DE2528381A1

DE2528381A1 - Testreagenz zum nachweis von fibrinmonomeren und fibrinabbauprodukten in blutplasma, verfahren zur herstellung des reagenzes und verfahren zum nachweis von fibrinmonomeren und fibrinabbauprodukten in blutplasma

Info

Publication number: DE2528381A1
Application number: DE19752528381
Authority: DE
Inventors: Arthur Lawrence Babson; James Rhett Butler; James Edward Turner
Original assignee: Warner Lambert Co LLC
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 1974-08-06
Filing date: 1975-06-25
Publication date: 1976-02-26
Also published as: DE2528381B2; NO751910L; NO145356B; GB1462591A; IT1039554B; US3915640A; FR2281568B1; SE7507478L; SE419135B; JPS5433877B2; JPS5119589A; FR2281568A1; NO145356C; CA1035679A; CH622350A5; DK296475A; AU8189775A

Description

PATENTANWÄLTE

HENKEL, KERN, FEILER & HÄNZEL

BAYERISCHE HYPOTHEKEN- UND TELEX: 05 29 802 HNKL D ΡΓ»ΙΪΔΒΓ> SfHUin STRASSF "? WECHSELBANKMÜNCHENNr.318-85111 TFIPFON- ro 89) 66 3197 66 30 91 92 büUAKÜ-ÄtHMlU S lKAiitl . DRESDNER BANK MÜNCHEN 3 914

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25. JUNi 1975

Warner-Lambert Company Morris Plains, New Jersey, V.St.A.

Testreagenz zum Nachweis von Fibrinmonomeren und Fibrinabbauprodukten in Blutplasma, Verfahren zur Herstellung des Reagenases und Verfahren zum Nachweis von Fibrinmonomeren und Fibrinabbauprodukten in Blutplasma

Krankheitszustände, bei denen eine intravaskuläre Pfropfenbildung eine Holle spielen, werden in immer weiterem Maße diagnostiziert. Bei derartigen Krankheitszuständen kommt es in der Kegel zu einem gewissen Zusammenbruch des Gerinnungsmechanismus, was zu abnormalen Werten an Fibrinmonomeren oder Fibrinabbauprodukten im Blutserum führt· Bei gesunden Individuen wird das Fibrinogen durch das im Blut enthaltene Thrombin in Fibrin überführt. Durch einen Thrombinüberschuß gekennzeichnete Krankheitszustände bedingen eine stärkere Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin und eine: dadurch bedingte Gerinnung bzw. Pfropfenbildung« Der gebildete Pfropf wird langsam durch das vorhandene Plasmin aufgelöst, was dazu führt, daß im gesamten Körper höhere Werte für Fibrinmonomere und/oder Fibrinabbauprodukte nachgewiesen werden können. Dieser Zustand wird in der Regel als disseminierte intravaskuläre Koagulation bezeichnet.

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Eine direkte Bestimmung des Vorliegens hoher Thrombinwerte, die im Blut Reaktionen in Gang setzen, welche dann zu der disseminierten intravaskulären Koagulation führen, war bisher noch nicht möglich, da das betreffende Enzym rasch inaktiviert wird. Folglich läßt sich eine indirekte Diagnose von durch intravaskuläre Koagulation gekennzeichneten Krankheitszuständen nur über eine Bestimmung der abnormalen Werte für die Fibrinmonomeren und Fibrinabbauprodukte, die das Ergebnis der Anwesenheit eines Thrombinüberschusses sind, stellen.

Zur Bestimmung der intravaskulären Koagulation bediente man sich beispieleweise eines Staphylokokken-Klumpungstests (vgl. Dennis E. Leavelle und Mitarbeiter in "Am. J. Clin· Path." Band 55, Seiten 4-52 bis 457 - 1971 -). Dieser Test liefert jedoch sowohl beim Vorliegen von Fibrinabbauprodukten als auch beim Vorliegen von Fibrinogenabbauprodukten positive Ergebnisse. Fibrinogenabbauprodukte bilden sich, wenn im Blut ein Oberschuß an Plasmin vorhanden ist. Ihre Anwesenheit ist kein Anzeichen für eine intravaskuläre Gerinnung bzw. Pfropfenbildung· Lediglich die Anwesenheit abnormaler Werte für Fibrinmonomere und/oder Fibrinabbauprodukte spiegelt spezifisch die Anwesenheit von überschüssigem Thrombin und folglich eine intravaskuläre Pfropfenbildung bzw· Gerinnung wieder. Somit läßt also ein positiver Staphylokokken-Klumpungstest keine unzweideutige Diagnose für eine intravaskuläre Koagulation zu.

