NO146581B - Fremgangsmaate for bestemmelse av antistreptolysin-innnhold i blod - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for bestemmelse av antistreptolysin-innholdet i en prøve av menneskelig blod, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at man a) fremstiller en rekke oppløsninger av forskjellige konsentrasjoner av oksydert O-streptolysin

b) fremstiller en oppløsning av en reduserende:' forbind-

else valgt fra gruppen bestående av tioler, natrium-metabisulfitt og natriumsulfitt,

c) fortynner en blodprøve med et passende, ikke-hemolyt-

tisk løsningsmiddel,

d) innfører en lik mengde fortynnet blod i hver av opp-løsningene erholdt under a),

e) inkuberer oppløsningene fra d) ved en temperatur mel-

lom romtemperatur (18-21°C) og 50°C i en tid av 15

minutter.

f) tilsetter et utmålt volum av oppløsningen erholdt un-

der b) til den inkuberte oppløsning erholdt under e),

g) inkuberer oppløsningen erholdt under f) ved en temperatur mellom romtemperatur og 50°C i den tid som er

nødvendig for å sedimentere de røde blodlegemer, og

h) konstaterer i hvilke prøverør det ikke har funnet sted noen hemolyse.

Disse trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravet.

O-streptolysin (O-S) er et toksin av protein-natur som ut-skilles av bestemte streptokokker av A-gruppen. Dette tok-

sin er dødbringende for forsøksdyr, ødelegger cellulære struk-turer og lyserer røde og hvite blodlegemer hos mange dyre-arter.

Noen få oksydasjonsmidler kan benyttes for å hindre den lyt-iske virkning av toksinet. De endringer molekylet undergår vedrører sulfhydrylgruppene -SHsom omdannes til disulfid-grupper -S-S-. I virkeligheten kan -SH-gruppene gjendannes ved tilsetning av et reduksjonsmiddel som f.eks. merkaptoetanol. De to reaksjonene er vist i fig. 1 hvor O-streptolysin (O-S) er angitt ved en geometrisk figur 1 med verti-kal skravering. Hemolyse av de røde blodlegemer ved inkubasjon med toksinet ved 37°C, finner bare sted når O-S foreligger i den reduserte form, dvs. med -SH-grupper, ettersom det reduserte toksin ikke kan reagere med -S-S-gruppene med cytoplasmamembranet i de røde blodlegemer. Membran-recep-toren er identifisert som kolesterol. Fig. 2 og 3 viser fenomenet diagrammatisk hvor tallet 3 angir cytoplasmamembranet i krysskravering mens tallet 5 angir membranresep-toren kolesterol, i vanlig skravering. Bare de O-S-mole-kyler som er bundet til membranreseptorene (se fig. 2) reagerer med hverandre som angitt i fig. 3, og ordner seg i .form av sirkulære kanaler eller huller. Hemoglobin 7, angitt som punkter i fig. 3, unnviker gjennom de nevnte huller eller gjennom andre områder hvor lipidene har gjennomgått en omleiring på grunn av kolesteroltap. Dersom O-S inkuberes med røde blodlegemer ved +4°C ved hvilken temperatur O^S -erfaringsmessig angriper kolesterolet i de røde blod-legemene, inntrer ikke noen lytisk reaksjon fordi veksel-virkningen mellom toksinmolekylene er en funksjon av temperaturen. En hemolyse inntrer når systemet bringes opp til 37°C. Dersom nå (antistreptolysin) antistoffer tilsettes systemet ved +4°C og temperaturen deretter heves til 37°C, oppnås ingen hemolyse. Forklaringen er følgende: De funksjonelle grupper i O-S som skulle reagere med hverandre er blitt blokkert av antistoffer. Dette forhold er vist diagrammatisk i fig. 4, hvor anti-O-S antistoffer er vist ved området 9. Dersom det oksyderte O-S tillates in-kubert med røde blodlegemer ved 37°C inntrer ingen hemolyse. I virkeligheten kan ikke det oksyderte O-S festes til mem-branreseptoréné 5 (se fig. 2). Dersom anti-O-S antistoffer 9 tilsettes vil disse være bundet til det oksyderte O-S og. tilstanden i fig. 5 vil være oppnådd. Dersom nå systemet tilsettes en reduserende forbindelse vil sulfhydrylgruppen gjendannes men det vil ikke inntre noen hemolyse siden de funksjonelle gruppene i O-S som skulle reagere gjensidig med hverandre, er blokkert av antistoffene 9 (se fig. 4) .

