SU1773409A1

SU1773409A1 - Method for assessment of non-specific reactivity in sheep

Info

Publication number: SU1773409A1
Application number: SU914920201A
Authority: SU
Inventors: Anatolij F Dmitriev; Tuleutaj U Syzdykov; Margarita A Nikishova; Ajtbaj K Bulashev; Vladimir P Mingilev
Original assignee: Stavropol Selskokhoz I; Tselinograd Selskokhoz I
Priority date: 1991-03-19
Filing date: 1991-03-19
Publication date: 1992-11-07

Description

(54) СРЕДСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТИ ОВЕЦ (57) Использование: экспериментальная и ветеринарная иммунология. Сущность! определение неспецифической реактивности овец с помощью гемолизина, который используют в разведении 1:8-1:16. Гемолизин смешивают с периферической кровью исследуемого животного, инкубируют 18 ч при 20-24°С в капиллярах и учитывают результаты реакции по скорости оседания эритроцитов и степени гемолиза в опытной и контрольной пробах. По результатам реакции определяют индекс неспецифической реактивности животных. 3 табл.(54) MEANS FOR DETERMINING THE NON-SPECIFIC REACTIVITY OF SHEEP (57) Usage: experimental and veterinary immunology. Essence! determination of nonspecific reactivity of sheep using hemolysin, which is used at a dilution of 1: 8-1: 16. Hemolysin is mixed with the peripheral blood of the test animal, incubated for 18 hours at 20-24 ° C in capillaries and the results of the reaction according to the erythrocyte sedimentation rate and the degree of hemolysis in the experimental and control samples are taken into account. According to the results of the reaction, the index of nonspecific reactivity of animals is determined. 3 tab.

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для определения физиологического состояния организма.The invention relates to immunology and can be used to determine the physiological state of the body.

Гемолизин - инактивированная сыворотка крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана, известен в качестве средства, которое широко используется в лабораторной практике как диагностикум. Специфическая гемолитическая сыворотка, лизирующая эритроциты барана в высоком титре, применяется в реакции связывания комплемента (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. /Под ред. М.О.Биргера.- М.: Медицина. 1982, с. 464).Hemolysin, an inactivated blood serum of a rabbit immunized with sheep erythrocytes, is known as a drug that is widely used in laboratory practice as a diagnosticum. Specific hemolytic serum, which lyses sheep erythrocytes in a high titer, is used in the complement binding reaction (Handbook of microbiological and virological research methods. / Ed. By MO Birger. - M .: Medicine. 1982, p. 464).

Известно также применение гемолизина при титровании комплемента. Его активность определяют в той же гемолитической системе, которую используют для реакции связывания комплемента (стандартные эритроциты барана и антисыворотка). Обак тивности комплемента судят по наименьшему количеству исследуемой сыворотки, которое способствует полному или 50% гемолизу сенсибилизированных эритроцитов [1] .It is also known to use hemolysin in complement titration. Its activity is determined in the same hemolytic system that is used for the complement binding reaction (standard sheep erythrocytes and antiserum). The complement content is judged by the smallest amount of the studied serum, which contributes to the complete or 50% hemolysis of sensitized erythrocytes [1].

Известен способ определения иммунологической реактивности особей, включающий инкубирование проб крови с тестирующей биологической жидкостью, причем в качестве тестирующей биологической жидкости используют видоспецифическую антисыворотку, которую в соотношении 1:2 смешивают с периферической кровью исследуемого, инкубируют 18 ч при 20-24°С в капиллярах, а результаты ре- | акции учитывают по скорости оседания эритроцитов и степени цитолиза в опытной и контрольной пробах.There is a known method for determining the immunological reactivity of individuals, including incubating blood samples with a testing biological fluid, and a species-specific antiserum is used as a testing biological fluid, which is mixed with the peripheral blood of the subject in a ratio of 1: 2, incubated for 18 hours at 20-24 ° C in capillaries, and the results of re- | shares are taken into account according to the erythrocyte sedimentation rate and the degree of cytolysis in the experimental and control samples.

Недостатком этого способа является то. что для его осуществления в условиях лаборатории необходимо приготовление видоспецифической сыворотки, что сопряжено сThe disadvantage of this method is that. that for its implementation in a laboratory, it is necessary to prepare a species-specific serum, which is associated with

1773409 А1 большими трудностями (наличием лабораторных животных, затратой средств и времени). Кроме того, сыворотки, полученные в условиях различных лабораторий и в разное время, не отличаются стабильностью. Качество полученных антисывороток зависит от многих факторов, связанных с технологией их получения, в том числе: от степени очистки антигена, уровня иммунного ответа лабораторных животных и других.1773409 A1 great difficulties (the presence of laboratory animals, cost and time). In addition, sera obtained in different laboratories and at different times are not stable. The quality of the obtained antisera depends on many factors associated with the technology of their production, including: the degree of antigen purification, the level of the immune response of laboratory animals, and others.