Der nachweis löslicher Fibrinmonomerer und Fibrinabbauprodukte, deren Anwesenheit eine Bestätigung der Diagnose einer intravaskulären Koagulation darstellt, läßt sich mit Hilfe des Protamineulfattests erreichen. Blutplasma, welches lösliche Fibrinmonomere oder lösliche Fibrinabbau-

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produkte enthält, zeigt nach Zugabe von Protaminsulfat das Vorhandensein dieser Substanzen durch Eildung von "Fibringelen" oder "Fibrinsträngen". Dieser Test wurde bereits in der verschiedensten Weise abgewandelt (vgl. V. Gurewich und Mitarbeiter "Annuals of Internal Medicine", Band 75, Seiten 895 bis 902 - 1971 -; S. Newiarowski und Mitarbeiter "Journal of Laboratory Clinical Medicine", Band 77, Seite 666 - 1971 -; M. J. Sanfelippo und Mitarbeiter "American Journal of Clinical Pathology", Band 56, Seite 166 - 1971 -).

Obwohl die hiernach möglichen Bestimmungen die Wahrscheinlichkeit einer genauen und zuverlässigen Diagnose der verschiedenen Krankheitszustände mit intravaskularer Gerinnung bzw, Pfropfenbildung stark erhöht haben, gibt es immer noch Schwierigkeiten bei der Bestimmung niedriger Konzentrationen an Fibrinmonomeren und Fibrinabbauprodukten und bei der eindeutigen Festlegung von Endpunkten für positive Reaktionen. Ein Störfaktor besteht darin, daß das Plasma normalerweise Fibrinogen enthält. Da das Protaminsulfat sowohl Fibrinogen als auch Fibrinogenabbauprodukte als weißes, federartiges, flockiges Produkt fällt, kann dieses Produkt normalerweise von den aus Fibrinmonomeren oder Fibrinabbauprodukten in Gegenwart von Protaminsulfat gebildeten Fibringelen oder Fibrinsträngen unterschieden werden. Bei niedrigen Konzentrationen bereitet jedoch eine klare Erkennung und Identifizierung der schraubenartigen Fibrinstränge, insbesondere in Gegenwart des federartigen und flockigen FibrinogenniederSchlags extreme Schwierigkeiten.

So ist - wenn man auf die derzeit verfügbaren Testmethoden angewiesen ist - eine Frühdiagnose einer intravaskulären Koagulation mit gewissen Unsicherheiten behaftet.

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Es gibt zwar eine Therapie für Krankheitszustände mit intra« vaskulärer Koagulation, eine wirksame Anwendung dieser Therapie hängt jedoch in starkem Maße vom Beginn der Therapie vor einer GewebeSchädigung oder -raißfunktion ab. Folglich ist also eine Frühdiagnose bereits eines geringen Auftretens einer intravaskulären Koagulation kritisch.

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Reagenz und ein verbessertes Verfahren zum Nachweis von Fibrinmonomeren und Fibrinabbauprodukten. Das verbesserte Reagenz gemäß der Erfindung enthält in einer physiologischen Kochsalzlösung, in der etwa 0,0004-2 bis etwa 0,00165 Gew.-# an feinteiligen farbigen Teilchen suspendiert sind, 0,0125 bis 0,2 Gew.-# Protaminsulfat· Der pH-Wert der Lösung ist auf 6,5 eingestellt. Bas verbesserte Reagenz wird durch Auflösen des Protaminsulfats in der physiologischen Kochsalzlösung und Einstellen des pH-Werts, Suspendieren der farbigen Teilchen, vorzugsweise Lampenruß in Form von Tusche, in der physiologischen Lösung und langsames Zugeben der Suspension der farbigen Teilchen zu der Protaminsulfat lösung und schließlich Einstellen des pH-Werts auf 6,5 zubereitet. Gegebenenfalls kann das verbesserte Testreagenz lyophilisiert bzw, gefriergetrocknet werden. Unter Verwendung dieses verbesserten Reagenzes ist der Nachweis bereits einer geringen intravaskulären Koagulation im Blutplasma möglich.