Som underlag for det foregående kan det vises til følgende vitenskapelige arbeider: 1) Howard J.F., Wallace, M.R.: Brit. J. Exp.Pat. 34, 181

(1953); 2) Rants, L.A., Randall, R.: Proe.Sec. Exp.Biol.Med (N.Y.) 59, 22, (1945); 3) Alan, J.E., Raymond, M.: Ann, Inst. Pasteur, 114, (1968).

En diagnostisk metoder er for lenge siden foreslått for å beregne mengden av tilstedeværende O-antistreptolysin antistoffer. Det foreligger på området særlig en diagnostisk metode som tillater bestemmelse av antistreptolysin-antistoffer i blodserum hos pasienter hvilken fremgangsmåte inneholder følgende stoffer for reaksjonen:

serumet som skal testes, klartog inaktivert ved 56°C

i 30 minutter.

fysiologisk oppløsning pufret til pH = 6,5.

5% suspensjon av røde blodlegemer fra kanin

- redusert O-S som er omhyggelig titrert i lyofil tilstand.

Progressivt økende fortynninger av serumet som skal under-søkes, inkuberes ved 37°C i 15 minutter med en konstant mengde av O-S-. Dersom antistoffer er tilstede vil angrepet av antistoffene på O-S finne sted på dette stadium, hvorved de hemolyttiske aktiviteter av O-S således blir nøytralisert.

For fullendelse av denne fremgangsmåte tilsettes 5% røde blodlegemer i pufret oppløsning, røres og hensettes for in-kubering i 45 minutter ved 37°C, sentrifugeres ved 2 000 omdreininger pr. minutt-og overskytende væske avleses. Innholdet av antistoff i serumet angis som den høyeste serura-fortynning som hindrer den hemolyttiske aktivitet av O-S.

Denne metode som vesentlig består i å bestemme hemolysen i de røde blodlegemer tilsatt systemet ved et mulig overskudd av O-streptolysin som tidligere har reagert med en prøve av blodserum fraskilt komplementære elementer og tatt fra en pasient, har bl.a. følgende ulemper: 1) Friskt serum hvorfra komplementære elementer er fjer-net ved inaktivering ved 56°C i 30 minutter er nød-vendig (disse krav innbefatter den opprinnelige blod-tagning av pasienten,"henstand av prøven ved romtemperatur i 2 timer, separasjon av koagulum fra serumet og sentrifugering, og den nevnte inaktivering av serumet ved 56°C i 30 minutter. 2) Det er nødvendig å ha røde blodlegemer tilgjengelig fra mennesker (O Rh+ gruppe) eller fra kaniner, vasket og fortynnet til 5% (med en besværlig vaskeopera-sjon) . 3) Teknikken er besværlig (særlig fortynningen av serum og tilsetningen av O-streptolysin og røde blodlegemer til det fortynnede serum). 4) Et bestemt antall omhyggelig vaskede pipetter og rea-gensglass er nødvendige for bestemmelsen.

Den nye metode ifølge oppfinnelsen utnytter følgende to kjente prinsipper: at det oksyderte O-S ikke er istand til å binde seg selv til de røde blodlegemer (fig. 2) men reagerer med spesielle antistoffer (fig. 5) og

at det oksyderte O-S etter reduksjon igjen oppnår

hemolyttisk evne (fig. 3) .