Целью изобретения является расширение арсенала средств для определения неспецифической реактивности организма и повышение возможности их практического применения.The aim of the invention is to expand the arsenal of tools for determining the nonspecific reactivity of the organism and to increase the possibility of their practical application.

Эта цель достигается применением гемолизина в качестве средства для определения неспецифической, реактивности у овец. Определение реактивности поголовья овец осуществляется In vitro путем смешивания гемолитической сыворотки с периферической кровью исследуемого животного, инкубирования смеси в капиллярах с последующим учетом результатов реакции через 18 ч по степени цитолиза в опытной и контрольной пробах.This goal is achieved by the use of hemolysin as a tool for the determination of non-specific reactivity in sheep. Determination of the reactivity of the sheep population is carried out in vitro by mixing hemolytic serum with the peripheral blood of the test animal, incubating the mixture in capillaries, followed by taking into account the results of the reaction after 18 hours according to the degree of cytolysis in the experimental and control samples.

Существо технического решения заключается в следующем.The essence of the technical solution is as follows.

Гемолитическую сыворотку в соотношении. 1:2 смешивают с периферической кровыо исследуемого животного, инкубируют 18 ч при 20-24°С в капиллярах, а результаты реакции учитывают по скорости оседания эритроцитов и степени гемолиза в опытной и контрольной пробах.Hemolytic serum ratio. 1: 2 is mixed with the peripheral blood of the test animal, incubated for 18 hours at 20-24 ° C in capillaries, and the reaction results are taken into account according to the erythrocyte sedimentation rate and the degree of hemolysis in the experimental and control samples.

Видоспецифические антитела гемолитической сыворотки под влиянием комплемента исследуемого животного вступают в реакцию с эритроцитарными антигенами, что приводит к их агглютинации и гемолизу. Цитотоксические действие гемолизина зависит от содержания комплемента в крови исследуемого животного, а также от функциональной активности клеток крови и генотипических особенностей организма.Species-specific antibodies of hemolytic serum, under the influence of the complement of the studied animal, react with erythrocyte antigens, which leads to their agglutination and hemolysis. The cytotoxic effect of hemolysin depends on the complement content in the blood of the studied animal, as well as on the functional activity of blood cells and the genotypic characteristics of the organism.

Предлагаемое средство испытано на овцематках, новорожденных ягнятах и поясняется примерами.The proposed tool has been tested on ewes, newborn lambs and is illustrated by examples.

П р и м е р 1. Готовили различные разведения гемолизина на физиологическом растворе и ставили реакцию капельной гемагглютинации с, кровью исследуемого животного. Гемолитическую сыворотку для реакции связывания комплемента использовали в разведении 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128.PRI me R 1. Prepared various dilutions of hemolysin in saline and set the drop hemagglutination reaction with the blood of the animal under study. Hemolytic serum for the complement fixation reaction was used in a dilution of 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128.

Одну каплю крови исследуемого животного наносили на предметное стекло, затем добавляли одну каплю гемолизина, быстро перемешивали стеклянной палоч кой и через 3-5 мин учитывали результаты реакции в крестах.One drop of the blood of the test animal was applied to a glass slide, then one drop of hemolysin was added, quickly stirred with a glass rod, and after 3-5 min the results of the reaction in crosses were taken into account.

Как видно из приведенных данных в табл. 1, наибольшее разведение гемолизина, с которым наблюдается агглютинация эритроцитов исследуемых проб крови, составило 1/128. Однако у некоторых животных (№ 35; 9586; 4570 и др.) реакция была отрицательной. Наиболее выраженная реакция, интенсивностью не менее двух крестов, отмечалась в разведении гемолитической сыворотки, равном 1/16. В связи с этим для определения иммунологической реактивности животных была взята гемолитическая сыворотка 1:16.As can be seen from the data presented in table. 1, the highest dilution of hemolysin, with which agglutination of erythrocytes in the blood samples under study is observed, was 1/128. However, in some animals (No. 35; 9586; 4570, etc.) the reaction was negative. The most pronounced reaction, with an intensity of at least two crosses, was noted in a dilution of hemolytic serum equal to 1/16. In this regard, hemolytic serum 1:16 was taken to determine the immunological reactivity of animals.

