DE2657926A1 - Verfahren zur bestimmung des antistreptolysingehaltes im blut und diagnostiziermittel zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents

Verfahren zur bestimmung des antistreptolysingehaltes im blut und diagnostiziermittel zur durchfuehrung des verfahrens

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Description

Toscano "SCLAVO" S.p.A.
Via Fiorentina 1 - Siena/Italien
betreffend
Verfahren zur Bestimmung des Antistreptolysingehaltes im Blut und Diagnostiziermittel zur Durchführung des Verfahrens
O-Streptolysin (0-S) ist ein Toxin von proteinartiger Natur, das von bestimmten Streptococci der Α-Gruppe ausgeschieden wird. Dieses Toxin wirkt auf Versuchstiere tödlich, zerstört die Zellkulturen und löst die roten Blutzellen und die weißen Zellen, vieler Tierarten, auf.
Einige Oxidantien hemmen wirksam die lytische Kraft dieses Toxins. Die Änderungen, die die Moleküle erleiden, umfassen dieSuIfhydrilgruppen,-SH, das in Disulfidgruppen -S-S- umgewandelt werdsi .Natürlich werden bei Zugabe von reduzierenden Substanzen, wie Mercaptoäthanol, die -SH-Gruppen wieder gebildet. Die beiden Reaktionen sind in Figur 1 angegeben, in der O-Streptolysin (0-S) angegeben ist durch eine geometrische Figur A mit einer vertikalen
Die Hämolyse der roten Blutzellen, wenn sie bei 370C mit dem Toxin inkubiert werden, findet nur statt, wenn das 0-S in reduzierter Form vorliegt, d.h. -SH-Gruppen enthält,
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da das oxidierte Toxin über die -S-S-Gruppen nicht mit der Cytoplasmamembran der roten Zellen in Wechselwirkung treten kann. Der Membranrezeptor wurde als Cholesterin identifiziert. Die Figuren 2 und 3 zeigen schematisch dieses Phänomen. Dabei bezeichnet die Nr. 3 die Cytoplasmamembran in schräger Kreuzschraffur, während die Nr. 5 in punktierter Schraffur den Membranrezeptor Cholesterin zeigt. Nur solche O-S-Moleküle, die an die Membranrezeptoren gebunden sind (Figur 2), treten untereinander in Wechselwirkung, wie in Figur 3 angegeben ist, und ordnen sich in Form von Röhren oder Ringen. Hämoglobin (Nr. 7), das in Figur 3 in Form von Punkten oder Kreisen angegeben ist, tritt durch diese Ringe oder andere Bereiche aus, in denen die Lipide eine Desorganisation aufgrund des Cholesterinverlustes erfahren haben.
Wenn man 0-S bei +40C zusammen mit roten Blutkörperchen inkubiert, wird ein Angriff von 0-S auf das Cholesterin der roten Blutkörperchen beobachtet, aber es tritt keine Lysis ein, da die Wechselwirkung zwischen den Toxinmolekülen eine Funktion der Temperatur ist. Hämolyse tritt ein, wenn das System auf 37°C gebracht wird. Wenn Anti-O-S-(Antistreptolysin·)-Antikörper bei +40C zu dem System zugegeben werden und die Temperatur anschließend auf 37°C erhöht wird, wird keine Hämolyse beobachtet. Die Erklärung ist folgende: Die funktioneilen Gruppen des 0-S, von denen angenommen wird, daß sie untereinander in Wechselwirkung treten, sind durch die Antikörper blockiert. Dieses Phänomen ist schematisch in Figur 4 gezeigt, wo die Anti-O-S-Antikörper durch die Bereiche 9 angegeben sind.
Wenn man das oxidierte 0-S mit roten Blutkörperchen bei 37°C inkubiert, tritt keine Hämolyse auf. Natürlich kann das oxidierte 0-S nicht an den Membranrezeptoren 5 haften (siehe Figur 2). Wenn Anti-O-S-Antikörper 9 zugesetzt werden, werden diese an das oxidierte 0-S gebunden, und es treten die in Figur 5 gezeigten Bedingungen ein.
