DE2657926B2

DE2657926B2 - Verfahren zur Bestimmung des Antistreptolysingehaltes im Blut

Info

Publication number: DE2657926B2
Application number: DE2657926A
Authority: DE
Inventors: Antonio Monteriggioni Siena Ricci (Italien)
Original assignee: ISTITUTO SIEROTERAPICO E VACCINOGENO TOSCANO SCLAVO SpA SIENA (ITALIEN)
Current assignee: ISTITUTO SIEROTERAPICO E VACCINOGENO TOSCANO SCLAVO SpA SIENA (ITALIEN)
Priority date: 1975-12-22
Filing date: 1976-12-21
Publication date: 1978-06-08
Also published as: NL169787C; IT1155243B; AU2023176A; TR19262A; DE2657926C3; AT352903B; AU509644B2; DE2657926A1; NO146581C; FI60449C; PT65994B; GB1531530A; BR7608652A; DK145276C; AR219288A1; DK145276B; US4148609A; ZA767051B; USRE31372E; FI763646A

Description

O-Streptolysin (O-S) ist ein Toxin von proteinartiger Natur, das von bestimmten Streptococci der A-Gruppe ausgeschieden wird. Dieses Toxin wirkt auf Versuchstiere tödlich, zerstört die Zellkulturen, löst die roten und weißen Blutkörperchen vieler Tierarten auf.

Einige Oxidantien hemmen wirksam die lytische Kraft dieses Toxins. Die Änderungen, die die Moleküle erleiden, betreffen die Sulfhydrilgruppen, -SH, die in Disulfidgruppen -S-S- umgewandelt werden. Natürlich werden bei Zugabe von reduzierenden Substanzen, wie Mercaptoäthanol, die — SH-Gruppen wieder gebildet. Die beiden Reaktionen sind in F i g. 1 angegeben, in der O-Streptolysin (O-S) dargestellt ist durch eine geometrische F i g. A mit vertikaler Ausrichtung.

Die Hämolyse der roten Blutkörperchen (Erythrozyten), die eintritt, wenn sie bei 37° C mit dem Toxin inkubiert werden, findet nur statt, wenn das O-S in reduzierter Form vorliegt, d. h., —SH-Gruppen enthält, da das oxidierte Toxin über die — S-S-Gruppen nicht mit der Cytoplasmamembran der roten Blutkörperchen in Wechselwirkung treten kann. Der Membranrezeptor wurde als Cholesterin identifiziert. Die Fig.2 und 3 zeigen schematisch dieses Phänomen. Dabei bezeichnet die Nr. 3 die Cytoplasmamembran in schräger Kreuzschraffur, während die Nr. 5 in punktierter Schraffur den Membranrezeptor Cholesterin zeigt. Nur solche O-S-Moleküle, die an die Membranrezeptoren gebunden sind (Fig.2), treten untereinander in Wechselwirkung, wie in F i g. 3 angegeben ist, und ordnen sich in Form von Röhren oder Ringen. Hämoglobin (Nr. 7), das in F i g. 3 in Form von Punkten oder Kreisen angegeben ist, tritt durch diese Ringe oder andere Bereiche aus, in denen die Lipide eine Desorganisation aufgrund des Cholesterinverlustes erfahren haben.

Wenn man O-S bei +4"C zusammen mit roten Blutkörperchen inkubiert, wird ein Angriff von O-S auf das Cholesterin der roten Blutkörperchen beobachtet, aber es tritt keine Lysis ein, da die Wechselwirkung mit den Toxinmolekülen eine Funktion der Temperatur ist. Hämolyse tritt ein, wenn das System auf 37° C gebracht wird. Wenn Anti-O-S(Antistreptolysin)-Antikörper bei + 4° C zu dem System zugegeben werden und die Temperatur anschließend auf 37°C erhöht wird, wird keine Hämolyse beobachtet. Die Erklärung ist folgende: Die funktioneilen Gruppen des O-S, von denen angenommen wird, daß sie untereinander in Wechselwirkung treten, sind durch die Antikörper blockiert. Dieses Phänomen ist schematisch in F i g. 4 gezeigt, wo die Anti-O-S-Antikörper durch die Bereiche 9 angegeben sind.

