird eluiert in den Fraktionen 1^2 bis 163. Die Fraktionen 146 bis 157 werden vereint für die weitere Verarbeitung.

Die vereinten Fraktionen 146-157 werden konzentriert auf 3 ml durch Verdampfen unter vermindertem Druck auf einem Drehverdampfer und das Konzentrat wird durch Zugabe von 5 Ul Im NH, auf pH 6,5 gebracht. Das Konzentrat wird auf eine Säule (2,2 χ 70 cm) eines Bio-Gel P-2 (200 bis 400 Maschen) gegeben, die vorher geloschen worden war mit 20 ml 5m HaCl und 500 ml entionisiertem Wasser. Nachdem das'Konzentrat auf das Bettniveau abgelaufen war, wurden 2 Spülungen mit jeweils ImI entionisiertem Wasser vorgenommen und wiederum bis zum Bettniveau ablaufen gelassen. Die Säule wird dann eluiert mit entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von o,6 ml/Min. Fraktionen von 2,9 ml werden gesammelt.

Der Hauptpeak des Antibiotikums wird eluiert in den Fraktionen 63 bis 70. Fraktionen 64 und 65 werden für die vreitere Aufarbeitung zusammengegeben.

Die vereinten Fraktionen 64 und 65 werden auf einem Dünnschichtverdampfer unter vermindertem Druck auf 2 ml konzentriert und dann in einer Umhüllung gefroren und lyophilisiert während 8 Stunden in einem 14 ml mit Schraubverschluss versehenen Cefäss, wobei man 2,25 mg des im wesentlichen reinen Antibiotikums 89OA₁ erhält. Die N-Acetylgruppe wird abgespalten, wie vorher beschrieben, wobei man die freie Base erhält;

SCH₂CH₂NH₂ COOH

- 119 -

709822/1027

Herstellung von 89OA_x, einem speziellen Isomeren

Il

_N.

Ein Röhrchen einer lyophilisierten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4434 (NRRL 8139) wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird suspendiert in einem Röhrchen, enthaltend 0,8 ml einer sterilen Davis-Salzlösung der folgenden Zusammensetzung:

Davis-Salz

Natriumeitrat	o,5 ε
K2HPO11	7,0 g
KH2PO4	3,0 g
	1,0 g
MgSO4.7H2O	0,1 g
destilliertes Wasser	1000 ml

Diese Suspension wird verwendet, um 4 Kulturen des Mediums. A der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen:

Medxum A	20,0 g
Glycerin	5,0 g
primäre Hefe	15,0 g
Fischmehl	1000 ml
destilliertes Wasser	20,0 g
Agar

pH: eingestellt auf 7,2 unter NaOH

- 120 -

709822/1027

2052674

Die beimpften Kulturen werden 1 Woche bei 27-28°C bebrütet und dann bei lJ-6°C bis zur Verwendung aufbewahrt (nicht länger als 21 Tage).

Ein 1/3-Anteil des Wachstums aus *1 Kulturen wird zum Beimpfen von 12 verstöpselten 250-ml-Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung, verwendet:

Medium B

Hefeautolysat ( Ardamine)	10,0 g
Glucose	10,0 g
Phosphatpuffer	2,0 ml
MgSO4.7H2O	50 mg
distilliertes H3O	1000 ml
pH: eingestellt auf 6,	5 unter HCl oder NaOH
Ardamine: Yeast Products	Corporation
*+PhOsphatpufferlösung
KH2PO4	91,0 g
Na2HPO11	95,0 g
destilliertes Wasser	1000 ml

Die Flasche mit den Keimen wird 1 Tag bei 27-28⁰C auf einer Rüttelmaschine mit 220 U/Min geschüttelt.· Die Flasche und/ der Inhalt werden 1 Tag bei k°C stationär aufbewahrt.

Μ 2-1-Erlenmeyer-Kolben, jeweils enthaltend 200 ml von Medium C, werden mit 8 ml pro Kolben des Wachstums aus den beimpften Flaschen versetzt. Medium C hat die folgende Zusammensetzung:

Medium C

Tomatenpaste 20,0 g

primäre Hefe 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

- 121 -

709822/1027

CoCl₂.-6H₂O "*%. 5,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml

pH; eingestellt auf T₃Z-J₉H mit NaOH

Nach der Beimpfung werden die Produktionskolben bei 24 C 4 Tage und 5 Stunden auf einer Schüttelmaschine„ die mit 212 U/Min betrieben wird, gerüttelt. Die Kolben werden dann entleert und auf Aktivität untersucht unter Verwendung von Standard Salmonella gallinarum MB128? und Vibro percolans ATCC 846l-Probeplatten unter Verwendung von 1,25 cm-Probescfoeiben_a die in die zentrifugierten Proben der Brühe eingetaucht wurden. Die Proben werden verdünnt mit 0₉2m Phosphatpuffers pH T₉O₅ falls erforderlich. Die Ergebnisse werden nachstehend angegeben:

Zeitpunkt der Ernte (Harvest

Age hours) h 101

pH 7,2

Salmonella gallinarum (mm Zone) 35 Vibrio percolans 1/10 Verdünnung

(mm Zone) 34

890 Probeeinheiten 121

Aus dieser Fermentation werden insgesamt 7 1 der gesamten Brühe erhalten und diese werden auf 3 C abgekühlt und zentrifugiert in 200-ml-Portionen bei 9000 U/Min während je- weils 15 Minuten. Zu den vereinten überstehenden Lösungen werden 1,7 ml von O₉Im neutralem EDTA zugegeben und der Ansatz wird auf 3°C gehalten.

