DE2604993A1

DE2604993A1 - Verfahren zur zuechtung von mikroorganismen

Info

Publication number: DE2604993A1
Application number: DE19762604993
Authority: DE
Inventors: Behzad Khosrovi; Harshad Topiwala
Original assignee: Shell Internationale Research Maatschappij BV
Current assignee: Shell Internationale Research Maatschappij BV
Priority date: 1975-02-11
Filing date: 1976-02-09
Publication date: 1976-08-19
Also published as: GB1528011A; CA1059049A; IT1055875B; IE42634L; BE838312A; NL7601314A; NO760414L; FR2300803B1; FR2300803A1; IE42634B1

Description

SHBIL INTERNATIONALE RESEARCH MAATSCHAPPIJ B.V. Garel van Bylandtlaan 30, 2076 Den Haag- Niederlande

"betreffend
Verfahren zur Züchfimg von Mikroorganismen

Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Züchtung bzw. Erzeugung von.Mikroorganismen. Es sind viele Mikroorganismen bekannt, die Kohlenwasserstoffe oder bestimmte Derivate davon als Kohlenstoff-und/oder Energiequelle verwenden können. Die durch Züchtung solcher Mikroorganismen erhältliche Biomasse, die häufig als Einzelzellprotein bezeichnet wird, ist reich an Protein und kann als möglicher Nährstoff oder Nährstoffzusatz für Menschen und Tiere verwendet werden.

Ein Verfahren zur Züchtung von Kohlenwasserstoff verbrauchenden Mikroorganismen umfaßt üblicherweise die Züchtung solcher Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Wachstumsmedium, umfassend neben der Kohlenstoffquelle verschiedene Nährstoffe wie assimilier-

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ORIGINAL INSPECTEP

"bare Stickstoffquellen und essentielle Mineralsalze. Ein derartiges Verfahren kann in einzelnen Ansätzen harbkontinuierlioh und vorzugsweise in einer kontinuierlichen Fließkultur durchgeführt werden. Bei einer kontinuierlichen Fließkultur kann der Mikr.oOrganismus in irgendeinem geeigneten Fermentationsgefäß (Fermentor) gezüchtet v/erden. Die Mikroorganismus-Zellen können von dem Wachstumsmedium nach irgendeinem von üblicherweise angewandten Standardverfahren gewonnen (geerntet) werden. Bei einer kontinuierlichen Fließkultur wird das flüssige Wachstumsmediumublicherweise, aus dem Fermentor abgezogen, die Zellen von dem flüssigen Medium abgetrennt und das flüssige Medium kann anschließend ganz oder teilweise wieder in den Fermentor zurückgeführt werden. Die Nährstoffe, die nach der Abtrennung der Zellmasse noch in dem flüssigen Wachstumsmedium vorhanden sind, werden so wieder zurückgeführt und zusammen mit der Flüssigkeit erneut für die Kulturstufe angewandt. Frische Nährmedien können natürlich zu dem zurückgeführten Medium zugesetzt werden oder können wahlweise getrennt in den Fermentor eingeleitet werden.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein verbessertes Verfahren zur kontinuierlichen Züchtung von Mikroorganismen zu entwickeln.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen durch kontinuierliches Züchten von einem oder mehreren Kohlenwasserstoff verbrauchenden Mikroorganismen gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren keine Kohlenwasserstoffe verbrauchenden Mikroorganismen, die im Stande sind, organische Substanzen zu metabolisieren, die durch die Kohlenwasserstoff verbrauchenden Mikroorganismen gebildet worden sind, unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Wachstumsmedium, umfassend assimilierbare Stickstoffquellen und essentielle

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Mineralsalze^in Gegenwart eines Kohlenwasserstoffes Abziehen des die Mikroorganismen enthaltenden flüssigen Wachstumsmedium5von der wachsenden Kultur, Abtrennung der Mikroorganismen von dem abgezogenen flüssigen Wachstumsmedium und Zurückführung zumindest eines Teiles des abgezogenen flüssigen Wachstumsmediunß zu der wachsenden Kultur, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das abgezogene flüssige Wachstumsmediura auf eine Temperatur von minus 5 bis plus 20. G abgekühlt wird vor oder während der Abtrennung der Mikroorganismen.