Wenn man das oxidierte O-S mit roten Blutkörperchen bei 37°C inkufaiert, tritt keine Hämolyse auf. Natürlich kann das oxidierte O-S nicht an den Membranrezeptoren 5 haften (siehe Fig.2). Wenn Anti-O-S-Antikörper 9 zugesetzt werden, werden diese an das oxidierte O-S gebunden, und es treten die in F i g. 5 gezeigten Bedingungen ein.

Wenn man jetzt eine reduzierende Substanz zu dem System zugibt, werden die Sulfydrilgruppen -SH zurückgebildet, aber es tritt keine Hämolyse ein, da die funktionellen Gruppen des O-S, die miteinander in Wechselwirkung treten könnten, durch die Antikörper 9 blockiert sind (siehe F i g. 4).

Die oben angegebenen Phänomene sind in den folgenden Literaturstellen beschrieben:

1 Howard, J. F., Wallace, M. R.: Brit. J. Exp.

Path., Band 34, Seite 181 (1953);
2. R a η t s, L. Α., R a η d a 11, R.: Proc. Sec. Exp. Biol.

Med. (N. Y.), Band 59, Seite 22 (1945);
3. Alan, ]. E, Raymond, M.: Ann. Inst. Pasteur, Band 114(1968).

Es ist seit langem ein diagnostisches Verfahren zur Bestimmung der Menge der vorhandenen O-Antistrep-

tolysin-Antikörper bekannt.
Vor allem gibt es im Handel diagnostische Mittel, die

es erlauben, die Antistreptolysin-Antikörper im Blutserum von Patienten zu bestimmen. Diese Mittel umfassen die folgenden Substanzen für eine Reaktion:

Das zu untersuchende Serum, klar und bei 56° C 30

Minuten inaktiviert;
so physiologische Lösung auf einen pH-Wert von 6,5 gepuffert;

eine 5%ige Suspension von roten Blutkörperchen von Kaninchen;

reduziertes O-S, das im lyophilen Zustand vollständig titriert ist.

Zunehmend stärkere Verdünnungen des zu untersuchenden Serums werden 15 Minuten bei 37°C mit einer konstanten Menge O-S inkubiert. Wenn Antikörper vorhanden sind, findet in dieser Stufe der Angriff der Antikörper auf O-S statt, und die hämolytische Aktivität des O-S wird neutralisiert. Zur Vervollständigung des Verfahrens werden 5% rote Blutkörperchen in gepufferter Lösung zugegeben, gerührt und 45 Minuten bei 37° C inkubiert, anschließend mit 2000UpM zentrifugiert und die überstehenden Flüssigkeiten ausgewertet. Der Antikörpergehalt des Serums wird angegeben durch den Kehrwert der höchsten Serumverdünnune.

die die hämolytische Aktivität des O-S hemmt.

Dieses Verfahren, das im wesentlichen in einer Bestimmung der Hämolyse von roten Blutkörperchen, die zu dem System zugegeben sind, durch einen möglicherweise vorhandenen Überschuß von O-Streptolysin besteht, das vorher mit einer Probe von Blutserum umgesetzt worden ist, das von komplementären Elementen befreit worden ist und von einem Patienten entommmen worden ist, besitzt u. a. die folgenden Nachteile:

1. Es ist frisches Serum erforderlich, das 30 Minuten bei 56° C von komplementären Elementen befreit worden ist (Dieses Erfordernis umfaßt zunächst die Entnahme von Patientenblut, 2stündiges Stehenlassen der Probe bei Raumtemperatur, Abtrennung des Koagulums von dem Serum und Zentrifugieren und Inaktivierung des Serumkomplements innerhalb von 30 Minuten bei 56° C.)

2. Es muß eine Anzahl von Verdünnungen hergestellt werden, die unter Zugabe einer konstanten Menge O-Streptolysin in die Behälter gegeben werden.

3. Es ist erforderlich, rote Blutkörperchen vom Menschen zur Verfügung zu haben (0 Rh + ) oder Kaninchenzellen, die gewaschen und auf 5% verdünnt sind (mit entsprechend umständlichen Waschvorgängen).

4. Das Verfahren ist umständlich (besonders die Verdünnung des Serums, die Zugabe von O-Streptolysin und roten Blutkörperchen zu dem verdünn- jü ten Serum).