П р и м е р 2. В капиллярную пипетку аппарата Панченкова 1/2 объема 50 мм набирали гемолизина и выливали в лунку предметного стекла. Затем этой же пипеткой набирали кровь (1.00 мм) и тоже выливали в лунку. Кровь исследуемого животного тщательно перемешивали с антисывороткой и полученную смесь набирали в пипетку и ставили в штатив. В связи с тем, что гемолизин смешивался с кровыо исследуемого животного в разведении 1:2 его рабочее разведение было 1:8.PRI me R 2. Hemolysin was taken into a capillary pipette of the Panchenkov apparatus of 1/2 volume of 50 mm and poured into a well of a glass slide. Then blood (1.00 mm) was taken with the same pipette and also poured into the well. The blood of the test animal was thoroughly mixed with the antiserum, and the resulting mixture was drawn into a pipette and placed in a rack. Due to the fact that hemolysin was mixed with the blood of the studied animal at a 1: 2 dilution, its working dilution was 1: 8.

Ставили также контрольную пробу для каждого животного отдельно. В контрольном капилляре вместо гемолитической сыворотки использовали физиологический раствор.A control sample was also set for each animal separately. In the control capillary, physiological saline was used instead of hemolytic serum.

Учет реакции (контроль и опыт) проводили через 18 ч по скорости оседания эритроцитов (высота столба осевших эритроцитов), а также степени цитолиза.Accounting for the reaction (control and experiment) was carried out after 18 hours according to the erythrocyte sedimentation rate (the height of the column of settled erythrocytes), as well as the degree of cytolysis.

Индекс неспецифической реактивности определяли по формулеThe index of nonspecific reactivity was determined by the formula

ИНР = (А-В) : A + (C-D): С, где ПНР - индекс неспецифической реактивности;INR = (AB): A + (C-D): C, where PNR is the index of nonspecific reactivity;

Ά- высота столба осевших эритроцитов в опытном капилляре;Ά - the height of the column of settled erythrocytes in the experimental capillary;

В - высота столба осевших эритроцитов в контрольном капилляре;B - the height of the column of settled erythrocytes in the control capillary;

С - степень гемолиза в крестах в опытном капилляре;C - the degree of hemolysis in crosses in the test capillary;

D - степень гемолиза в крестах в контрольном капилляре.D - degree of hemolysis in crosses in the control capillary.

Результата-учета реакции по отдельным животным представлены в табл. 2.The results of accounting for the reaction for individual animals are presented in table. 2.

Как видно из приведенных данных в табл. 2, высота столба осевших эритроцитов в опытном и контрольном капиллярах у животных была различной. Наиболее существенная разница отмечена у животного № 4027 (7 мм в контроле и 67 мм в опыте), что соответствовало самому высокому индексу реактивности. У животного № 10С4 разница была менее существенной т.е. 1 мм, а ин деке неспецифической реактивности составил 0,07.As can be seen from the data presented in table. 2, the height of the column of settled erythrocytes in the experimental and control capillaries in animals was different. The most significant difference was noted in animal no. 4027 (7 mm in the control and 67 mm in the experiment), which corresponded to the highest reactivity index. In animal no. 10C4, the difference was less significant; 1 mm, and the index of nonspecific reactivity was 0.07.

При мерЗ. По изложенной методике была проведена оценка неспецифической реактивности 92 овцематок и рожденных ими 97 ягнятах. В результате исследований (табл. 3) установлено, что средние значения индекса неспецифической реактивности у овцематок были значительно выше, чем у ягнят.Example 3. According to the described methodology, the nonspecific reactivity of 92 ewes and 97 lambs born by them was assessed. As a result of studies (Table 3), it was found that the average values of the index of nonspecific reactivity in ewes were significantly higher than in lambs.

Как видно, различия между группами животных не только по средним величинам, но и характеру распределения величин статистически достоверны. Дисперсия показателя реактивности у ягнят была более выраженной, чем у маток. Коэффициент вариации индекса неспецифической реактивности у ягнят составил 98,6%, а у маток 65,1%.As you can see, the differences between groups of animals, not only in average values, but also in the nature of the distribution of values are statistically significant. The variance of the reactivity index in lambs was more pronounced than in queens. The coefficient of variation of the index of nonspecific reactivity in lambs was 98.6%, and in queens 65.1%.