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Wenn man jetzt eine reduzierende Substanz zu dem System zugibt, werden die Sulfydrilgruppen -SH zurückgebildet, aber es tritt keine Hämolyse ein, da die funktioneilen Gruppen des Q-S, die miteinander in Wechselwirkung treten könnten, durch die Antikörper 9 blockiert sind.(siehe Figur 4).
Die oben angegebenen Phänomene sind in den folgenden Literaturstellen beschrieben:
1.) Howard, J.F., Wallace, M.R. s Brit. J. Exp. Path. Band 34,
Seite 181,(1953);
2.) Rants, L.Α., Randall, R.: Proc.Sec. Exp. Biol. Med. (N.Y.)
Band 59t Seite 22 (1945);
3.) Alan, J.E., Raymond, M.: Ann» Inst. Pasteur, Band 114, (1968).
Es ist seit langem ein diagnostisches Verfahren zur Bestimmung der Menge der vorhandenen O-Antistreptolysin-Antikörper bekannt.
Vor allem gibt es im Handel diagnostische Mittel, die es erlauben, die Antistreptolysin-Antikörper im Blutserum von Patienten zu bestimmen. Diese Mittel umfassen die folgenden Substanzen für eine Reaktion:
Das zu untersuchende Serum, klar und bei 56°C 30 Minuten inaktiviert;
physiologische Lösung auf einen pH-Wert von 6»5 gepuffert;
eine 5-9&Lge Suspension von roten Blutkörperchen von Kaninchen;
reduziertes 0-S, das im lyophilen Zustand vollständig titriert ist.
Zunehmend stärkere Verdünnungen des zu untersuchenden Serums werden 15 Minuten bei 37°C mit einer konstanten Menge 0-S inkubiert. Wenn Antikörper vorhanden sind, findet in dieser Stufe der Angriff der Antikörper gegen 0-S statt,
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und die hämolytische Aktivität des 0-S wird neutralisiert. Zur Vervollständigung des Verfahrens werden 5 % rote Blutkörperchen in gepufferter Lösung zugegeben, gerührt und 45 Minuten bei 37°C inkubiert, anschließend mit 2000 UpM zentrifugiert und die überstehenden Flüssigkeiten ausgewertet. Der Antikörpergehalt des Serums wird angegeben durch den Kehrwert der höchsten Serumverdünnung, die die hämolytische Aktivität des 0-S hemmt.
Dieses Verfahren, das im wesentlichen in einer Bestimmung der Hämolyse von roten Blutkörperchen, die zu dem System zugegeben sind, durch einen möglicherweise vorhandenen Überschuß von O-Streptolysin besteht, das vorher mit einer Probe von Blutserum umgesetzt worden ist, das von komplementären Elementen befreit worden ist und von einem Patienten entnommen worden ist, besitzt u.a. die folgenden Nachteile:
1.) Es ist frisches Serum erforderlich, das 30 Minuten bei 56°C von komplementären Elementen befreit worden ist.
(Dieses Erfordernis umfaßt zunächst die Entnahme von Patientenblut, 2-stündiges Stehenlassen der Probe bei Raumtemperatur, Abtrennung des Koagulums von dem Serum und Zentrifugieren und Inaktivierung des Serumkomplements
innerhalb von 30 Minuten bei 560C.) 2.) Es ist erforderlich, rote Blutkörperchen vom Menschen zur Verfugung zu haben (0 Rh+) oder Kaninchenzellen, die gewaschen und auf 5 % verdünnt sind (mit entsprechend
umständlichen Waschvorgängen) .