I overensstemmelse med oppfinnelsen og overraskende er det nå fremskaffet en fremgangsmåte hvorved reaksjonen gjennom-føres med urenset blod fra pasienten og ved å utnytte de deri tilstedeværende røde blodlegemer som detektorer. O-S benyttes i oksydert tilstand og således ikke i en form hvorved det kan bindes til de røde blodlegemer. Når det oksyderte O-S kommer i kontakt med pasientens blod, vil ved nærvær av anti-O-S antistoffer, nøytralisasjonsreaksjonen av O-S finne sted uten angrep på membranen. Følgelig innføres en reduserende forbindelse som er i stand til å redusere akkurat det oksyderte, sulfhydryl (-S-S-) av toksinet og gjenopprette -SH sulfhydryl slik at den kan fikseres til de røde blodlegemer. På dette trinn kan to forskjellige forhold oppstå: A) O-S er ikke bundet til antistoffer på grunn av fraværet av sistnevnte. I så tilfelle er O-streptolysin når det først er redusert, istand til å bli bundet til de røde blodlegemer og omorganiseringen av membranet i de røde celler og dannelsen av intermolekylære kjeder gir an-ledning til hemolyse, hvilket i .virkeligheten er lett å påvise. B) O-S er bundet til antistoffene som er tilstede i det blodet (eller serumet) som skal testes. I dette tilfelle vil muligens den etterfølgende reduksjon kunne gjøre O-S istand til å bli bundet til de frie sulfhydryl-posisjonene i de røde blodlegemenes cellulære mem-braner, men det vil ikke være i stand til å danne intermolekylære kjeder som ikke deorganiserer de røde celle-membraner hvorved en hemolyse således ikke kan inntre.

Det middel som tjener til utøvelse av fremgangsmåten omfat-ter hensiktsmessig et basisprodukt dannet av oksydert 0-streptolysin i forut bestemte konsentrasjoner, et reduserende stoff av de nærmere angitte typer for å gjendanne den hemolyttiske evne til O-streptolysin med sulfhydrylgrupper

-SH, og et fortynningsmiddel eller løsningsmiddel for pasientens blod, fordelaktig i form av en flerhet av beholdere

med oksydert O-streptolysin i et oppløsningsmiddel og/eller like blodprøver i gradvis økende fortynning, for å gi prøver av fortynnet blod med konstant volum.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen utøves hensiktsmessig ved at det treffes forholdsregler for at i beholdere som inneholder mengder av oksydert O-streptolysin i grad-

vis fortynninger, innføres like mengdeenheter av blod som skal undersøkes og som er blitt så omhyggelig fortynnet at det til hver beholder kan tilsettes et reduserende stoff av den angitte type slik at den hemolyttiske evnen til O-streptolysin gjendannes og hemolyse oppnås, og at hemolysen bedøm-

mes i de forskjellige beholdere etter inkubasjon.

Fordelene ved den forslåtte metode i forhold til den klassiske metode som'vanligvis benyttes er åpenbare og hovedfor-delene kan oppsummeres som følger:

1) .Forenkling av teknikken, i og med at det ikke lenger

er nødvendig.'å skille serumet fra blodet eller å rense blodserumet hvorved det oppnås en betydelig reduksjon i arbeide og i analysetiden.

2) Fritagelse for anvendelse av røde blodlegemer; idet den.vanlige fremstilling av disse er en betydelig be-grensning av den vanlige fremgangsmåte, på grunn av vanskelighetene med å fremskaffe materialer, å lagre de og vanskeligheten med prepareringen. 3) Reduksjon både av tid og utgifter ved gjennomføring av prøvene på grunn av færre antall operasjoner og muligheten av å benytte ulært personell på grunn av den ytterst enkle metodikk. 4) Muligheten av å benytte meget små blodprøver, hvilket forenkler prøvetagningen i slike tilfeller hvor dette vanskeliggjøres ved pasientens spesielle tilstand.

De nødvendige materialer for bestemmelse av antistreptolysin-innholdet er følgende:

blod, direkte fra pasienten,

fortynningsoppløsning for blodet

oksydert O-streptolysin fordelt i beholdere (reagens-rør) med forskjellig kjent konsentrasjon

oppløsning av reduserende stoff valgt fra tioler som f.eks. merkaptoetanol, natrium-metabisulfitt og natriumsulfitt.