Die obengenannte Fermentation wird unter identischen Bedingungen wiederholt mit der Ausnahme, dass die 44 2-1-. Erlenmeyer-Kolben mit 7 ml pro Flasche des Wachstums aus den die Kulturen enthaltenden Flaschen beimpft werden; der pH und die erhaltenen Prüfergebnisse werden nachfolgend angegeben:

- 122 -

709822/1027

Zeitpunkt der Ernte (Harvest

Age hours) h 101

PH 7,3

Salmonella gallinarum (mm Zone) 38 Vibrio percolans 1/10«Verdünnung

(mm Zone) 39

890 Probeeinheiten 92,8

Insgesamt 7, ^ 1 der gesamten Brühe, die aus dieser Fermentation erhalten worden sind, werden auf 3°C abgekühlt und jeweils 15 Minuten in 200 ml-Portionen bei 9OOO U/Min zentrifugiert. Zu den vereinten überstehenden Lösungen gibt man 1,8 ml 0,1m neutrales EDTA.

Das überstehende von den zentrifugierten Brühen, wie es aus den beiden obengenannten Fermentationen in diesem Beispiel erhalten wurde, wird vereint, wobei man ein Gesamtvolumen von 13 1 erhält.

Die vereinten überstehenden Lösungen werden durch eine Säule aus Dowex-1 χ 2 (Cl**), 50-100 Flaschen mit einer Bettdimension von 4,7 cm χ 50 cm und einer Fliessgeschwindigkeit von βθ ml/Min gegeben. Die Säule wird gewaschen mit 1 1 entionisiertem Wasser und das Antibiotikum wird mit 5 1 einer 5#igen (Gewicht/Volumen) NaCl-Lösung, enthaltend 0,01m Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 25 liMol EDTA- eluiert. Fraktionen von 220 ml werden gesammelt mit einer Fliessgeschwindigkeit von 50 ml/Min und die Fraktionen werden geprüft gegenüber Salmonella gallinarum MB 1287-Platten»

Antibiotische Aktivität liegt vor in den Fraktionen 3 bis 26 mit einem Peak bei den Fraktionen 5 und 6. Die Fraktionen 5 bis 9 werden vereint für die weitere Verarbeitung. Der pH der zusammengegebenen Fraktionen ist 10,8 und die zusammengegebenen Fraktionen enthalten 2H % der Anfangs-Bioaktivität, gemessen gegenüber Salmonella gallinarum MB1287-Platten.

- 123 -

709822/1027

Die vereinten Fraktionen 5 bis 9 werden auf 150 ml mittels eines DrehVerdampfers unter vermindertem Druck konzentriert und auf eine Säule (^,9 cm χ kl cm) von XAD-2 gegeben, die vorher gewaschen worden war mit 5 1 öO^igem (Volumen/Volumen) wässrigem Aceton und anschliessend mit 5 1 entionisiertem Wasser und 5 1 50 g/l MaCl in entionisiertem Wasser. Die Probe wird in 20-ml-Anteilen angewendet, wobei die Säule auf das Bettniveau jedesmal getränkt wird. Wenn die Anwendung beendet ist, werden drei 20-ml-Portionen von entionisiertem Wasser zugegeben und jedesmal auf das Bettniveau fliessen gelassen. Die Probe vrlrd eluiert mit entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 20 ml/Min. Alle Massnahmen, bei denen die XAD-Säule verwendet wird, werden durchgeführt bei Raumtemperatur (2¹J C) und die eluierten Fraktionen werden schnell abgekühlt in einem Eisbad unmittelbar nach dem Sammeln. Fraktionen von 95 bis 230 ml werden gesammelt.

Die antibiotische Aktivität erscheint in Fraktionen 2 bis 21, wie aus einer Probe von Salmonella gallinarum MB1287-Platten gemessen wurde, mit einem Peak bei Fraktionen 5 bis 7 (die 510 bis 895 ml an eluiertem Volumen ausmachen, gerechnet von der ersten Anwendung des entionisierten Wassers). Fraktionen 6 bis 21 v^erden zusammengegeben.