3.) Das Verfahren ist umständlich (besonders die Verdünnung des Serums, die Zugabe von O-Streptolysin und roten
Zellen zu dem verdünnten Serum). 4.) Es ist eine bestimmte Anzahl sorgfältig gewaschener und gereinigter Pipetten und Reagensgläser erforderlich für die Titration.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die folgenden bekannten Tatsachen ausgenutzt:
Das oxidierte 0-S ist nicht imstande, selbst mit den roten Blutkörperchen Bindungen einzugehen (Figur 2), aibsr reagiert mit den spezifischen Antikörpern (Figur 5), und das oxidierte 0-S gexfinnt nach der Reduktion seine hämolytische Kraft zurück (Figur 3)»
Nach dem erfindungsgesäßen Verfahren wird die Reaktion durchgeführt unter Verwendung von ganzem Patientenblut und Verwendung der darin vorhandenen roten Blutkörperchen als Detektoren. Das 0-S wird in oxidierter Form zur Verfügung gestellt und ist somit nicht imstande, die roten Blutkörperchen zu binden. Wenn das oxidierte 0-S mit dem Patientenblut in Berührung kommt, findet, wenn Anti-Q-S-Antikörper vorhanden sind, die Neutralisationsreaktion Yon Q-S statt, ohne daß die Membran angegriffen wird. Anschließend wird eine reduzierende Substanz zugegeben, die imjstande ist, die gerade oxidierten Sulfhydrilgruppen (-S-S-) des Toxins zu reduzieren und wieder die Sulfhydrilgruppen -SH zu bilden und diese zu befähigen, sich an die roten Blutkörperchen zu binden. In dieser Stufe können zwei unterschiedliche Fälle eintreten:
A) Das 0-S ist nicht an Antikörper gebunden, da keine solchen vorhanden sind: Wenn das der Fall ist, ist das O-Streptolysin, nachdem es reduziert ist, imstande, an die roten Blutkörperchen gebunden zu werden und die Membran der roten Blutkörperchen zu stören (deorganizing) und intermolekulare Ketten zu bilden, die zur Hämolyse führen, die wiederum leicht nachweisbar ist.
B) Das 0-S wird.an die Antikörper gebunden, wenn solche in dem zu untersuchenden Blut (oder Serum) vorhanden sind. In diesem Falle könnte die anschließende Reduktion eventuell ermöglichen, daß das 0-S über die freien Sulfhydrilgruppen an die Zellmembran der roten Blutkörperchen gebunden wird, aber es ist nicht imstande, intermolekulare Ketten zu bilden, und die Membran der roten Blutkörperchen wird nicht deorganisiert, und es tritt keine Hämolyse auf.
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Es -ist daher Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung des Antistreptolysingehaltes im Blut zu entwickeln, umfassend ein Produkt, umfassend oxidiertes O-Streptolysin in vorgewählten Konzentrationen, eine reduzierende. Substanz, um die hämolytische Fähigkeit von O-Streptolysin mit Sulfydrilgruppen -SH wieder herzustellen, und ein Verdünnungsmittel für das Patientenblut.
Insbesondere umfaßt die Vorrichtung mehrere Behälter, enthaltend oxidiertes O-Streptolysin in abgemessenen Mengen, die mit einem Lösungsmittel und/oder gleichmäßigen Blutproben eine Verdünnungsreihe von Blutproben mit einem konstanten Volumen ergeben.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung des Antistreptolysingehaltes, das im wesentlichen darin besteht, daß man oxidiertes und reduzierbares 0-Streptolysin mit Blutproben zusammenbringt und das Gemisch anschließend mit einer reduzierenden Substanz behandelt, um die hämolytische Fähigkeit des 0-Streptolysins wieder herzustellen."
Insbesondere sind bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Möglichkeiten vorgesehen, daß in die Behälter, die das O-Streptolysin in bestimmten Mengen und durch abgestuften Verdünnungen enthalten, Dosiseinheiten des zu untersuchenden Bluts gegeben werden können, das vorher verdünnt worden ist unidaß in jeden Behälter eine reduzierende Substanz gegeben wird, um die hämolytische Fähigkeit des O-Streptolysins wieder herzustellen, sodaß Hämolyse eintritt, die in den einzelnen Behältern nach Inkubation beobachtet und abgeschätzt werden kann.
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Allgemein gesagt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Messung des Antistreptolysingehaltes in einer Probe von menschlichem Blut, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
a) eine Vielzahl von Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen von oxidiertem O-Streptolysin herstellt,
b) eine Lösung einer reduzierenden Substanz herstellt, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Thiole, Natriummetabisulfit und Natriumsulfit;
c) eine Blutprobe mit einer entsprechenden nicht hämolytischen Lösung verdünnt;
d) ein gleiches Volumen verdünntes Blut zu jeder der unter a) angegebenen Lösungen zugibt;
e) die unter d) erhaltenen Lösungen bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur (18 bis 210C) und 500C eine zeitlang in der Größenordnung von 15 Minuten inkubiert;
f) zu der inkubierten Lösung b) ein abgemessenes Volumen der Lösung b) zugibt;
g) die Lösung f) bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 500C solange inkubiert bis sich die roten Blutkörperchen absetzen und
h) notiert, in welchen Behältern keine Hämolyse stattgefunden hat.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens, verglichen mit dem klassischen Verfahren, das bis jetzt angewandt wird, sind offensichtlich und umfassen vor allem die folgenden Punkte:
1.) Vereinfachung des Verfahrens, da es nicht mehr erforderlich ist, das Serum von dem Blut abzutrennen oder das Serum von den Komplementen zu befreien, wodurch eine wesentliche Verminderung der Arbeitsstufen und der für die Analyse erforderlichen Zeit erreicht wird'.