5. Es ist eine bestimmte Anzahl sorgfältig gewaschener und gereinigter Pipetten und Reagenzgläser erforderlich für die Titration.

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Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem der Antistreptolysingehalt in Patientenserum auf einfachere Weise genau bestimmt werden kann.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die folgenden bekannten Tatsachen ausgenutzt:
Das oxidierte O-S ist nicht imstande, selbst mit den roten Blutkörperchen Bindungen einzugehen (Fig.2), aber reagiert mit den spezifischen Antikörpern (F i g. 5), und das oxidierte O-S gewinnt nach der Reduktion seine hämolytische Kraft zurück (F i g. 3).

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur .Bestimmung des Antistrepiolysingehaltes in einer Probe von menschlichem Blut, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) verschiedene Lösungen unterschiedlicher Konzentration von oxidiertem O-Streptolysin herstellt,

b) eine Lösung einer reduzierenden Substanz herstellt, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Thiolen, Natriummetabisulfit und Natriumsulfit,

c) eine Blutprobe mit einer nichthämolytischen Lösung verdünnt,

d) ein gleiches Volumen von verdünntem Blut zu jeder der unter a) angegebenen Lösungen zugibt,

e) die unter d) erhaltenen Lösungen bei einer Temperatur von 18 bis 5O⁰C etwa 15 Minuten lang inkubiert,

f) zu den inkubierten Lösungen ein abgemessenes Volumen der unter b) angegebenen Lösung zugibt,

g) die gemäß f) hergestellte Lösung bei einer Temperatur zwischen 18 und 50⁰C so lange inkubiert, wie es für eine Sedimentation der roten Blutkörperchen erforderlich ist, und
h) feststellt, in welchem Behälter keine Hämolyse aufgetreten ist.

Nach dem erfindungsgemäflen Verfahren wird die Reaktion durchgeführt unter Verwendung von ganzem Patientenblut und Verwendung der darin vorhandenen roten Blutkörperchen als Detektoren. Das O-S wird in oxidierter Form zur Verfügung gestellt und ist somit nicht imstande, die roten Blutkörpeichen zu binden. Wenn das oxidierte O-S mit dem Patientenblut in Berührung kommt, findet, wenn Anti-O-S-Antikörper vorhanden sind, die Neutralisationsreaktion von O-S statt, ohne daß die Membran angegriffen wird. Anschließend wird eine reduzierende Substanz zugegeben, die imstande ist, die gerade oxidierten Sulfhydrilgruppen (—S-S-) des Toxins zu reduzieren und wieder die Sulfhydrilgruppen -SH zu bilden und diese zu befähigen, sich an die roten Blutkörperchen zu binden. In dieser Stufe können zwei unterschiedliche Fälle eintreten:

A) Das O-S ist nicht an Antikörper gebunden, da keine solchen vorhanden sind: Wenn das der Fall ist, ist das O-Streptolysin, nachdem es reduziert ist, imstande, an die roten Blutkörperchen gebunden zu werden und die Membran der roten Blutkörperchen zu stören (deorganisieren) und intermolekulare Ketten zu bilden, die zur Hämolyse führen, die wiederum leicht nachweisbar ist

B) Das O-S wird an die Antikörper gebunden, wenn solche in dem zu untersuchenden Blut (oder Serum) vorhanden sind. In diesem Falle könnte die anschließende Reduktion eventuell ermöglichen, daß das O-S über die freien Sulfhydrilgruppen an die Zellmembran der roten Blutkörperchen gebunden wird, aber es ist nicht imstande, intermolekulare Ketten zu bilden, und die Membran der roten Blutkörperchen wird nicht deorganisiert, und es tritt keine Hämolyse auf.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens, verglichen mit dem klassischen Verfahren, das bis jetzt angewandt wird, sind offensichtlich und umfassen vor allem die folgenden Punkte:

1. Vereinfachung des Verfahrens, da es nicht mehr erforderlich ist, das Serum von dem Blut abzutrennen oder das Serum von den Komplementen zu befreien, wodurch eine wesentliche Verminderung der Arbeitsstufen und der für die Analyse erforderlichen Zeit erreicht wird.