Es hat sich erfindungsgemäß gezeigt, daß die im Hinblick auf einen positiven Nachweis niedriger Gehalte an Fibrinmonomeren und Fibrinabbauprodukten im Blut bisher auftretenden Schwierigkeiten durch Verwendung des verbesserten Protaminsulfatreagenzes gemäß der Erfindung beseitigt werden können. Insbesondere hat es sich gezeigt, daß die Suspension feinteiliger farbiger Teilchen in den zum Nachweis

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von Fibrinmonomeren im Blutplasma verwendeten Protaminsulfatfällösungen einen schärferen positiven Endpunkt beim Test liefert. Die zugesetzten farbigen Teilchen sind in der Protaminsulfatlosung kolloidal suspendiert und werden beim Ausfallen der Fibrinstränge und Fibringele in diese eingeschlossen, wobei sie diesen ihre Eigenfarbe vermitteln· Auf diese V/eise lassen sich die Fibrinstränge und Fibringele selbst bei relativ niedrigen Konzentrationen klarer und sauberer unterscheiden. Bei Verwendung des verbesserten Testreagenees gemäß der Erfindung hat es sich gezeigt, daß die Fibrinmonomeren im Blutplasma bereits bei Konzentrationen von 0,89 mg pro iOO ml Plasma nachgewiesen werden können.

Erfindungsgemäß können in dem verbesserten Protaminsulfatreagens als farbige Teilchen solche mit einem Teilchendurchmesser von etwa 90 bis 400 Millimikron, die in der Protaminsulfatlosung suspendierbar sind, verwendet werden.

So eignen sich beispielsweise farbige Pigmente, wie Red Oxide, Yellow Oxide, Carbon Black, Benzidine Orange, Phthalo Green, Phthalo Blue, Ultramarine Blue, Brown Oxide und dergleichen, die im Handel in Form wäßriger Dispersionen erhältlich sind. Hierbei werden die kräftiger gefärbten Teilchen bevorzugt, da diese einen besser sichtbaren Farbkontrast hervorrufen. Folglich werden alsodie verschiedenen Rußsorten, insbesondere Lampenruß, bevorzugt. Eine besonders gut geeignete Form von Lampen— ruß ist Tusche. Der in Tusche enthaltene Lampenruß ist in einem wäßrigen Träger, dem verschiedene gummiartige Suspendiermittel zugesetzt sind, kolloidal suspendiert. Geeignete Tuschen sind allgemein im Handel erhältlich.

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Bei der Herstellung des erfindungsgemäßen verbesserten Reagenses zum Nachweis einer intravaskulären Koagulation sind sowohl die Konsentration als auch die Große der in der ProtaminsulfatlÖsung enthaltenen fein verteilten farbigen Teilchen kritisch. Wenn die Konzentration zu stark ist, bleiben einige farbige Teilchen nach beendeter Fibringel- oder -Strangbildung in der Suspension zurück, so daS zwischen der Suspension und dem Gel oder Strang nicht der für eine verbesserte Sichtbarmachung des Endprodukts erforderliche Kontrast gegeben ist. Wenn andererseits eine unzureichende Menge an feinteiligen farbigen Teilchen vorhanden ist, sind die Fibrinstränge und/oder Fibringele nur schwach gefärbtj auch in diesem Fall wird die Sichtbarmachung des Bndprodukts nicht verbessert·