2.) Es sind keine roten Blutkörperchen erforderlich, deren Herstellung eine wesentliche Begrenzung für das Verfahren darstellt aufgrund der Schwierigkeit das Material zu gewinnen und zu lagern und der Schwierigkeit ihrer Zubereitung.
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3.) Verminderung sowohl der Zeit als auch der Kosten bei der Durchführung der Bestimnurig aufgrund der geringeren Arbeitsstufen und der Möglichkeit mit nicht speziell vorgebildetem Personal zu arbeiten aufgrund der großen Einfachheit des Verfahrens.
4.) Die Möglichkeit sehr kleine Blutproben zu verwenden; eine Tatsache, die die Gewinnung von Blutproben erleichtert in Fällen, in denen durch den Zustand des Patienten Schwierigkeiten auftreten können.
Die für die Bestimmung des Antistreptolysingehaltes benötigten Ausgangssubstanzen sind die folgenden: ganzes Patientenblut,
Verdünnungslösung für das Blut, oxidiertes O-Streptolysin, das in Behältern (Reagensgläsern) in verschiedenen bekannten Konzentrationen zur Verfügung gestellt wird, Lösung von reduzierenden Substanzen, wie organischen Substanzen, wie Thiolen, wie Mercaptoäthanol, Dithiotreitol, Cystein, N-Acetyl-cystein, und anorganischen reduzierenden Substanzen, z.B. Natriummetabisulfit und Natriumsulfit.
Nachdem das Patientenblut gewonnen ist, (aufgrund der kleinen erforderlichen Menge kann es auch aus der Fingerkuppe oder dem Ohrläppchen entnommen werden ) wird eine entsprechende Verdünnung mit einer geeigneten Verdünnungslösung hergestellt, die dann in kleinen Mengen (wie 0,2 ml) in jeden Behälter einer Reihe von Behältern gegeben wird, in denen bereits lyophilisiertes oxidiertes O-Streptolysin in einer vorbestimmten Menge vorhanden ist.
Nach einer kurzen Inkubationszeit, z.B. 15 Minuten bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis 500C,wird ein bestimmtes Volumen der reduzierenden Substanz zugegeben und weiter bei Raumtemperatur bis zu 500C solange inkubiert, wie es erforderlich ist, daß eine Sedimentation der roten Blutkörperchen eintritt (z.B. 1 bis 2 Stunden).
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Nach vollständigem Absetzen wird die Transparenz der hämolysierten und nicht hämolysierten überstehenden Flüssigkeiten abgelesen, d.h. die Behälter, in denen keine Hämolyse eingetreten ist, werden notiert. Die Antikörper— bewertung in den untersuchten Proben, ausgedrückt in Al. I-streptolysineinheiten pro ml, wird angegeben durch den letzten Behälter, in dem keine Hämolyse der roten Blutkörperchen stattgefunden hat.
Zum Vergleich werden im folgenden die beiden Verfahren miteinander verglichen, die Nachteile des üblichen Verfahrens und die Vorteile, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erreicht werden können, angegeben:
1. Nachteile des üblichen Verfahrens
1.1 Es ist frisches Serum erforderlich f das von den Komplementen 30 Minuten bei 560C befreit worden ist (Es muß zunächst Blut von dem Patienten entnommen werden, das 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen wird, das Koagulum muß von dem Serum abzentrifugiert werden und das Serumkomplement 30 Minuten bei 56°C inaktiviert werden).
1.2 Es muß eine Anzahl von Verdünnungen hergestellt werden, die unter Zugabe einer konstanten Menge 0-Streptolysin in die Behälter gegeben werden.