Når blodprøven er tatt fra pasienten (på grunn av de små mengder som er nødvendige kan prøvene trekkes fra fingertup-pene eller øreflippen) fortynnes med en passende mengde fortynningsmiddel og has derpå i små mengder (f.eks. 0,2 ml)

i hvert reagensrør av et sett hvori lyofilt oksydert O-streptolysin allerede er tilstede i bestemt mengde. Etter en kort tids inkubasjon f.eks. 15 minutter ved en temperatur fra romtemperatur til 50°C, tilsettes et bestemt volum av den reduserende forbindelse og inkubasjonen fortsetter ved romtemperatur og opp til 50°C, for den tid som er nødvendig for sedi-mentering av de røde blodlegemer (f.eks. 1-2 timer). Når reaksjonen er ferdig avleses gjennomskinneligheten i den overliggende hemolyserte og den ikke hemolyserte væske; hvor-under da de reagensrør hvori det ikke har funnet sted noen hemolyse, noteres.

Mengden av antistoffer i de undersøkte prøver uttrykt som antistreptolysin-enheter pr. ml. er gitt ved det siste rea-gensrør hvori det ikke har funnet sted noen hemolyse.

For sammenligning er i det følgende de to fremgangsmåtene sammenlignet med angivelse av ulempene ved den konvensjonelle metode og fordelene ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelsen:

1. Ulemper ved den konvensjonelle metode.

1.1 Det kreves friskt serum berøvet de komplementære stoffer ved oppvarming ved 56°C i 30 minutter. (Først blod-prøvetagning hos pasienten. Oppbevaring ved romtemperatur i 2 timer. Adskillelse av koagulum fra serum og sentrifugering av samme. Inaktivering av serum-komplemen-tær-stoffene ved 56°C i 30 minutter).

1.2 Et antall fortynninger av serumet må foreligge i rea-gensrør og tilsettes en konstant mengde O-streptolysin.

1.3 Nødvendigheten av å ha tilgjengelig røde blodlegemer fra menneske (O Rh+) eller fra kaniner, vasket og fortynnet til 5% (med det besvær som knytter seg til vaske-prosessen).

1.4 Arbeidskrevende fremgangsmåte (tilsetning av O-streptolysin og røde blodlegemer til det fortynnede serum).

1.5 For utførelse av den konvensjonelle fremgangsmåte er det nødvendig med et antall omhyggelig vaskede pipetter og reagensrør.

Fordeler ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen.

2.1 Ingen nødvendighet å separere serum da reaksjonen kan utføres med hel-blod som kan trekkes fra øreflippen eller en fingertupp fordi det bare trengs en liten mengde.

2.2 ! Det foretas en enkél fortynning av blodprøven og et bestemt konstant volum fordeles i hvert reagensrør (som

leveres av produsenten ferdig til bruk) som inneholder en passende mengde toksin, ferdig utmålt av produsenten, og forskjellig for hvert reagensrør. Det er således ikke lenger nødvendig med arbeidskrevende fortynning og etter-følgende fordeling som ifølge den klassiske metode.

2.3 Det er ikke nødvendig med røde blodlegemer fra mennesker eller kaniner hvilket utelukker nødvendigheten av vasking fordi reaksjonen utnytter direkte de røde blodlegemer i pasientens blod.

2.4 Arbeidsoperasjonene for å utføre anti-streptolysin-bestemmelsen er redusert til et minimum.

2.5 Det er ikke nødvendig med noe laboratorieutstyr fordi det som er nødvendig for reaksjonen leveres som del av utstyret fra leverandøren.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av antistreptolysin-innholdet

   i en prøve av menneskelig blod,karakterisert ved at man a) fremstiller en rekke oppløsninger av forskjellige konsentrasjoner av oksydert O-streptolysin b) fremstiller en oppløsning av en reduserende forbindelse valgt fra gruppen bestående av tioler, natrium-metabisulfitt og natriumsulfitt, c) fortynner en blodprøve med et passende, ikke-hemolyttisk løsningsmiddel, d) innfører en lik mengde fortynnet blod i hver av opp-løsningene erholdt under a), .e) inkuberer oppløsningene fra d) ved en temperatur mellom romtemperatur (18 - 21°C) og 50°c i en tid av 15 min. f) tilsetter et utmålt volum av oppløsningen erholdt under b) til den inkuberte oppløsning erholdt under e), g) inkuberer oppløsningen erholdt under f) ved en temperatur mellom romtemperatur og 50°C i den tid som er' nød-vendig for å sedimentere de røde blodlegemer, og h) konstatere i hvilke prøverør det ikke har funnet sted noen hemolyse.