Zum verbesserten Nachweis von Fibrinmonomeren und Fibrinabbauprodukten im Blutplasma bedient man sich folglich erfindungsgemäß einer physiologischen Kochsalzlösung, die allgemein 0,0125 bis 0,2, zweckmäßigerweise 0,025 bis 0,1, vorzugsweise 0,1 Gew.-SIi Protaminsulfat (bezogen auf das Gesamtgewicht der physiologischen Kochsalzlösung), und allgemein 0,00042 bis 0,00165, zweckmäßigerweise 0,00065 bis 0,001097» vorzugsweise 0,00083 Gew.-^ an in der physiologischen Kochsalzlösung suspendierten, fein verteilten, farbigen Teilchen (bezogen auf das Gesamtgewicht der physiologischen Kochsalzlösung) enthält. Der pH-Wert der das Protaminsulfat und die fein verteilten farbigen Teilchen enthaltenden physiologischen Kochsalzlösung sollte auf etwa 6,50 + 0,05 eingestellt werden. Gegebenenfalls kann das verbesserte Testreagens gemäß der Erfindung lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet und zur Verwendung bei der Bestimmung einer intravaskulären Koagulation ia Blutplasma mit Wasser wieder aufbereitet werden.

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Bei der Herstellung des verbesserten Testragenzes zum Nachweis einer intravaskulären Koagulation ist es erforderlich, zunächst eine Lösung des Protaminsulfats in der physiologischen Kochsalzlösung mit 0,7 bis 0,95 % Natriumchlorid, vorzugsweise 0,85 % Natriumchlorid, zuzubereiten. Der pH-Wert dieser Lösung sollte auf etwa 6,50 + 0,05 eingestellt werden. Die fein verteilten farbigen Teilchen werden dann in einer entsprechenden Menge physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Anschließend wird ein bestimmtes Volumen der Suspension der farbigen Teilchen in der physiologischen Kochsalzlösung zu einem gleichen Volumen der das Protaminsulfat enthaltenden physiologischen Kochsalzlösung zugegeben, worauf der pH-Wert des fertigen Reagenzes auf 6,50 + 0,05 eingestellt wird. Zur Einstellung des pH-Werts wird in der Regel eine 0,1 η Natriumhydroxidlösung verwendet. Auf diese Weise erhält man ein verbessertes Reagenz, das zum leichteren Versand und im Hinblick auf eine bessere Stabilität bei der Lagerung lyophilisiert werden kann. Es hat sich gezeigt, daß man beim Wiederaufbereiten des lyophilisierten bzw. gefriergetrockneten Reagenzes gemäß der Erfindung mit Wasser eine Suspension der fein verteilten farbigen Teilchen in der das Protaminsulfat enthaltenden physiologischen Kochsalzlösung erhält, die dann ohne Schwierigkeiten zum Nachweis einer intravaskulären Koagulation verwendet werden kann.

Bei einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung zum Nachweis der Anwesenheit von Fibrinmonoraeren und Fibrinabbauprodukten im Blutplasma bedient man sich einer Verdünnungsreihe des verbesserten Reagenzes gemäß der Erfindung. Die Verdünnungsreihe wird wie folgt hergestellt:

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«· 8 —

A. Zunächst wird eine physiologische Kochsalzlösung mit 0,4- Gew.-# Protaminsulfat zubereitet und der pH-Wert auf 6,50 + 0,05 eingestellt.

B. In einem anderen Anteil der physiologischen Kochsalzlösung wird O,OOi65 Gew.-# feinteiliger farbiger Teilchen suspendiert.

C. Ein bestimmtes Volumen der kolloidalen Suspension der farbigen Teilchen (B) wird nach und nach zu einem gleichen Volumen der das Protaminsulfat enthaltenden physiologischen Kochsalzlösung (A) zugegeben, bis ein kombiniertes Reagenz mit 0,2 Gew,-# Protaminsulfat und 0,00083 Gew.-# an fein verteilten farbigen Teilchen erhalten wird. Der pH-Wert dieses kombinierten Reagenzes wird erneut auf 6,50 hh 0,05 eingestellt.

D. Ein restlicher Teil der in der physiologischen Kochsalzlösung suspendierten 0,00165 Gew.-# farbiger Teilchen wird mit weiterer physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, wobei eine physiologische Kochsalzlösung mit 0,00083 Gew.-# an in der physiologischen Kochsalzlösung suspendierten fein verteilten farbigen Teilchen erhalten wird.