1.3 Man muß rote Blutkörperchen von Menschen (0 Rh+) oder Kaninchen zur Verfügung haben, die gewaschen und auf 5 % verdünnt worden sind (wobei umständliche Waschverfahren erforderlich sind).
1.4 Das Verfahren ist umständlich (Zugabe von O-Streptolysin und roten Blutkörperchen zu dem verdünnten Serum).
1.5 Um die klassische Titration durchzuführen, ist eine Anzahl von gründlich gereinigten Pipetten und Reagensgläsern erforderlich.
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2. Vorteile des neuen Verfahrens
2.1 Es ist nicht erforderlich, das Serum abzutrennen, da die Reaktion mit ganzem Blut durchgeführt werdenkann, das in so geringen Mengen erforderlich ist, daß es auch aus dem Ohrläppchen oder der Fingerkuppe entnommen werden kann.
2.2 Es wird nur eine einfache Verdünnung der Blutprobe hergestellt und ein bestimmtes konstantes Volumen davon in jeden Behälter gegeben ( in der Form, wie er vom Herstellter geliefert wird und fertig zur Anwendung ist), der eine entsprechende genau abgemessene Menge Toxin enthält, die in jedem Behälter unterschiedlich ist. Es ist daher nicht notwendig, einzelne Verdünnungen des Serums selbst herzustellen und diese anschließend zu verteilen wie bei den klassischen Verfahren,
2.3 Es müssen keine roten Blutkörperchen von Menschen oder Kaninchen zugesetzt werden, wodurch die Notwendigkeit des Waschens entfällt, da die Reaktion direkt die roten Blutkörperchen ausnutzt, die in dem Patientenblut enthalten sind.
2.4 Die einzelnen Verfahrensstufen zur Bestimmunge von Anti-O-Streptolysin werden auf ein Minimum verringert.
2.5 Für das Verfahren ist keine Laborausrüstung erforderlich, da alles, was für die Bestimmung erforderlich ist, soweit es die Kosten und die räumlichen Bedingungen zulassen, schon in der Analyseneinheit, wie sie in den Handel kommt, vorhanden ist.
../Patentansprüche
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Claims (4)

Paten-tansp rüche
1.7 Verfahren zur Bestimmung des Antistreptolysingehaltes Ln einer Probe von menschlichem Blut, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) verschiedene Lösungen unterschiedlicher Konzentration von oxidiertem O-Streptolysin herstellt,
b) eine Lösung einer reduzierenden Substanz herstellt, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Thiolen, Natriummetabisulfit und Natriumsulfit,
c) eine Blutprobe mit einer nicht hämolytischen Lösung verdünnt, '
d) ein gleiches Volumen von verdünntem Blut zu jeder der unter a) angegebenen Lösungen zugibt,
e) die unter d) erhaltenen Lösungen bei einer Temperatur von Raumtemperatur (18 bis 210C) bis 5O0C eine zeitlang in der Größenordnung von 15 Minuten inkubiert,
f) zu den inkubierten Lösungen e) ein abgemessenes Volumen der Lösung b) zugibt,
g) die Lösung f) bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 5O0C solange inkubiert, wie es erforderlich ist für eine Sedimentation der roten Blutkörperchen und
h) notiert, in welchem Behälter keine Hämolyse aufgetreten ist.
mittel
2. Diagnostizier- zur Durchführung des Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie oxidiertes O-Streptolysin in vorgewählten Konzer^f&e^Sduzierende Substanz zur Rückbildung der hämolytischen Fähigkeit von O-Streptolysin, das Sulfydrilgruppen -SH enthältrund ein Verdünnungsmittel für das Patientenblut umfaßt.
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-sr -
3. Diagnostizier-™ nSch Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß sie eine Vielzahl einzelner Behälter von oxidiertem O-Streptolysin in abgemessenen Mengen umfaßt, die mit einem Lösungsmittel und/oder gleichmäßigen Blutproben eine Verdünnungsreihe von Blutproben mit einem konstanten Volumen ergeben.
4. Diagnostiziermittel nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß die reduzierende Substanz Mercaptoäthanol, Dithiotreitol, Cystein, N-Acetylcystein, Natriummetabisulfit und/oder Natriumsulfit ist.
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