DK145276B - Fremgangsmaade til bestemmelse af antistreptolycinmaengden i enproeve af menneskeblod - Google Patents

Description

Ζβ{ρ

(19) DANMARK

|j| M2) FREMLÆGGELSESSKRIFT ου 145276 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 5773/76 (51) Int-CI* G 01 N 33/54 (22) Indleveringsdag 21. dec. 1976 (24) Løbedag 21. dec. 1976 (41) Aim. tilgængelig 23· jun. 1977 (44) Fremlagt 18. okt. 1982 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag - (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 22. dec. 1975* 966Ο/75, IT

(71) Ansøger ISTITUTO SIEROTERAPICO E VACCINOGENO TOS G AEO "SCLAVO" S.P.A., Siena, IT.

(72) Opfinder Antonio Ricel, IT.

(74) Fuldmægtig Internationalt Patent-Bureau.

(54) Fremgangsmåde til bestemmelse af antistreptolycinmængden i en prøve af menneskeblod.

O-Streptolycin (O-S) er et toxin af proteinagtig natur, der udsondres af visse Streptococci fra A-gruppen. Dette toxin er dødeligt for forsøgsdyr, ødelægger cellekulturer og nedbryder de røde og hvide blodlegemer hos mange dyrearter.

Nogle få oxidanter har held til at hæmme den nedbrydende virkning af dette toxin. De ændringer, som molekylerne undergår, involverer sulfhydrylgrupperne -SH, fl der omdannes til disulfidgrupper -S-S-. Ved at tilsætte et reducerende stof, sl- 0 som mercaptoethanol, bliver grupperne -SH gendannet. De to reaktioner er vist i

Hk.

Fig. 1 på tegningen, hvor O-streptolysin (0-S) er angivet ved en geometrisk figur 7) 1 med en vertikal skravering.

* ... o — Hæmolyse af de røde blodlegemer finder, ved inkubermg med toxinet ved 37 C, kun sted, hvis 0-S foreligger i sin reducerede form, dvs. med grupperne -SH, da J det oxiderede toxin ikke med grupperne -S-S- kan samvirke med de røde blodlege mers cytoplasmamembran. Membran-receptoren er identificeret som cholesterol.

2 145276

Fig. 2 og 3 viser skematisk fænomenet, idet 3 angiver cytoplasmamem- branen i kryds-tværs-skravering, mens 5, med almindelige streglinier, angiver membran-receptoren cholesterol. Kun de molekyler 0-S, der er bundet til membran-receptorerne (se Fig. 2), reagerer med hinanden som angivet i Fig. 3 og anbringer sig i form af rør eller ringe. Hæmoglobin 7j angivet med prikker i Fig. 3, passerer gennem disse ringe eller gennem andre arealer, hvor lipiderne er undergået en desorganisering på grund af cholesterol-tabet.

Hvis 0-S inkuberes med de røde blodlegemer ved +4°C, konstateres ved denne temperatur angrebet fra 0-S på de røde blodlegemers cholesterol, men der forekommer ingen nedbrydning, da den gensidige indvirkning mellem toxinmolekylerne er en funktion af temperaturen. Hæmolyse forekommer, nar systemet bringes til 37°C. Hvis anti-O-S(antistreptolysin)-antistoffer sættes til systemet ved +4°C, og temperaturen derefter hæves til 37°C, iagttages ingen hæmolyse. Forklaringen er følgende:

De funktionelle grupper af 0-S, der skulle fungere indbyrdes, er blevet blokeret af antistofferne. Fænomenet er vist skematisk i Fig. 4, hvor anti-O-S-antistofferne er vist ved områder 9.

Hvis oxideret 0-S inkuberes med røde blodlegemer ved 37°C,forekommer ingen hæmolyse. Oxideret 0-S kan ikke hæfte til membran-receptorerne 5 (se Fig. 2).

Hvis anti-O-S-antistoffer 9 tilsættes, bliver disse bundet til oxideret 0-S, og der opnås betingelserne vist i Fig. 5·

Ved nu at tilsætte et reducerende stof til systemet gendannes sulfhydryl-grupperne -SH, men der finder ingen hæmolyse sted, da de funktionelle grupper af 0-S, der skulle virke indbyrdes, er blevet blokeret af antistofferne 9 (se Fig.U).

Vedrørende det ovenfor forklarede kan henvises til følgende videnskabelige artikler.

1) J.F.Howard, M.H.Wallace: Brit.J.Exp.Path.3l·, l8l (1953), 2) L.A.Rants, R.Randall: Proc.Sec.Exp.Biol.Med.(N.Y.)5£, 22 (19^5), 3) J.E.Alan, M.Raymond: Ann. Inst .Pasteur „UA. (1968).

En diagnostisk metode er forlængst foreslået til vurdering af den størrelsesorden, hvori O-antistreptolysin-antistoffer er til stede.

Der findes navnlig et diagnostisk middel, der gør det muligt at måle antistreptolysin-antistoffeme i patienters blodserum, hvilket middel omfatter følgende reaktionsmaterialer: - Den serum, der skal undersøges, klar og inaktiveret ved 56°C i 30 minutter.

- Fysiologiske opløsning, pufret ved et pH på 6,5.

- %'s Suspension af røde blodlegemer fra kanin.