E. Durch Verdünnen von C mit D werden weitere vier Verdünnung sstufen des verbesserten Testreagenzes gemäß der Erfindung erhalten.

Auf diese Weise wird eine Verdünnungsreihe des verbesserten Testreagenzes gemäß der Erfindung mit 0,2 Gew.-#, 0,1 Gew.-#, 0,05 Gew.-#, 0,025 Gew.-# und 0,0125 Gew.-^ Protaminsulfat erhalten. Jede Verdünnungsstufe enthält ferner 0,00083 Gew.-# an den fein verteilten farbigen Teilchen.

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Der tatsächliche Nachweis einer intravaskulären Koagulation mit dem verbesserten Testreagenz gemäß der Erfindung erfolgt in der Weise, daß zunächst eine abgemessene Menge des zu testenden Blutplasmas in ein das verbesserte Testreagenz gemäß der Erfindung enthaltendes Teströhrchen gefüllt wird. Dann wird der Inhalt des Teströhrchens durch schwaches Schütteln desselben gemischt, worauf das Ganze bei Raumtemperatur JO min lang stehen gelassen wird. Während dieser Zeit bilden sich, wenn eine intravaskuläre Koagulation stattgefunden hat und in dem Blutplasma Fibrinmonomere und/oder !Fibrinabbauprodukte enthalten sind, farbige Fibrinstränge oder farbige Fibringele. Durch schwaches Schütteln des Teströhrchens und visuelle Prüfung auf das Vorhandensein dieser farbigen Fibrinstränge und/oder farbigen Fibringele läßt sich ein positiver Nachweis einer intravaskulären Koagulation führen. Wenn weder farbige Fibrinstränge noch farbige Fibringele zu sehen sind, ist das Testergebnis negativ. Es wurde ferner gefunden, daß durch die Anwesenheit von Fibrinogen und/oder Fibrinogenabbauprodukten in dem getesteten Blutplasma die Spezifität des Endpunkts des verbesserten Testverfahrens gemäß der Erfindung nicht beeinträchtigt bzw. gestört wird. Eine Erkennung und Identifizierung der schraubenartigen Fibrinstränge (Früherkennung einer intravaskulären Koagulation) lassen sich auch in Gegenwart der federartigen und flockigen Niederschläge von gefälltem Fibrinogen und/oder Fibrinogenabbauprodukten durchführen.

Wenn das geschilderte Verdünnungsreihentestverfahren angewandt wird, wird 0,2 ml zu prüfendea Blutplasma zu 0,2 ml jeder der Verdünnungsstufen C und E zugesetzt, worauf das Blutplasma und die einzelnen Verdünnungsstufen in der geschilderten Weise gemischt und visuell auf

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die Anwesenheit farbiger Fibrinstränge oder farbiger Fibringele hin geprüft werden· Das geschilderte Verdünnungsreihentestverfahren läßt sich halbquantitativ durchführen, wenn bekannte Konzentrationen an Fibrinmonomeren enthaltende Standardplasmatestlösungen mitgetestet werden·

Für genaue Positiv/Negativ-Testergebnisse (unabhängig von den Mengen) hat es sich als möglich erwiesen, bei den geschilderten Verdünnungsreihentestverfahren lediglich zweite Verdünnungsstufen zu verwenden. So wird ein Testreagenz mit 0,1 Gew.-# Protaminsulfat und 0,00083 Gew.-# fein verteilter farbiger Teilchen in einer physiologischen Kochsalzlösung zubereitet und dessen pH-Wert auf 6,50 + 0,05 eingestellt. Letzteres Testreagenz kann zum leichteren Versand und im Hinblick auf eine erhöhte Lagerungsstabilität lyophilisiert oder gefriergetrocknet werden. Zur Durchführung des Tests wird das lyophilisierte Reagenz wieder aufbereitet und in einer Menge von 0,2 ml (wieder aufbereitetes Testreagenz) mit 0,2 ml des au testenden Blutplasmas versetzt. Die zu testende Probe und das Reagenz werden durch schwacheβ Schütteln gemischt, worauf die Mischung 50 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann schwach geschüttelt wird· Die Anwesenheit von farbigen Fibrinsträngen und/oder farbigen Fibringelen ist, wenn sie visuell nachweisbar ist, ein positives Anzeichen . für eine intravaskuläre Koagulation.

