CH624772A5 - - Google Patents

Description

La presente invenzione concerne un metodo per misurare il titolo antistreptolisionico in un campione di sangue umano, caratterizzato dal comprendere le operazioni di a) preparare una pluralità di soluzioni di diverse concentrazioni di O-Streptolisina ossidata,

b) preparare una soluzione di una sostanza riducente scelta dal gruppo costituito da tioli, metabisolfito sodico e solfito sodico,

c) diluire un campione di sangue con una opportuna soluzione non-emolitica,

d) introdurre un eguale volume di sangue diluito in ciascuna delle soluzioni definite sopra in a),

e) incubare la soluzione risultante da d) ad una temperatura compresa fra la temperatura ambiente (18°C-21°C) e 50°C per un periodo dell'ordine dei 15 minuti,

f) aggiungere alla soluzione incubata e) un volume determinato dalla soluzione b),

g) incubare la soluzione f) ad una temperatura compresa tra la temperatura ambiente e 50°C per un tempo che sia necessario e sufficiente a provocare la sedimentazione degli eritrociti, e h) notare i recipienti dei campioni in cui non si è avuta emolisi.

5 E' noto che la O-Streptolisina (O-S) è una tossina di natura proteica, secreta da certi streptococchi del gruppo A. Questa tossina è letale per gli animali da laboratorio, distrugge le colture cellulari, lisa i globuli rossi ed i globuli bianchi di molte specie animali.

io Alcuni ossidanti riescono ad inibire il potere litico di questa tossina. Le alterazioni subite dalla molecola interessano i gruppi solfidrilici-SH che si trasformano in gruppi disolfuro--S-S-. Se l'ossidazione è stata blanda la reazione è reversibile.

15 Infatti, aggiungendo un riducente, quale ad esempio il mercaptoetanolo, i gruppi -SH vengono ripristinati. Le due reazioni sono indicate in fig. 1, dove la O-Streptolisina (O-S) è indicata da una figura geometrica 1 con rigatura verticale.

L'emolisi dei globuli rossi incubati con la tossina a 37°C 20 avviene solo se la O-S si trova nella sua forma ridotta, cioè con i gruppi -SH, non potendo la tossina ossidata interagire mediante i gruppi -S-S- con la membrana citoplasmatica dei globuli rossi. Il recettore di membrana è stato identificato come colesterolo. Nelle figg. 2 e 3 è graficamente schema-25 tizzato il fenomeno, con 3 essendo indicata la membrana citoplasmatica quadrettata, e con 5 il colesterolo recettore di membrana, tratteggiato. Solo le molecole di O-S legate ai recettori di membrana (vedi fig. 2) interagiscono fra loro come indicato in fig. 3, disponendosi in forma di canali o fori 30 circolari; l'emoglobina 7, indicata punteggiata in fig. 3, fuoriesce attraverso questi fori oppure attraverso altre aree dove i lipidi hanno subito una disorganizzazione per la perdita di colesterolo.

Se la O-S viene lasciata incubare con i globuli rossi a 35 +4°C, a questa temperatura avviene l'attacco della O-S al colesterolo dei globuli rossi ma non la lisi, in quanto l'interazione tra le molecole della tossina è dipendente dalla temperatura; portando il sistema a 37°C si ha emolisi. Se si aggiungono anticorpi anti O-S (anti O-Streptolisinici) al sistemo ma a 4°C e poi si innalza la temperatura a 37°C, non si verifica emolisi. La spiegazione è la seguente: i gruppi funzionali della O-S proposti ad interagire fra loro sono stati bloccati dagli anticorpi. Il fenomeno è schematizzato in fig. 4, dove gli anticorpi anti O-S sono indicati da campi 9. 45 Se si lascia incubare la O-S ossidata con i globuli rossi a 37°C, non si ha emolisi: infatti la O-S ossidata non può attaccarsi ai recettori di membrana 5 (vedere fig. 2). Se si aggiungono anticorpi anti O-S, 9, questi ultimi si legano alla O-S ossidata e si raggiunge la condizione di fig. 5. 50 Aggiungendo ora al sistema un riducente, si ripristinano i gruppi sulfidrilici-SH, ma non si ha emolisi, perché i gruppi funzionali della O-S, depurati a interagire fra loro, sono stati bloccati dagli anticorpi 9 (vedere fig. 4).