Die zusammengegebenen Fraktionen 6 bis 21 v/erden unter vermindertem Druck auf einem Drehverdampfer auf 68 ml konzentriert und dann durch Zugabe von entionisiertem Wasser auf 112 ml verdünnt. Das Konzentrat wird auf eine Säule (2,2 cm χ 21 cm) von Dowex-1 χ H (Cl ) IJOO Maschen gegeben. Die Säule wird mit 20 ml entionisiertem Wasser gewaschen und das Antibiotikum wird eluiert mit 2 1 0,07m NaCl + 0,005m NiKCl + 0,0001m NH, in entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 1,6 ml/Min. Es werden Fraktionen

- 124 -

7Ö9822/1027

von jeweils 8 ml gesammelt. Fraktionen 157 bis 179 haben die grÖsste Aktivität und werden zusammengegeben.

Diese zusammengegebenen Fraktionen werden konzentriert auf einem Dreh verdampf er unter vermindertem Druck auf 7 ir.l, der pH wird auf 7₃ 5 durch Zugabe von 20 ul Im NaOH eingestellt. Die Lösung wird weiter konzentriert auf 5 ml und auf eine Säule gegeben (2,2 χ 75 cm) von Bio-Gel P-2, 200 bis ¹IOO Maschen. Die Probe wird in dem Säulenbett mit zwei Waschungen von jeweils 1 ml entionisiertem Wasser gewaschen und eluiert mit entionisiertem V/asser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,6 ml/Min. Zehn Fraktionen von 3»3 ml und anschliessend 60 Fraktionen von 2,65 ml und zehn Fraktionen von 2,0 ml werden gesammelt.

Die Fraktionen werden auf den pH-Bereich zwischen 7,5 und 8,0 durch Zugabe von 1,5 bis 2,5 μΐ 0,1m MaOH eingestellt. Die Fraktionen 62, 63, SH und 65 werden gefroren und einzeln in 14-ml-Glasröhrchen lyophilisiert und bei -20⁰C unter Vakuum aufbewahrt*

- 125 -

709822/1027

Zur Isolierung des Antibiotikums 89OA, aus 89OA₁ macht man von dem Vorteil Gebrauch der relativ höheren Beständigkeit des Antibiotikums 89OA, gegen Abbau durch Penicillinase in der folgenden Weise:

Bio-Gel Fraktion 63 wird kombiniert mit Fraktionen 61, 66 und 67 aus der Bio-Gel Säule. Zu diesen vier vereinten Fraktionen werden 0,2 ml Im Tris-HCl-Puffer, pH, 7,5, und 0,2 ml Penicillinase (Difco "Bacto-Penase") gegeben. Nach 113 Minuten bei 23°C werden weitere 0,2 ml Penicillinase hinzugefügt. Nach weiteren 7 Stunden bei Raumtemperatur werden weitere 0,2 ml Penicillinase zugegeben, und nach weiteren 2 Stunden bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch auf einem Eisbad abgekühlt. Das fertige Reaktionsgemisch wird auf 15 ml durch Zugabe von 5 ml entionisiertem Wasser verdünnt.

Das Reaktionsgemisch wird adsorbiert an einer Dowex χ h (Cl") 400 Maschen-Säule, Bettdimension 2,15 x ¹JO cm. Das Antibiotikum 89OA, wird eluiert mit 0,07m NaCl + 0,005m NHkCI + 0,0001m NH, in entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 3 ml/Min. Fraktionen von 13,8 ml werden jeweils gesammelt. Fraktionen I87 bis 200 werden zusammengegeben.

~¹²⁶~ 709822/1027

Die vereinigten Fraktionen werden konzentriert auf ¹I ml mittels eines. Drehverdampfers unter vermindertem Druck und das Konzentrat wird auf eine Säule (2,2 χ 70 cm) Bio-Gel P-2, 200-^00 Maschen, aufgegeben. Das Antibiotikum 89OA-, wird mit entionisiertem Wasser eluiert mit einer FIiessgeschwindigkeit von 0,6 ml/Min. 30 Fraktionen von 3,3 ml- und anschliessend 50 Fraktionen von 2,65 ml werden gesammelt.

Fraktionen 66 bis 70 werden vereint und die vereinten Proben werden auf 1,5 ml unter vermindertem Druck mittels eines Drehverdampfers konzentriert und das Konzentrat wird gefroren und gefriergetrocknet, wobei man 5,4 mg eines Feststoffes erhält, der das Antibiotikum 89OA, und restliches Salz enthält. Die N-Acety!gruppe ist abgespalten, wie vorher beschrieben, so dass man die freie Base erhält: .

OH

N * I r.nn

. N M πηηπ

Das Antibioticum Thienamycin^und seine Herstellung sind beschrieben in DT-OS 25 52 638. Es ist erhältlich durch Züchten des Mikroorganismus Streptomyces cattleya (MA-4297), von dem eine Kultur bei der KuItürSammlung der Northern ' Regional Research Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.St.A. hinterlegt und mit NRRL 8057 bezeichnet ist.