Unter Anwendung des zuletzt geschilderten' Testverfahrens oder des vorher beschriebenen Verdünnungsreihente et verfahr ens läßt sich pro 100 ml Plasma noch 0,89 mg Fibrineonomeres ia Blutplasma nachweisen. Ein weiterer Vorteil des verbesserten Testreagenzes gemäß der Erfin-

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dung besteht darin, daß zur Gewährleistung genauer Testergebnisse nur ein äußerst kurzes Training erforderlich ist. Eine gleichzeitige Probenanalyse geht relativ rasch vonstatten, da sämtliche erforderlichen Reagenzien vorgemischt sind. So wird unter Verwendung des verbesserten Testreagenzes gemäß der Erfindung und bei Anwendung des verbesserten Testverfahrens gemäß der Erfindung eine Früherkennung einer intravaskulären Koagulation ohne weiteres möglich.

Me folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel

Zubereitung einer Verdünnungsreihe eines farbige Teilchen enthaltenden Protaminsulfatreagenzes

A. Durch Auflösen von 1,20 g Protaminsulfat in 300 ml einer 0,85 #igen physiologischen Kochsalzlösung wurde eine 0,4- #ige ProtaminsulfatlÖsung zubereitet. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wurde mit 0,1 η Natriumhydroxid auf 6,50 + 0,05 eingestellt.

B. 0,075 ml handelsübliche Tusche wurde in 300 ml einer 0,85 #igen physiologischen Kochsalzlösung suspendiert, wobei eine Lösung mit 0,00165 Gew.-Ji Lampenrußteilchen erhalten wurde.

C. Ein bestimmtes Volumen der Suspension B wurde schrittweise in ein gleiches Volumen der Lösung A eingetragen, wobei ein kombiniertes Reagenz mit 0,2 Gew.-# Protaminsulfat und 0,00083 Gew.-J^ Lampenrußteilchen erhalten wurde. Der pH-Wert des Reagenzes wurde mit 0,1 η Natriumhydroxid auf 6,50 + 0,05 eingestellt.

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D. Der restliche Teil der Suspension B wurde mit einem gleichen Volumen einer 0,85 #igen physiologischen Kochsalzlösung verdünnt, wobei eine Suspension mit 0,00083 Gew«-# Lampenrußteilchen erhalten wurde· Diese Suspension farbiger Teilchen wurde zur Herstellung einer Verdünnungsreihe des Reagenzes 0 verwendet. Es wurden insgesamt fünf Verdünnungsstufen des kombinierten Reagenzes mit 0,2 Gew.-^, 0,1 Gew.-#, 0,05 Gew.-#, 0,025 Gew.-# und 0,125 Gew.-# Protaminsulfat und ,jeweils 0,00083 Gew.-^ Lampenrußteilchen erhalten·

Beispiel 2 Nachweis einer intravaskulären Koagulation

0,2 ml eines zu testenden Blutplasmas wurde in 0,2 ml jeder der gemäß Stufe D von Beispiel 1 hergestellten Verdünnungsstufen in getrennten Teströhrchen eingetragen. Das zu testende Blutplasma und die einzelnen Verdünnungsstufen wurden in den verschiedenen Teströhrchen durch schwaches Schütteln miteinander gemischt und dann 30 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Hierauf wurden die einzelnen Teströhrchen geschüttelt und visuell auf die Anwesenheit farbiger Fibrinstränge und farbiger Fibringele als positiver Nachweis für eine disseminierte intravaskuläre Koagulation hin betrachtet.