Der Ausdruck"Kohlenwasserstoff" wie er hier gebraucht wird, bedeutet nicht nur Kohlenwasserstoffe sondern auch deren oxydierte Derivate.

Der Ausdruck "Mikroorganismus", wie er hier gebraucht wird, ist in seinem weitesten Sinne zu verstehen und umfaßt nicht nur Bakterien sondern auch Hefen, ]?adenpilze,Aktinomyzeten und Protozon.

Der Hauptvorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Ansammlung von das Wachstum hemmenden Substanzen während der Abtrennung vermieden wird. Es scheint, daß, wenn das abgezogene flüssige Wachstumsmedium nicht gekühlt wird, Substanzen in diesem Medium gebildet werden können, die,wenn sie zu der/wachsenden Kultur zurückgeführt werden, das Wachstum der Mikroorganismen in der Kultur hemmen und gegebenenfalls die gesamte Kultur auswaschen bzw. zerstören (wash out). Ein zusätzlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß das Kühlen des abgezogenen Wachstumsmediums die Verun*- reinigung der Abtrenn- und Rückführleitungen durch unerwünschte anaerobe Organismen verhindert.

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Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet für Verfahren, die die Züchtung von Kohlenwasserstoff verbrauchenden Bakterien, gegebenenfalls in Gegenwart von keinen Kohlenwasserstoff verbrauchenden Bakterien/ umfaßt, z.B. Verfahren, die zur Bildung von mikrobiologischem Protein aus Methanol, Methan oder natürlichem Gas führen. Solche Verfahren sind z.B. in der BE-PS 810 941 und der NL-OS 7416644 beschrieben. Bei diesen Verfahren können die Nährstoffe in Form konzentrierter wäßriger Ströme zugeführt werden, die eine Rückführung von bis zu 90fo des Wassers ermöglichen. Die Kohlenstoffquelle kann als reine Flüssigkeit, konzentrierte wäßrige Lösung oder Gas zugeführt werden.

Das abgezogenen flüssige Wachstumsmedium wird vorzugsweise auf eine Temperatur im Bereich von -5 bis 15 G und besonders von -5 bis 1O⁰C gekühlt.

Das flüssige Wachstumsmedium umfaßt eine stickstoffhaltige Verbindung, die Ammoniak, Harnstoff, ein Ammoniumsalz, z.B. Ammoniumsulfat oder Ammoniumchlorid, oder ein Nitrat, z.B. ein Alkalinitrat, sein kann. Stickstoff ist vorzugsweise in einer Konzentration von 3 bis 60 g/l vorhanden.

Andere Elemente, die in dem Medium vorhanden sein können sind Phosphor, Schwefel, Magnesium und Eisen. Phosphor kann in Form von einem oder mehreren Phosphaten vorliegen, z.B. K₂HPO₄, KH₂PO₄, Na₂HPO₄ oder (NH₄)^HPO₄ -oder H₃PO₄ und ist vorzugsweise in einer Konzentration von 3 bis 20 g/l vorhanden. Als Schwefelquelle kommt Schwefelsäure oder ein Sulfat z.B. (NH₄)₂S0₄ in Präge und Schwefel ist in einer Konzentration von 0,5 bis 10 g/l vorhanden. Die beiden Metalle werden günstigerweise in Form des einen oder anderen Salzes zugesetzt, z.B. MgSO₄,7H₂O in einer Konzentration von 0,2 bis 20 g/l und FeCl.*.6H₂O in einer Konzentration von 0,01 bis 3 g/l.

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Das Medium kann auch Spuren anderer Elemente in Form geeigneter Salze enthalten, z.B. Calcium, Mangan, Zink, Kobalt, Molybdän und Bor.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einer kontinuierlichen Fließkultur durchgeführt, bei der die Mikroorganismen in irgendeinem geeigneten Fermentationsgefäß gezüchtet werden können, z.B. einem mit Rührvorrichtungen und Ablenkblechen versehenen Fermentor oder einem Sprühturmfermentor, der entweder mit einer inneren Kühlvorrichtung oder einer äußeren Rücklaufkühlschleife versehen ist und mit entsprechenden Rückführungsleitungen. Wenn Methan oder Naturgas als Kohlenstoffquelle angewandt wird, wird ein Gasgemisch enthaltend Methan und Sauerstoff und gegebenenfalls Kohlendioxid oder andere Gase, mit dem Medium in Berührung gebracht, vorzugsweise durch kontinuierliches Einleiten durch eine Verteilungsdüse am Boden des Gefäßes. Die Sauerstoffquelle für die Kultur kann Luft, Sauerstoff oder mit Sauerstoff angereicherte luft sein. Abgase werden am Kopf des. Gefäßes abgezogen. Die Abgase können entweder durch eine äußere Schleife oder innen mit Hilfe eines Gaseinleitungspropellers zurückgeführt werden. Die Gasströme und Rückführungsströme sollten so angeordnet sein, daß ein maximales Wachstum des Organismus und eine maximale Ausnutzung des Methans erreicht werden.