- 127 -

7 09822/1027

Claims (1)

15813Y

PATENTANSPRÜCHE

1/ Pharmakologisch verträgliche Carbonsäuren (sowie deren •^ Ester, Amide und Anhydride) der nachstehenden allgemeinen Formel

OH

—/\_ SCH₂CH₂NR¹R² —N ±- COOH

2 1

wobei R einen Acylrest und R ein Wasserstoff atom oder einen Acylrest bedeuten.

2. Verbindungen der nachstehenden allgemeinen Formel

OH

SCH₂CH₂NR¹R²

σ*

in der X ein Sauerstoff- odsr Schwefelatom oder einen Rest TOi* (R* = H oder R),

R ein Wasserstoff atom (X ist kein Sauerstoffatom), einen Alkylrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, einen Phenacylrest oder kernsubstituierten Phenacylrest, wobei der Substituent ein Chlor-, Brom- oder Fluoratom oder ein Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, einen Alkoxyalkylrest, wobei der Alkoxyanteil offenkettig oder cyclisch ist und 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist und der Alkylanteil 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, einen Alkanoyloxyalkylrest mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, einen Halogen- oder Perhalogenalkylrest, wobei das Halogenatom ein Chlor-, Brom- oder Fluoratom ist und die Alkylkette 2 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, einen Alkenylrest mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, einen Alkoxycarbonylalkylrest mit 3 bis 14 Kohlenstoffatomen, einen Dialkylaminoacetoxyalkylrest mit 4 bis 21 Kohlenstoffatomen, einen Alkanoylamidoalkylrest mit 2 bis 13

- 128 -

709822/1027

15813Y 2 S 5.2674

Kohlenstoffatomen, einen Aralkylrest, wobei der Alkylanteil 1 bis 3 Kohlenstoffatome und der Arylanteil 6 bis 10 Kohlenstoffatome aufweisen, einen mono- oder bicyclischen Hetero aralkylrest mit 4 bis 10 Ringatomen und 1 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkylanteil, wobei das Heteroatom ein Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom darstellt, exften kernsubstituierten Aralkyl- oder Heteroaralkylrest, wobei der Substituent ein Chlor-, Fluor-, Brom- oder JOdatom oder ein ITieder-alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, einen Nieder-alkanoyloxyrest mit 1 bis S Kohlenstoffatomen oder Nieder-alkoxyrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einen mono- oder bicycli-. . sehen Heterocycloalkylrest, wobei der Heterocyclus. 4 bis 10 Atome aufweist und das Heteroatom ein Sauerstoff-, Schwefel- o4er Stickstoffatom darstellt und der Alkyla^rtsil 1 ^xS 6 Kohlenstoff atone aufweist, ein Arylrsst oder kemsubetituierter Arylrest mit 6 bis 10 Ringkoh-Ien3 toi χ atomen, wobei der Kernsubstituent eine Hydroxylgruppe, ein Nieler-alkylrscit mit' 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, am Chlor-, Fluor- oder Bromatom oder ein Alkyl— . thioalkylrest mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen ist, einen Cycloalkylthioalkylrest mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen oder einen Aoylthioalkylrest, wobei der Acylanteil 2 bis 10 Kohlenstoff atome und der Alkylanteil 1 bis 6 Kohlenstof f ate ins aufweisen.

2
E einen Aeyirest und

R. einen Acyi_res-{; oder ein Wasserstoffatoni bedeuten.

3. Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Aeyirest ein Rest der nachstehenden allgemeinen Formel ist

ti

-C-R

wobei X ein Sauerstoff- oder Schwefelatom, R ein Wasserstoff atom, eine Amino gruppe oder einen Alkylamino-, Diaikylamino-, Alkyl-, Alkylthio-, Arylthio-,

709822/10 27

- 129 -

1813Υ

Alkoxy-, Aryloxy-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Cycloalkyl-, Heteroaryl- oder Hetdroaralkylrest "bedeuten.

4. Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Acylrest ein Best der nachstehenden allgemeinen Formel ist

wobei X ein Sauerstoff- oder Schwefelatom, R ein Wasserstoffatom, eine Amino-, Mercapto- oder Hydroxylgruppe oder einen Alkylamino-, Dialkylamino-, Alkyl-, Alkylthio-, Arylthio-, Alkoxy-, Aryloxy-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Cycloalkyl-, Heteroaryl- oder Heteroaralkylrast,
η 0, 1, 2, 3 oder 4 und

Z ein Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom oder eine Carbonylgruppe bed-auten, mit der Maßgabe, daß, wenn Z ein Sauerstoffatom darstellt, R keine Mercapto- oder Hydroxylgruppe ist, wenn Z ein Schwefelatom darstellt, R keine Amino- oder Hydroxylgruppe ist, und wenn Z ein Stickstoffatom darstellt, R keine Mercaptogruppeist.

5· Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daS der Acylrest ein Rest der nachstehenden allgemeinen Formel ist

X
-CCHRR·

wobei X ein Sauerstoff- oder Schwefelatom, R ein Wasserstoffatom, eine Amino-, Mercapto- oder Hydroxylgruppe oder einen Alkylamino-, Dialkylamino-, Alkyl-, Alkylthio-, Arylthio-, Alkoxy-, Aryloxy-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Cycloalkyl-, Heteroaryl- oder Heteroaralkylrest und

R^f eine Amino-, Hydroxyl-, Azido-, Carbamoyl- oder Guanidinogruppe, einen Acyloxyrest, ein Halogenatom, eine

- 130 709822/10 27

15813Y .^.. 2552674

Sulfamino-, Tetrazolyl-, Sulfo- oder Carboxylgruppe, einen Carbalkoxyrest, eine Phosphonogruppe oder einen Alkoxy- oder Arylthiorest bedeuten, mit der Maßgabe, daß nicht beide Reste R und R* zugleich eine Hydroxyl-, Amino- oder Mercaptogruppe sein können.

6. Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Acylrest ein Rest der nachstehenden allgemeinen Formeln ist

⁽⁰>m ^(X)n

κ ω ti ⁿ

-S-Y -P-Y*

(O)_n Y"

wobei X ein Sauerstoff-oder Schwefelatom, R ein Wasserstoff atom, eine Amino-, Mercapto-oder Hydroxylgruppe oder ein Alkylamino-, Dialkylamino-, Alkyl-, Alkylthio-, Arylthio-, Alkoxy-, Aralkoxy-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Cycloalkyl-, Heteroaryl- oder Heteroaralkylrest, m und η •unabhängig voneinander jeweils O oder 1, Y 0® Mr, -NRp oder R (wobei l!r ein Wasserstoff atom, ein Alkali- oder Erdalkalimetallkation oder ein von einer organischen Base abgeleitetes Kation darstellt), sowie Y' und Y" unabhängig voneinander jeweils O M , -NRg oder R sind, wobei Y* und Y" auch verknüpft sein und zusammen mit dem Phosphoratom, an welches sie gebunden sind, cyclische Ester oder Amide bilden können.

7. Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Acylrest ein Rest der nachstehenden allgemeinen Formel ist

wobei m und η jeweils eine ganze Zahl von O bis 5, A ein Sauerstoffatom, NR¹ (R¹ ist ein Wasserstoffatom oder ein Nieder-alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), ein Schwefelatom oder eine einfache Bindung und Y einen der folgenden Reste darstellen:

709822/1027

- 131 -

/ er ·

1) eine Aminogruppe oder substituierte Aminogruppe der allgemeinen Formeln

-N(R)₂ und -S(R)₅

wobei die Reste R unabhängig voneinander jeweils ein Wasserstoffatom, N(R¹)₂ (R¹ ist ein Wasserstoffatom oder ein Nieder-alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), einen Nieder-alkyl- oder Nieder-alkoxyrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einen Nieder-alkoxynieder-alkylrest, wobei der Alkoxyanteil 1 bis 6 Kohlenstoffatome und der Älkylanteil 2 bis 6 Kohlenstoff atome aufweisen, oder einen Cycloalkyl- oder Cycloalkylalkylrest, wobei der Cycloalkylanteil 3 bis 6 Kohlenstoffatome und der Älkylanteil 1 bis 3 Kohlenstoffatome aufweisen, bedeuten, wobei zwei R-Reste verknüpft sein und zusammen mit dem N-Atom, an welches sie gebunden sind, einen Ring mit 3 bis 6 Atomen bilden können;

2) eine Amidino- oder substituierte Amidinogruppe der allgemeinen Pormel

-N=C-N(R)₉
R

wobei die Reste R unabhängig voneinander jeweils ein Wasserstoffatom, N(R^f)₂ (R¹ ist ein Wasserstoffatom oder ein Nieder-alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), einen Nieder-alkyl- oder Nieder-alkoxyrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einen Nieder-alkoxynleder-alkylrest, wobei der Alkoxyanteil 1 bis 6 Kohlenstoffatome und der Älkylanteil 2 bis 6 Kohlenstoff atome aufweisen (wenn der Nieder-alkoxy-nieder- ·

- 132 709822/1027

alkylrest an ein Kohlenstoffatom gebunden ist, "beinhaltet der Alkylanteil 1 bis 6 Kohlenstoffatome), oder einen Cycloalkyl- oder Cycloalkylalkylrest, wobei der Alkylanteil 1 bis 3 Kohlenstoffatome aufweist, bedeuten, wobei zwei Reste R verknüpft sein und zusammen mit den Atomen, an welche sie gebunden sind, einen Ring mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bilden können;

3) eine Guanidino- oder substituierte Guanidinogruppe der allgemeinen Formel

-NH-C-N(R)₀

I! ^

NR
wobei R die bei 2) angegebene Bedeutung hat;

4) eine Guanyl- oder substituierte Guanylgruppe der allgemeinen Formel

-C=NR
N(R)₂

wobei R die bei 2) angegebene Bedeutung hat; oder

5) einen stickstoffhaltigen, mono- oder bicyclischen heterocyclischen (aromatischen oder nicht-aromatischen) Rest mit 4 bis 10 Kern- bzw. Ringatomen, wobei das (die) Heteroatom(e) außer Stickstoff (ein) Sauerstoff- und/oder Schwefelatomee) ist (sind).