2. Es sind keine zusätzlichen roten Blutkörperchen erforderlich, deren Herstellung eine wesentliche Begrenzung für das Verfahren darstellt und aufgrund der Schwierigkeit das Material zu gewinnen und zu lagern und der Schwierigkeit ihrer Zubereitung.

3. Verminderung sowohl der Zeit als auch der Kosten bei der Durchführung der Bestimmung aufgrund der geringeren Arbeitsstufen und der Möglichkeit, mit nicht speziell vorgebildetem Personal zu arbeiten aufgrund der großen Einfachheit des Verfahrens.

4. Die Möglichkeit, sehr kleine Blutproben zu verwenden; eine Tatsache, die die Gewinnung von Blutproben erleichtert, in Fa¹^n, in denen durch den Zustand des Patienten Schwierigkeiten auftreten können.

Die für die Bestimmung des Antistreptolysingehaltes benötigten Ausgangssubstanzen sind die folgenden:

ganzes Patientenblut,
Verdünnungslösung für das Blut,
oxidiertes O-Streptolysin, das in Behältern (Reagenzgläsern) in verschiedenen bekannten Konzentrationen zur Verfügung gestellt wird.
Lösung von reduzierenden Substanzen, wie organischen Substanzen, wie Thiolen, wie Mercaptoäthanol, Dithiothreitol, Cystein, N-Acetyl-cystein, und anorganischen reduzierenden Substanzen, z. B. Natriummetabisulfit und Natriumsulfit.

Die benötigten Substanzen können vorteilhafterweise in abgemessenen Mengen in einzelnen Behältern abgepackt und in Form einer Testpackung, die alle notwendigen Bestandteile enthält, in den Handel gebracht werden.

Nachdem das Patientenblut gewonnen ist (aufgrund der kleinen erforderlichen Menge kann es auch aus der Fingerkuppe oder dem Ohrläppchen entnommen werden), wird eine entsprechende Verdünnung mit einer geeigneten Verdünnungslösung hergestellt, die dann in kleinen Mengen (wie 0,2 ml) in jeden Behälter einer Reihe von Behältern gegeben wird, in denen bereits lyophilisiertes oxidiertes O-Streptolysin in einer vorbestimmten Menge vorhanden ist.

Nach einer kurzen Inkubationszeit, z.B. 15 Minuten bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis 50° C, wird ein bestimmtes Volumen der reduzierenden Substanz zugegeben und weiter bei Raumtemperatur bis zu 50° C so lange inkubiert, wie es erforderlich ist, daß eine Sedimentation der roten Blutkörperchen eintritt (z. B. 1 bis 2 Stunden).

Nach vollständigem Absetzen wird die Transparenz der hämolysierten und nicht hämolysierten überstehenden Flüssigkeiten abgelesen, d. h., die Behälter, in denen keine Hämolyse eingetreten ist, werden notiert. Die Antikörperbewertung in den untersuchten Proben, ausgedrückt in Antistreptolysineinheiten pro ml, wird angegeben durch den letzten Behälter, in dem keine Hämolyse der roten Blutkörperchen stattgefunden hat.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Bestimmung des Antistreptolysingehaltes in einer Probe von menschlichem Blut, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) verschiedene Lösungen unterschiedlicher Konzentration von oxidiertem O-Streptolysin herstellt,

b) eine Lösung einer reduzierenden Substanz herstellt, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Thiolen, Natriummetabisulfit und Natriumsulfit,

c) eine Blutprobe mit einer nicht hämolytischen Lösung verdünnt,

d) ein gleiches Volumen von verdünntem Blut zu jeder der unter a) angegebenen Lösungen zugibt,

e) die unter d) erhaltenen Lösungen bsi einer Temperatur von 18 bis 50° C etwa 15 Minuten lang inkubiert,

f) zu den inkubierten Lösungen ein abgemessenes Volumen der unter b) angegebenen Lösung zugibt,

g) die gemäß f) hergestellte Lösung bei einer Temperatur zwischen 18 und 50°C so lange inkubiert, wie es für eine Sedimentation der roten Blutkörperchen erforderlich ist, und

h) feststellt, in welchem Behälter keine Hämolyse aufgetreten ist.