Beispiel 3

Zubereitung eines farbige Teilchen enthaltenden Protaminsulfatreagenzes

Eine 0,2 $ige Protaminsulfatlösung wurde durch Auflösen von 0,60 g Protaminsulfat in 300 ml einer 0,85 #igen

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physiologischen Kochsalzlösung und Einstellen des pH-Werts auf etwa 6,50 + 0,05 mittels 0,1 η Natriumhydroxid zubereitet. Dann wurde 0,075 ml einer handelsüblichen Tusche in 300 ml einer 0,85 #igen physiologischen Kochsalzlösung eingetragen, wobei eine 0,00i65 Gew.-# Larapenrußteilchen enthaltende Suspension erhalten wurde. Die Suspension der Tusche in der physiologischen Kochsalzlösung wurde schließlich nach und nach in die Protaminsulfat enthaltende physiologische Kochsalzlösung eingegossen, worauf erneut der pH-Wert des kombinierten Reagenzes auf 6,50 + 0,05 eingestellt wurde. Schließlich wurde das Ganze in Form 2,0 ml betragender aliquoter Teile gefriergetrocknet,

Beispiel 4- Nachweis einer intravaskulären Koagulation

Ein lyophilisierter bzw. gefriergetrockneter aliquoter Teil des Beispiels 3 wurde mit 2 ml Wasser wieder aufbereitet und zum vollständigen Auflösen schwach durch— gequirlt. 0,2 ml an zu testendem Blutplasma wurde in 0,2 ml des wieder aufbereiteten Reagenzes von Beispiel 3 eingetragen, worauf das Ganze durch schwaches Schütteln des Teströhrchens gemischt wurde. Dann wurde das Teströhrchen bei Raumtemperatur 30 min lang stehen gelassen, erneut schwach geschüttelt und schließlich auf die Anwesenheit farbiger Fibrinstränge und farbiger Fibringele als positiver Nachweis für eine disseminierte intravaskuläre Koagulation betrachtet.

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Claims

Patentansprüche

λ 1Λ Verbessertes Testreagenz zum Nachweis von Fibrinmonomeren ^v—^ und Fibrinabbauprodukten in Blutplasma, dadurch gekennzeichnet , daß es aus einer physiologischen Kochsalzlösung mit, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der physiologischen Kochsalzlösung, etwa 0,0125 bis etwa 0,2 Gew.-# Protaminsulfat und etwa 0,00042 bis etwa 0,00165 Gew.-^ an in der physiologischen Kochsalzlösung kolloidal suspendierten, fein verteilten, farbigen Teilchen besteht und auf einen pH-Wert von etwa 6,5 eingestellt ist.

2. Lyophilisiertes bzw. gefriergetrocknetes Testreagenz nach Anspruch 1.

5. Testreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die darin enthaltenen farbigen Teilchen einen Durchmesser von etwa 90 bis etwa 400 Millimikron aufweisen.

4-, lyophilisiertes bzw. gefriergetrocknetes Testreagenz nach Anspruch 3.

5. Testreagenz nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet , daß es etwa 0,025 bis etwa 0,1 Gew.-# Protaminsulfat und etwa 0,00065 bis etwa 0,001097 Gew.-^ Ruß enthält.

6* Lyophilisiertes bzw. gefriergetrocknetes Testreagenz nach Anspruch 5·

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7. Testreagenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß es etwa 0,1 Gew.-^ Protaminsulfat und etwa 0,00083 Gew.-^ Lampenrußteilchen enthält.

8. Lyophilisiertes bzw. gefriergetrocknetes Testreagenz nach Anspruch 7·

9. Verfahren zur Zubereitung eines verbesserten Testreagenzes zum Nachweis von Fibrinmonomeren und Fibrinabbauprodukten in Blutplasma, dadurch gekennzeichnet , daß man

A. eine physiologische Kochsalzlösung mit, bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung, etwa 0,025 bis etwa 0,4· Gew.-# Protaminsulfat zubereitet und den pH-Wert der Lösung auf etwa 6,50 + 0,05 einstellt}

B. eine physiologische Kochsalzlösung mit, bezogen auf das Gesamtgewicht der physiologischen Kochsalzlösung, etwa 0,00083 bis etwa 0,00329 Gew.-^ an in der physiologischen Kochsalzlösung kolloidal suspendierten, feinteiligen farbigen Teilchen zubereitet und

C. langsam ein bestimmtes Volumen der Suspension B in ein gleiches Volumen der Lösung A einträgt und den pH-Wert des kombinierten Reagenzes auf etwa 6,50 + 0,05 einstellt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß das kombinierte Reagenz in einer weiteren Stufe lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet wird.