8· Verbindungen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,

1 2

daß R ein Wasserstoffatom und R einen Acylrest der nachstehenden allgemeinen Formel darstellen

-C-R

709822/102 7
- 133 -

in der R eine Benzyl-, p-Hydroxybenzyl-, 4-Amino-4-carboxybutyl-, Methyl-, Cyanmethyl-, 2-Pentenyl-, n-Amyl-, n-Heptyl-, Ithyl-, 3-oder 4-Nitrobenzyl-, Phenäthyl-, β,ß-Diphenyläthyl-, Methyldiphenylmethyl-, Triphenylmethyl-, 2-Methoxyphenyl-, 2,6-Dimethoxyphenyl-, 2,4,6-Trimethoxyphenyl-, 3»5-Dimethyl-4-isoxazolyl-, 3-Butyl-5-aiethyl-4~isoxazolyl-, 5-Methyl-3-phenyl-4-isoxazolyl-, 3-(2-Chlorphenyl)-5-methyl-4-isoxazolyl-, 3-C²»6-Dichlorphenyl)-5-methyl-4-isoxazolyl-, D-4-Amino-4-earboxybutyl-, D-4-N-Benzoylaπlino-4-carboxy-nbutyl-, p-Aminobenzyl-, o-Aminobenzyl-, m-Aminobenzyl-, p-Dimethylaminobenzyl-, (3-Pyridyl)-methyl-, 2-Xthoxy-1-naphthyl-, 3-Carboxy-2-chinoxalinyl-, 3-(2,6-03ichlorphenyl)-5-(2-furyl)-4-isoxazolyl-, 3-Phenyl-4-isoxazolyl-, 5-Methyl-3-(4-guanidinophenyl)-4-isoxazolyl-, 4-Guanidinomethylphenyl-, 4-G-uanidinomethylbenzyl-, 4-Guanidinobenzyl-, 4-Guanidinophenyl-, 2,6-Dimethoxy-4-gTianidinophenyl-, o-Sulfobenzyl-, p-Carboxymethylbenzyl-, p-Oarbamoylmethylbenzyl-, m-Pluorbenzyl-, m-Brombenzyl-, p-Ghlorbenzyl-, p-Methoxybenzyl-, 1-Naphthylmethyl-, 3-Isothiazolylmethyl-, 4-Isothiazolylmethyl-, 5-Isothiazolylmethyl-, Guanylthiomethyl-, 4-Pyridylmethyl-, 5-Isoxazolylmethyl-, 4-Methoxy-5-isoxazolylmethyl-, 4-Methyl-5-isoxazolylmethyl-, 1-Imidazolylmethyl-, 2-Benzofuranylmethyl-, 2-Indolylmethyl-, 2-Phenylvinyl-, 2-Phenyläthinyl-, I-Amiriocyclohexyl-, 2- oder 3-Thienylaminomethyl-, 2-(5-Nitrofuranyl)-vinyl-, Phenyl-, o-Methoxyphenyl-, o-Chlorphenyl-, o-Phenylphenyl-, p-Aminomethylbenzyl-, 1-(5-Cyantriazolyl)-methyl-, Difluormethyl-, Dichlormethyl-, Dibrommethyl-, 1-(3-Methylimidazolyl)-inethyl-, 2- oder 3-(5-Carboxymethylthienyl)-methyl-, 2- oder 3-(4-Carbamoylthienyl)-methyl-, 2- oder 3-(5-Methylthienyl)-methyl-, 2- oder 3-(5-Methoxythienyl)-methyl-, 2- oder 3-(4-Chlorthienyl)-methyl-, 2- oder 3-(5-Sulfothienyl)-methyl-, 2- oder 3-(5-

2-2/1027

Carboxythienyl)-methyl-, 3-(1,2,5-Thiadiazolyl)-methyl-, 3-(4-Methoxy-1,2,5-thiadiazolyl)-methyl-, 2-Furylmethyl-, 2-(5-Nitrofuryl)-methyl-, 3-Furylmethyl-, 2-Thienylmethyl-, 3-Thienylmethyl-, Tetrazolylmethyl-, Benzamidinomethyl- oder Cyclohexylamidinomethylgruppe bedeutet.