Die Temperatur der Kultur wird im allgemeinen auf 30 bis 6O⁰C und vorzugsweise auf 40 bis 50 C gehalten. Der pH-Wert der Kultur wird auf einen Wert von 6 bis 8, vorzugsweise 6,4 bis 7>4 gehalten durch entsprechende Zugabe von Alkali z.B. NaOH, KOH, NH.OH und/oder Säure, z.B. H₂SO₄ oder H₃PO,.

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Die Mikroorganismus-Zellen können aas dem flüssigen Wachstumsmedium durch irgendeines von üblicherweise angewandten Standardverfahren gewonnen werden, z.B. durch Ausflocken, Sedimentation und/oder Ausfällung und anschließendesZentrifugieren . und/oder Filtrieren. Die Biomasse wird dann getrocknet, z.B. durch Gefriertrocknen, jjlötzliches Trocknen (flash) und/oder Versprühen und kann in dieser Form als Proteinnährstoff oder nährstoffzusatz für Menschen oder Tiere angewandt werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

A. Eine gemischte Kultur von Mikroorganismen (umfassend ein Methanol verbrauchendes Bakterium und vier kein Methanol verbrauchende Bakterien), die als JMS 72 bezeichnet wird und vollständig in der BE-PS 810941 beschrieben ist, wurde in einem kontinuierlichen IFermentor (Vol. 2,6 1) unter sterilen Bedingungen mit Hilfe des folgenden Mediums gezüchtet: ■

Konzentrierter Nährmediumstrom: CH^OH 192,0 g/l

56,0 «

₃₄ 7,4 " MgSO₄.7H₂O 2,4 " EeSO₄.7H₂O 0,3 "

+ Spurenelemente

Der pH-¥erf wurde durch Zugabe eines äquimolaren Gemisches von HaOH und KOH eingestellt. Vor dem Beginn der Rückführung des iiährmediuras wurde dieser konzentrierte Strom mit Wasser vermischt in den Fermentor eingeführt.

609834/0916 ~ ^Ί "

Die Gleichgewichtsbedingungen waren die folgenden:

Temperatur	42⁰C	ml/h
pH-Wert	6,9
Fließgeschwindigkeit		IDlA
von Wasser	480	h-¹
I'ließgeschwindigkeit		g/l
der Fährstoffe	96	luft/Sauerstoff
Verdünnungsgeschwindigkeit	0,22
Z e lld i elite	10,3
zugeführtes Gas

Der aus dem Fermentor austretende Strom ( d.h. flüssiges Wachstumsmedium plus Zellen) wurde in eine sterile Zentrifuge (Sharpies: Typ 1AP),die mit einer Geschwindigkeit von 30 000 TJpM arbeitete, geleitet, aus der er in Form einer klaren wäßrigen Phase abgezogen wurde. Wenn die Gleichgewichtsbedingungen erreicht waren, wurde der Wasserstrom in dem Fermentor ersetzt durch die wäßrige Phase aus der Zentrifuge, die mit de.r gleichen Geschwindigkeit eingeleitet wurde. Das Rückführungsverhältnis R (d.h. Strom des zurückgeführten Wassers zur Strom der Nährstoffe) betrug 480:96 = 5,0. Nach 90 Minuten wurde eine Hemmung des Wachstums bemerkbar durch Ansammlung von Methanol in dem Fermentor und eine Abnahme der Atmungsgeschwindigkeit. Fach 3 Stunden begann die Atmung aufzuhören und die Kultur wurde ausgewaschen.