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11. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet , daß in Stufe A etwa 0,05 bis etwa 0,2 Gew,-# Protaminsulfat und in Stufe B etwa 0,0013 bis etwa 0,002184 Gew.-# Ruß vorhanden sind·

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß das kombinierte Reagenz lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß in Stufe A etwa 0,2 Gew. Protaminsulfat und in Stufe B etwa 0,00165 Gew.-% Lampen ruß in Form einer Tuschesuspension vorhanden sind,

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß das kombinierte Reagenz in einer weiteren Stufe lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet wird.

15. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Fibrinmonomeren und Fibrinabbauprodukten in Blutplasma, dadurch gekennzeichnet, daß man

A. eine etwa 0,4 Gew«-# Protaminsulfat enthaltende physiologische Kochsalzlösung zubereitet und deren pH-Wert auf etwa 6,50 + 0,05 einstellt;

B. eine physiologische Kochsalzlösung mit etwa 0,0Oi65 Gew.-# an in der physiologischen Kochsalzlösung kolloidal suspendierten, feinteiligen farbigen Teilchen zubereitet;

C. schrittweise ein bestimmtes Volumen der Suspension B in ein gleiches Volumen der Lösung A einträgt, um ein kombiniertes Testreagenz mit 0,2 Gew.-# Protaminsulfat und 0,00083 Gew.-# an feinteiligen farbigen Teilchen zu erhalten, und daß man den

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pH-Wert des kombinierten Testreagenzes auf etwa 6,50 + 0,05 einstellt}

B. einen restlichen Teil der Suspension B mit weiterer physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, um eine physiologische Kochsalzlösung mit 0,00083 Gew.-% an in der physiologischen Kochsalzlösung kolloidal suspendierten, feinteiligen farbigen Teilchen herzustellen;

E. das kombinierte Testreagenz C mit D zur Herstellung von insgesamt fünf Yerdünnungsstufen mit 0,2 Gew.-^, 0,1 Gew.-#, 0,05 Gew.-#, 0,025 Gew.-# und 0,0125 Gew.-# Protaminsulfat und 0,00083 Gew.-# von feinteiligen farbigen Teilchen in jeder Verdünnungsstufe verdünnt;

F. 0,2 ml an zu testendem Blutplasma in 0,2 ml jeder der Verdünnungsstufen E einträgtf

G. das Blutplasma und die einzelnen Verdünnungsstufen F durch schwaches Schütteln der einzelnen Teströhrchen mischt und dann den Röhrcheninhalt etwa 30 min lang bei Raumtemperatur stehen laßt und

E. die einzelnen TestrÖhrchen G schwach schüttelt und visuell auf die Anwesenheit farbiger Fibrinstränge und farbiger Fibringele als positives Anzeichen für das Vorhandensein von Fibrinmonomeren und Fibrinabbauprodukten betrachtet.

16. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Fibrinmonomeren und Fibrinabbauprodukten in Blutplasma, dadurch gekennzeichnet, daß man A. das lyophilisierte bzw. gefriergetrocknete Testreagenz von Anspruch 8 mit Wasser wieder aufbereitet;

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Β· 0,2 ml an zu testendem Blutplasma in 0,2 ml des in einem Testrb'hrchen befindlichen wieder aufbereiteten Testreagenzes A einträgt;

C. den Inhalt des Teströhrchens durch schwaches Schütteln desselben mischt und dann das Teströhrchen bei Raumtemperatur etwa 30 min lang stehen läßt und

D. das Teströhrchen schwach schüttelt und visuell auf die Anwesenheit farbiger Fibrinstränge und farbiger Fibringele als positives Anzeichen für die Anwesenheit von Fibrinmonomeren und Fibrinabbauprodukten hin untersucht.

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