9· Verbindungen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,

1 2

daß R ein Wasserstoffatom und R einen Acylrest der nachstehenden allgemeinen Formel bedeuten

-C

wobei der Anteil -(CHg)_nZR des Acylrests eine Allylthiomethyl-, Phenylthiomethyl-, Butylmercaptomethyl-, a-Chlorcrotylmercaptomethyl-, Phenoxymethyl-, Phenoxyäthyl-, Phenoxybutyl-, Phenoxybenzyl-, Diphenoxymethyl-r Dimethylmethoxymethyl-, Dimethylbutoxymethyl-, Dime thylphenoxymethyl- , 4-Gruanidinophenoxyme thyl-, 4-Pyridylthiomethyl-, p-(Carboxymethyl)-phenoxymethyl-, p-(Carboxymethyl)-phenylthiomethyl-, 2-Thiazolylthiomethyl-, p-(Sulfo)-phenoxymethyl-, p-(Carboxymethyl)-phenylthiomethyl-, 2-Pyrimidlnylthiomethyl-, Phenäthylthiomethyl-, 1-(5»6,7,8-Tetrahydronaphthyl)-oxymethyl-, K-Methyl-4-pyridiniumthio-, Benzyloxy-, Methoxy-, Äthoxy-, Phenoxy-, Phenylthio-, Amino-, Methylamino-, Dimethylamino-, Pyridiniummethyl-, Trimethylammoniummethyl-, Cyanmethylthiomethyl-, Trifluormethylthiomethyl-, 4-Pyridyläthyl-, 4-Pyridylpropyl-, 4-Pyridylbutyl-, 3-Imidazolyläthyl-, 3-Imidazolylpropyl-, 3-Imidazolyl- "' butyl-, 1-Pyrroloäthyl-, 1-Pyrrolopropyl- oder 1-Pyrrolobutylgruppe darstellt«

2 2/1027

10. Verbindungen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,

1 2

daß R ein Wasserstoffatom und R einen Acylrest der nachstehenden allgemeinen Formel bedeuten

Il

-CCHRR^f

wobei der Anteil -CHRR* des Acylrests eine a-Aminobenzyl-, a-Amino-(2-thienyl)-methyl-, a-(Methylamino)-benzyl-, a-Aminomethylmercaptopropyl-, a-Amino-3- oder -4-chlorbenzyl-, a-Amino-3- oder -4-hydroxybenzyl-, a-Amino-2,4-dichlorbenzyl-, a-Amino-3»4-dichlorbenzyl-, D-(-)-a-Hydroxybenzyl-, a-Carboxybenzyl-, a-Amino-{3-thienyl)-methyl-, D-(-)-a-Amino-3-chlor-4-hydroxybenzyl-, a-Amino-Ccyclohexyli-methyl-, a-(5-Tetrazolyl)-benzyl-, 2-Thienylcarboxymethyl-, 3-Thienylcarboxymethyl-, 2-Purylcarboxymethyl-, 3-Furylcarboxymethyl-, α-Sulfaminobenzyl-, 3-Thienylsulfaminomethyl-, a-(Ef-Methylsulfamino)-benzyl-, D-(-)-2-Thienylguanidinomethyl-, D-(-)-a-Gaianidinobenzyl-, a-Guanylureidobenzyl-, a-Hydroxybenzyl-, a-Azidobenzyl-, a-Pluorbenzyl-, 4-(5-Methoxy-1,3-oxadiazolyl)-aminomethyl-, 4-(5-Methoxy-1,3-oxadiazolyl)-hydroxymethyl-, 4-(5-Methoxy-1,3-sulfadiazoiyl)-hydroxymethyl-, 4-{5-Chlorthienyl)-aminomethyl-, 2-(5-Chlorthienyl)-hydroxymethyl-, 2-(5-Chlorthienyl)-carboxymethyl-, 3-(i»2-Thiazolyl)-aminomethyl-, 3-(1,2-Thiazolyl)-hydroxymethyl-, 3-(1,2-Thiazolyl)-carboxymethyl-, 2-Thiazolylaminomethyl-, 2-Thiazolylhydroxymethyl-, 2-Thiazolylcarboxymethyl-, 2-Benzothienylcarboxymethyl-, 2-Benzothienylhydroxymethyl-, 2-Benzothienylcarboxymethyl-, a-Sulfobenzyl-, a-Phosphonobenzyl-, a-Diäthylphosphono- oder a-Monoäthylphosphonogruppe darstellt.

11, Verbindungen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,

1 2

daß R ein V/asser stoff atom und R einen der nachstehen-

709822/1027

15813Y

den Acylreste darstellen:

NH

-CCH ₂CH ₂NHC-CH₃ -L ₂CH J-H 0
Il
-CCH ₂CH Γ
₂NHC-NH₂ O
et- ti ₂CH _ON"(CH-.) _
λ J 2 -fccH, ,CH. ,N(CH-) , Ο NH
-CCH₂CH₂C-NH₂

NH

ο
Il

-CCH.

(CH₃)

^CH₃)

NH

CCH₀S-C
2

NH.

_OS-CH_ 2 2

NH.

NH

-CCH₀-O-CH₀C

^{2 2}

9 8 22/1027

- 137 -

yf/I .

12. Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R

ρ
em Wasserstoffatom und R eine Formyl-, Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, Chloracetyl-, Methoxyacetyl-, Aminoacetyl-jMethoxycarbonyl-, Äthoxycarbonyl-, Methylcarbamoyl-, Äthylcarbamoyl-, Phenylthiocarbonyl-, 3-Aminopropionyl-, 4-Aminobutyryl-, N-Methylaminoacetyl-, N,N-Dimethylarainoacetyl-, NjNjN-Trimethylaminoacetyl-, 3-(N,N-Dimethyl)-arainopropionyl-, 3-(N,N,N-Trimethyl)-aminopropionyl-, NjIiyN-Triäthylaminoacetyl-, Pyridiniumacetyl-, Guanylthioacetyl-, Guanidinoacetyl-, 3-OrU.anidinopropionyl-, N^-Methylguanidinopropionyl-, Hydroxyacetyl-, 3-Hydroxypropionyl-, Acryloyl-, Propinoyl-, Malonyl-, Phenoxycarbonyl-, Amidinoacetyl-, Acetamidinoacetyl-, Amidinopropionyl-, Acetamidinopropionyl-, Guanylureidoacetyl-, Guanylcarbamoyl-, Carboxymethylaminoacetyl-, Sulfoacetylaminoacetyl-, Phosphonoaeetylaminoacetyl-, N -Dimethylaminoacetamidinopropionyl-, Ureidocarbonyl-, Diinethylaminoguanylthioacetyl-, 3-(1-Methyl-4-pyridinium)-propionyl-, 3-(5-Aminoimidazol-1-yl)-propionyl-, 3-Methyl-1-imidazoliumaeetyl-, 3-Sydnonylacetyl-, o-Aminomethylbenzoyl-, ο-Aminobenzoyl-, SuIfο- oder Phosphonogruppe oder einen der-nachstehenden Reste O S S 0

_{2 2} ^

^s * ^J * OM
OSS
() ^i() 7P

· OM .

wobei M ein Wasserstoff atom oder ein Alkali- oder Erdalkalimetallkation darstellt, bedeuten.

Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß .X ein Sauerstoffatom und R ein Wasserstoff atom oder eine Methyl-, tert.-Butyl-, Phenacyl-, p-Bromphenacyl-, Pivaloyloxymethyl-, 2,2,2-Trichloräthyl-, Allyl-, 3-Methyl-2-butenyl-, 2-Methyl-2-propenyl-, Benzyl-, Ben-

- 138 709822/1027

zylhydryl-, p-tert.-Butylbenzyl-, Phthalidyl-, Phenyl-, 5-Indanyl-, Acetylthiomethyl-, Acetoxymethyl-, Propionyloxymethyl-, Methallyl-, 3-Butenyl-, 4-Pentenyl-, 2-Butenyl-, Acetoxyacetylmethyl-, Pivaloylacetylmethyl-, Diäthylamino-, Dimethylamine)äthyl-, Methoxymethyl-, p-Acetoxybenzyl-, p-Pivaloylbenzyl-, p-Isopropoxybenzyl-, 5-Indanylmethyl-, Benzyloxymethyl-, Methylthioäthyl-, Dimethylaminoacetoxymethyl-, Crotonolacton-S-yl-, Ac'etamidomethyl-, Acetyl thioäthyl-, Pivaloylthiomethyl- oder Methylthiomethylgruppe darstellen.

14. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der nachstehenden allgemeinen Formel

SCH₂CH₂NR¹R² 0OM

1 2
in der R und R jeweils ein Wasserstoff atom oder einen Acylrest bedeuten und M ein Alkali- oder Erdalkalimetallkation darstellt, mit einem zur Einführung des Substituenten XR geeigneten, aktiven Halogenidreagens zur Umsetzung bringt. .

15. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der nachstehenden allgemeinen Formel

OH

-N-

₂CH₂

-COOH

1 2
in der R und R jeweils ein Wasserstoff atom oder einen Acylrest bedeuten, mit einem zur Einführung des Substi-

- 139 709822/1027

^15813Y 2552674

•43.

tuenten XR geeigneten Diazoalkan zur Umsetzung bringt,

16. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der nachstehenden allgemeinen Formel

SCH₂CH₂NR¹R²

COOH

1 2
in der R und R jeweils ein Wasserstoff atom oder einen Acylrest bedeuten, in Gegenwart eines Kondensationsmittels mit einem zur Einführung des Substituenten XR geeigneten Alkohol, Thioalkohol oder Alkylamin zur Umsetzung bringt.

17. Verfahren, zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der nachstehenden allgemeinen Formel

SCH₂CH₂NR¹R² COOM

12

in der R und R jeweils ein Wasserstoff atom oder einen Acylrest bedeuten und M den Rest eines labilen Esters oder Anhydrids darstellt, mit einem zur Einführung des Substituenten XR geeigneten Alkohol, Thioalkohol oder Alkylamin zur Umsetzung bringt.

18. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Verbindung nach Anspruch 1 neben den üblichen Hilf s- und/ oder Konfektionierungsmitteln. ■

19. Arzneimittel, enthaltend in Einzeldosierungsform eine

822/1027

therapeutisch, wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 neben den üblichen Hilfs- und/oder Konfektionierungsmitteln.