При сопоставлении результатов реакции у овцематок и рожденных от них ягнят установлено, что у ягнят случаев гемолиза эритроцитов при добавлении гемолитической сыворотки не наблюдалось. У овцематок наоборот такие случаи регистрировались более чаще. Видимо это следует объяснить отсутствием комплемента в крови у новорожденных ягнят.When comparing the results of the reaction in ewes and lambs born from them, it was found that in lambs there were no cases of hemolysis of erythrocytes with the addition of hemolytic serum. On the contrary, in ewes, such cases were recorded more often. Apparently this should be explained by the lack of complement in the blood of newborn lambs.

Поскольку система комплемента играет важную роль в поддержании гомеостаза по казатели этой реакции отражают особенности реактивности организма.Since the complement system plays an important role in maintaining homeostasis, the indicators of this reaction reflect the characteristics of the body's reactivity.

Таким образом, предлагаемое средство при использовании его с целью определения неспецифической реактивности позволяет значительно расширить возможности практического применения, особенно при массовом обследовании поголовья.Thus, the proposed tool, when used to determine nonspecific reactivity, can significantly expand the possibilities of practical application, especially in a mass survey of livestock.

Использование известного диагностикума в качестве средства для определения неспецифической реактивности имеет пре15 имущества, так как он выпускается биологической промышленностью, стандартизирован и имеется в любой районной лаборатории.The use of a known diagnosticum as a means for determining nonspecific reactivity has the advantage of being produced by the biological industry, standardized and available in any district laboratory.

Поскольку гемолитическая сыворотка проявляетсвоедействие в присутствии комплемента, стало быть от реактивности комплемента, содержащегося в крови исследуемого животного, зависит проявление агглютинации и гемолиза, обусловлен25 ного действием антител. С другой стороны результаты реакции зависят также от специфики антигенов, адсорбированных на поверхности эритроцитов.Since hemolytic serum exhibits its effect in the presence of complement, the manifestation of agglutination and hemolysis caused by the action of antibodies depends on the reactivity of the complement contained in the blood of the animal under study. On the other hand, the results of the reaction also depend on the specificity of antigens adsorbed on the surface of erythrocytes.

Claims

30 Image f o rmule

The use of hemolysin as a means for determining the nonspecific reactivity of sheep.

Table 1

But- measures Inventory number of the animal The results of the reaction depending on the dilution of hemolysin in a saline medium

1/8 1/16 1/32 1/64 1/128

1 09661 + -H- + ++ 4- + -n-b -H- 4-

2 B / 35 ++++ ++++ + 4- + -

3 1294 4-4-H- + -H- + 4-H- ++ 4-

4 04033 4- + 4-4- 4-4-4-4- +++ ++ +

5 9586 +4 - + - I- ++++ ++ - -

6 2177 -H-H- -H - ++ 4-4-4- 4-4- 4-

7 4570 4- + 4- + -I - ++ 4- 4-4- - -

eight 07941 +++ 4-4- - - -

nine 02966 ++++ 4-4-H- -H - ++ ++ -

ten 2464 ++++ + -H- + 4-4- - -

eleven 4815 4 - +++ ++++ ++ - -

12 2257 + 4-H -I - ++ -1-I-4- 4-4- -n-

13 07276 + - (+ 4- ++++ 4-4- - -

fourteen 4593 +++ 4-4-4- + - -

15 07050 ++++ 4-4- 4-4-4- 4- -

16 1520 ++++ I -f-f-f- + 4 '+ + -

17 1644 4- ₊ 4_ ₊ 4 -4 -4- 4- -

eighteen 0706 +++ 4-4-4- 4- - -

19 1971 ++ - H- 4-4-4-4- 4-H- + 4-

[twenty 9981 +4 - ++ 4-4-4-4- 4-H- 4- -

table 2

Number Inventory number of the animal Column height of settled erythrocytes, mm Immunological reactivity index control AN EXPERIENCE

12 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 13 fourteen 15 16 17 1313 1004 4027 1177 4093 1535 7718 4502 4291 2514 2903 1799 9115 7340 4893 9645 7108 7 fourteen 7 5 ten 13 7 10 13 eleven 15 5 15 21 eight eighteen 5 ten 15 67 thirty 55 19 19 15 16 49 70 17 thirty 40 16 55 twenty 0.30 0.07 0.89 0.83 0.82 0.32 0.63 0.33 0.19 0.78 0.79 0.71 0.50 0.47 0.50 0.67 0.75

Table 3

Group of animals Number of animals Nonspecific reactivity index mean values M + frequency distribution,% less than the M value in the group more than M

Uterus 92 0.46 ± 0.03 38.90 61.10

Lambs 97 0.22 ± 0.02 61.50 38.50

Difference criterion td = 6.70 L = 1:54

Credibility P <0.001 P <0.05

Compiled by A. Dmitriev