B. Der Versuch des Beispiels 1A wurde wiederholt mit dem Unterschied, daß der austretende Strom und die Zentrifuge auf O⁰C gekühlt wurden. Der Rückstrom wurde 12 Stunden bei R = 5 gehalten. Zu diesem Zeitpunkt hatte das Zentrifugengefäß seine Aufnahmefähigkeit erreicht und der die Zentrifuge verlassende Strom war nicht mehr klar. Während

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dieser .Zeit trat keine nachweisbare Ansammlung von Methanol oder Änderung der Atmungsgeschwindigkeit auf.

Beispiel 2

Die gemischte Kultur JMS 72 vmrde in einem kontinuierlichen Fermentor (YoI. =2,1 1) unter den folgenden G-leichgewichtsbedingungen gezüchtet:

Temperatur 40,0⁰C
pH-Wert 6,8

Zelldichte 10,6 g/l

Gaszufuhr luft/Sauerstoff

Fließgeschwindigkeiten:

Methanol (625 g/l) 20,3.4 ml/h

Ammoniak-Lösung (6,95% Gew./YoI.) 13,08 "

Konzentrierte Salzlösung 15,14 "

Fließgeschwindigkeiten

der gesamten Nährstoffe 48,56 "

Fließgeachwindigkeit

des Wassers " 450,00 "

Eließgeschwindigkeit

der gesamten Flüssigkeit 498,56 "

Yerdünnungsgeschwindigkeit 0,237 h

die konzentrierte Salzlösung enthielt die folgenden Bestandteile .(in mMol):

H₃PO₄ - 400 ; MgSO₄ - 60 ; K₂SO₄ - 80 ; Na₂SO₄ - 80 ; FeSO₄ - 8 ; CaCl₂ - 6 ; ZnSO₄ - 2 ; CuSO₄ - 0,5 ; KJ - 0,5 ; CoCl₂ - 0,5 ; H₃BO₅ - 0,6 ; Ha₂MoO₄ - 0,5 ;

Der aus dem Fermentor austretende Strom wurde auf O⁰C gekühlt und in eine auf 8 C gekühlte Zentrifuge geleitet, Die aus der Zentrifuge austretende klare wäßrige Phase

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■wurde wieder mit einer Geschwindigkeit von 450 ml/h in den Fermentor geleitet anstelle des Wassers. Man erhielt ein Poickleitungsverhältnis von 450 : 48,56 = 9,27« Diese Bedingungen wurden 30 Stunden aufrechterhalten ohne daß eine nachweisbare Änderung der Atmungsgeschwindigkeit oder Zelldichte "beobachtet wurde.

PATENTANSPRÜCHE

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Claims

Pa te nt anspräche

Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen durch kontinuierliche Züchtung von einem oder mehreren Kohlenwasserstoff verbrauchenden Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Wachstumsmedium, enthaltend assimilierbare Stickstoffquellen und essentielle Mineralsalze in Gegenwart eines Kohlenwasserstoffes, Abziehen des flüssigen Wachstutnsmediums, enthaltend Mikroorganismen von der Kulturflüssigkeit, Abtrennung der Mikroorganismen von dem abgezogenen flüssigen Wachstumsmedium und Zurückführung zumindest eines Teiles des abgezogenen flüssigen Wachstumsmediums zu der wachsenden Kultur, dadurch gekennzeichnet, daß das abgezogene flüssige Wachstumsmediurn vor oder während der Abtrennung der Mikroorganismen auf eine Temperatur von -5 bis 20⁰O abgekühlt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der oder die Kohlenwasserstoff verbrauchenden Mikroorganismen in Gegenwart von einem oder mehreren keinen Kohlenwasserstoff verbrauchenden Mikroorganismen gezüchtet werden, die im Stande sind organisch Substanzen zu metabolisieren, die durch die Kohlenwasserstoff verbrauchenden Mikroorganismen gebildet worden sind.

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3o Verfahren nach Insprach 1 oder 2, dadurch g e k e η η ζ ei ohne t, daß die Züchtung der Mikroorganismen hei einer Temperatur von 30 bis 6O⁰C durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 Ms 3j dadurch gekennzeichnet, daß das abgezogene flüssige Wachstumsraedium auf eine Temperatur von -5 bis 10 C gekühlt wird.

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