Come bibliografia relativa a quanto sopra sommariamente riferita può essere indicata la seguente:

1. Howard J. G., Wallace K. R.: Brit. J. Exp. Path. 34, 181, 1953;

2. Rantz L. A., Randall R.: Proc. Sec. Exp. Biol. Med. 60 (N. Y.) 59, 22, 1945.

3. Alen J. E. Reynaud H.: Ann. Inat. Pasteur, 114, 1968.

E' stato da tempo suggerito un sistema diagnostico per la valutazione dell'entità della presenza di anticorpi anti O-Streptolisinici.

65 In commercio esiste in particolare un diagnostico che permette di dosare gli anticorpi antistrepto-lisinici nel siero dei pazienti, il quale richiede i seguenti materiali per la reazione:

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— il siero in esame, limpido ed inattivato a 56°C X 30 minuti;

— la soluzione fisiologica tamponata al pH 6,5;

— la sospensione di globuli rossi di coniglio al 5 % ;

— la O-S ridotta perfettamente titolata allo stato liofilo.

Vengono posti ad incubare per 15 minuti a 37°C diluizioni scalari del siero in esame, con una quantità costante di O-S. Se sono presenti anticorpi in questa fase avviene l'attacco degli anticorpi alla O-S, neutralizzando così l'attività emolitica della O-S stessa. Al termine si aggiungono globuli rossi al 5% in soluzione tamponata, si agita e si lascia incubare a 37°C per 45 minuti; si centrifuga a 2000 giri al minuto ed i supernatanti vengono letti. Il titolo anticorporale del siero è dato dal reciproco della più alta diluizione di siero che blocca l'attività emolitica della O-S.

Questo metodo, che sostanzialmente consiste nel determinare l'emolisi dei globuli rossi aggiunti al sistema da parte di un eventuale eccesso di O-Streptolisina, che è stata fatta precedentemente reagire con un campione di siero scomple-mentato, prelevato da un paziente, presenta fra l'altro i seguenti svantaggi:

1) occorre siero fresco scomplementato a 56°C per 30 minuti (il che implica: prelievo iniziale di sangue del paziente; stazionamento a temperatura ambiente per due ore; separazione del coagulo dal siero e sua centrifugazione; inattivazione del complemento sierico a 56°C per 30 minuti);

2) è necessario avere globuli rossi umani (gruppo

0 Rh +) o di coniglio; lavati e diluiti al 5% (con conseguente laboriosità delle operazioni di lavaggio);

3) è laboriosa la tecnica (in specie la diluizione del siero, l'aggiunta di O-Streptolisina e di globuli rossi al siero diluito);

4) per la titolazione occorre un certo quantitativo di pipette e di provette ben lavate.

Il metodo come definito nella rivendicazione 1 sfrutta

1 seguenti due noti principi:

— che la O-S ossidata è incapace di legarsi ai globuli rossi (fig. 2), ma interagisce con gli anticorpi specifici (fig. 5); e

— che la O-S ossidata dopo la riduzione riacquista il suo potere emolitico (fig. 3).

Secondo una forma di esecuzione preferita si esegue la reazione usando il sangue in toto del paziente e sfruttando i globuli rossi in esso presenti come rivelatori. La O-S viene fornita ossidata e quindi incapace di legarsi ai globuli rossi. Quando la O-S ossidata viene posta a contatto con il sangue del paziente, se sono presenti anticorpi anti O-S avviene la reazione di neutralizzazione della O-S senza attacco alla membrana. Successivamente viene introdotto un riducente capace di ridurre appunto i solfidrili ossidati (-S-S-) della tossina e ripristinare i sulfidrili -SH, così da rendere questi ultimi capaci di fissarsi ai globuli rossi. A questo punto si possono avere due distinti casi:

A) La O-S non è legata agli anticorpi per l'assenza di questi ultimi, in questo caso la O-Streptolisina, una volta ridotta, è capace di fissarsi sui globuli rossi, formare catene intermolecolari fra le sue molecole e disorganizzare la membrana cellulare degli eritrociti dando luogo ad emolisi, il che è agevolmente rilevabile.

B) La O-S è legata agli anticorpi contenuti nel sangue (o nel siero) in esame: in questo caso la successiva riduzione potrà eventualmente permettere alla O-S di attaccarsi con i siti sulfidrilici liberi alla membrana cellulare degli eritrociti, ma non potrà formare catene intermolecolari che non disorganizzeranno la membrana stessa, non riuscendo così a provocare emolisi.

Un aspetto particolare dell'invenzione è un'attrezzatura per l'esecuzione del metodo secondo la rivendicazione 1, che è caratterizzata dal fatto di comprendere:

in più contenitori un prodotto base costituito da O-Streptolisina ossidata, in concentrazioni precostituite, in un contenitore un riducente per il ripristino delle capacità emolitiche della O-Streptolisina con i gruppi solfidrilici -SH, ed, s in un contenitore, un diluente per il sangue del paziente.

In maggior dettaglio, l'attrezzatura comporta più contenitori di O-Streptolisina ossidata, dosati per ottenere, con solvente e/o con campioni uniformi di sangue, diluizioni in serie scalare, per campioni di sangue diluito di volume co-io stante.

I vantaggi del metodo come definito nella rivendicazione 1 nei confronti del metodo classico, attualmente in uso, sono in primo luogo i seguenti:

15 1) La semplificazione della tecnica, non essendo più necessario separare il siero dal sangue e procedere alla scompletazione del siero stesso ed ottenendo una sostanziale riduzione della manualità e dei tempi di analisi;

2) L'eliminazione dei globuli rossi, la cui preparazione 20 è una notevole limitazione alla tecnica, a causa delle difficoltà di reperire il materiale e di conservarlo, e della laboriosità della sua preparazione;

3) La riduzione dei tempi e dei costi nella esecuzione del test, in conseguenza del diminuito numero di operazioni

25 e della possibilità di impiegare personale non specializzato, grazie all'estrema semplicità del metodo, ed infine,

4) La possibilità di utilizzare per l'esame piccoli campioni di sangue, cosa che facilita il prelievo nei casi in cui questo è reso difficile da particolari condizioni del paziente.

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I materiali di partenza per la determinazione del titolo antistreptolisinico sono i seguenti:

— sangue in toto del paziente;

— soluzione diluente per il sangue;

35 — O-Streptolisina ossidata, distribuita in contenitori (provette a differenti concentrazioni note;

— soluzione di riducente ad esempio: tra i riducenti organici, i tioli, quali mercaptoetanolo, di-tiotreitolo, cisteina, N-acetil-cisteina; fra i riducenti inorganici, ad esempio meta-

40 bisolfito di sodio, solfito di sodio.

Effettuato il prelievo di sangue dal paziente (per la piccola quantità richiesta, lo si può prelevare anche dalle dita degli arti superiori o dal lobo dell'orecchio), si effettua una opportuna diluizione iniziale con adatta soluzione diluente, 45 disponendone poi una piccola quantità (ad esempio 0,2 mi) per ogni contenitore ad una serie di contenitori in cui già si trova la O-Streptolisina liofila ossidata in quantità determinante.

Dopo un breve periodo di incubazione, ad esempio 15 mi-50 nuti, a temperatura variabile fra l'ambiente e 50°C si aggiunge un volume determinato del riducente e si lascia incubare a temperatura ambiente e fino a 50°C per il tempo necessario alla sedimentazione dei globuli rossi (ad esempio 1-2 ore).

Al termine si leggono per trasparenza visiva i surnatanti 55 emolizzati o no: si notano in sostanza i contenitori in cui si ha emolisi. Il titolo di anticorpi nel campione in esame, espresso in U.A.S./ml, è dato dall'ultimo contenitore nel quale non si verifica emolisi eritrocitaria.

Si puntualizzano qui di seguito per confronto fra i due 60 metodi gli svantaggi del metodo classico ed i vantaggi del metodo come definito dalla rivendicazione 1.

1. Svantaggi del metodo classico

1.1. Occorre siero fresco scomplementato a 56°C per 30'. 65 (Prelievo iniziale di sangue dal paziente.

Stazionamento a temperatura ambiente per 2 h. Separazione del coagulo del siero o sua centrifugazione. Inattivazione del complemento sierico a 56°C per 30').

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1.2. Vanno effettuate varie diluizioni del siero che devono essere distribuite in contenitori con aggiunta di quantità costante di O-Streptolisina.

1.3. Necessità di avere dei globuli rossi umani (gruppo O Rh +) o di coniglio, lavati o diluiti al 5% (con la conseguente laboriosità delle operazioni di lavaggio).

1.4. Operosità della tecnica. (Aggiunta di O-Streptolisina e di globuli rossi al siero diluito).

1.5. Per effettuare la titolazione classica, occorre un certo quantitativo di pipette e di provette ben lavate.

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2. Vantaggi del metodo come definito dalla rivendicazione 1.

2.1. Non occorre separare il siero, ma la reazione può essere eseguita con il sangue «in toto», il quale necessitando in piccola quantità può essere prelevato anche dal lobo dell'orecchio o da un dito degli arti superiori.

2.2. Si esegue un'unica diluizione del sangue prelevato e se ne distribuisce un volume determinato e costante in ciascun contenitore (fornito dal produttore e pronto per l'uso) contenente una appropriata quantità di tossina differente ed s esattamente dosata dal produttore. Non necessitano perciò le laboriose diluizioni e conseguenti distribuzioni del siero secondo il metodo classico.

2.3. Non occorre l'aggiunta di globuli rossi di coniglio ed umani, con conseguente eliminazione dei lavaggi, poiché

io vengono sfruttati, nella reazione, direttamente gli eritrociti contenuti nel sangue del paziente.

2.4. Le manipolazioni per eseguire il titolo anti O-Strep-tolisinico sono ridotte al minimo.

2.5. Per la metodica non occorre attrezzatura di labora-

15 torio, in quanto ciò che necessita nella reazione può essere contenuto — per costo e per ingombro — già nella confezione fornita dal produttore.

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1 foglio disegni

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1. Metodo per misurare il titolo antistreptolisionico in un campione di sangue umano, caratterizzato dal comprendere le operazioni di a) preparare una pluralità di soluzioni di diverse concentrazioni di O-Streptolisina ossidata,

b) preparare una soluzione di una sostanza riducente scelta dal gruppo costituito da tioli, metabisolfito sodico e solfito sodico,

c) diluire un campione di sangue con una opportuna soluzione non-emolitica,

d) introdurre un eguale volume di sangue diluito in ciascuna delle soluzioni definite sopra in a),

e) incubare la soluzione risultante da d) ad una temperatura compresa fra la temperatura ambiente (18°C-21°C) e 50°C per un periodo dell'ordine dei 15 minuti,

f) aggiungere alla soluzione incubata e) un volume determinato della soluzione b),

g) incubare la soluzione f) ad una temperatura compresa tra la temperatura ambiente e 50°C per un tempo che sia necessario e sufficiente a provocare la sedimentazione degli eritrociti, e h) notare i recipienti dei campioni in cui non si è avuta emolisi.

2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la sostanza riducente è scelta nel gruppo costituito da: mercaptoetanolo, ditiotreitolo, cisterna, N-acetil--cisteina, metabisolfito di sodio, solfito di sodio.

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RIVENDICAZIONI

3. Attrezzatura atta all'esecuzione del metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto di comprendere: in più contenitori un prodotto base costituito da O-Strepto-lisina ossidata, in concentrazioni precostituite, in un contenitore un riducente per il ripristino delle capacità emolitiche della O-Streptolisina con i gruppi solfidrilici -SH, ed, in un contenitore, un diluente per il sangue del paziente.

4. Attrezzatura secondo la rivendicazione 3, caratterizzata dal fatto di comportare più contenitori di O-Streptolisi-na ossidata, dosati per ottenere, con solvente c) della rivendicazione 1 o con campioni uniformi di sangue, diluizioni in serie scalare, per campioni di sangue diluiti di volume costante.

5. Attrezzatura secondo la rivendicazione 3, caratterizzata dal fatto che il contenitore-riducente contiene composti del gruppo costituito da: mercaptoetanolo, ditiotreitolo, cisteina, N-acetil-cisteina, metabisolfito di sodio, solfito di sodio.