- Reduceret Q-S, der er titreret fuldstændigt i den lyofile tilstand.

Progressivt stigende fortyndinger af det serum, der skal undersøges, inkuberes ved 37°C i 15 minutter med en konstant mængde 0-S. Hvis antistoffer er til 3 145276 stede, finder angrebet af antistofferne på 0-S sted på dette trin, således at den hæmolytiske aktivitet af 0-S bliver neutraliseret. Ved afslutningen af denne operation tilsættes 5# røde blodlegemer ίpufret opløsning, der omrøres og inkuberes ved 37°C i ^5 minutter, hvorefter der centrifugeres ved 2.000 o.p.m., og de overliggende materialer aflæses. Antistof-indholdet i serum"et angives ved den reciproke værdi af den højeste serumfortynding, der hindrer hæmolyse-virkningen af 0-S.

Denne metode, der i det væsentlige består i at bestemme hæmolysen af de røde blodlegemers der er sat til systemet, fra et eventuelt overskud af O-streptoly-sin, der forud er omsat med en prøve blodserum befriet for komplementære elementer og taget fra en patient, har blandt andet de følgende ulemper: 1) Der kræves frisk serum, befriet for komplementære elementer ved 56°C i 30 minutter. (Dette krav indebærer indledningsvis udtagning af patientblod, henstand af dette ved stuetemperatur i 2 timer, udskillelse af koagulum fra serummet og dets centrifugering, og inaktivering af serum-komplementet ved 56°C i 30 minutter).

2) Der skal fremstilles en række fortyndinger med tilsætning af en konstant mængde 0-streptolysin til beholderne.

3) Det er nødvendigt at have røde blodlegemer fra mennesker til rådighed (0 Rh + gruppe) eller kaninceller, vasket og fortyndet til 5% (med besværlige vaskeoperationer) .

4) Teknikken er besværlig (navnlig fortyndingen af serum’et, tilsætningen af 0-streptolysin og røde blodlegemer til det fortyndede serum).

5) Et vist antal af grundigt vaskede pipetter og reagensglas kræves til titreringen.

Formålet for opfindelsen er at angive en fremgangsmåde, ved hvilken anti-streptolysinmængden i en prøve af menneskeblod kan bestemmes nøjagtigt på simple-re måde.

Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er ejendommelig ved, at a) der fremstilles flere opløsninger med forskellige koncentrationer af oxideret 0-streptolysin, b) der fremstilles en opløsning af et reducerende stof valgt fra gruppen bestående af thioler, natriummetabisulfit og natriumsulfit, c) en blodprøve fortyndes med en ikke-hæmolytisk opløsning, d) der indføres samme volumen fortyndet blod i hver af opløsningerne fremstillet ifølge a) ovenfor, e) opløsningerne fremstillet ifølge d) inkuberes ved en temperatur fra 18°C til 50°C i ca. 15 minutter, 145276 4 f) der sættes til de inkuberede opløsninger fra e) et afmålt volumen af opløsningen fremstillet ifølge b), g) de ifølge f) fremstillede opløsninger inkuberes ved en temperatur fra 18°C til 50°C i et tidsrum, der er nødvendigt for sedimentation af de røde blodlegemer, og b) der noteres de prøvebeholdere, hvori der ikke har fundet hæmolyse sted.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen gøres således brug af de to kendte principper, - at det oxiderede 0-S er ude af stand til at bindes til de røde blodlegemer (Fig. 2), men samvirker med de specifikke antistoffer (Fig. 5), og - at oxideret CHS efter reduktion atter erhverver sin hæmolytiske evne (fig· 3).

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen gennemføres reaktionen ved anvendelse af patientfuldblod og ved at udnytte de røde blodlegemer, der er til stede deri, som detektorer. 0-S tilføres oxideret og således ude af stapd til at blive bundet til de røde blodlegemer. Når det oxiderede 0-S bringes i kontakt med patientens blod, vil, hvis anti-O-S-antistoffer er til stede, neutralisation af 0-S finde sted uden angreb på membranen. Derefter indføres et reducerende stof, der er i stand til at reducere netop de oxiderede sulfhydryler (-S-S-) af toxinet og gendanne sulfhydryleme -SH, således at sidstnævnte bringes i stand til at blive fik-seret til de røde blodlegemer. På dette trin kan der foreligge to forskellige tilfælde : A) 0-S hindes ikke til antistoffer på grund af fravær af disse. I så fald er 0-sfreptolysinet, når det først er reduceret, i stand til at blive fikseret til de røde blodlegemer og deorganisere membranen af de røde blodlegemer og danne intermolekylære kæder, hvilket giver anledning til hæmolyse, der let iagttages.

B) 0-S bindes til antistoffer indeholdt i blodet (eller serum), der undersøges.

I så fald kunne den påfølgende reduktion eventuelt gøre det muligt for 0-S at blive bundet til de frie sulfhydryl-stillinger i cellemembranen af de røde blodlegemer, men der vil ikke kunne dannes intermolekylære kæder, og membranen af de røde blodlegemer bliver ikke deorganiseret, og der finder ingen hæmolyse sted. ;

Fordelene ved den omhandlede fremgangsmåde sammenlignet med den klassiske metode er indlysende, og de væsentligste er samlet i det følgende: 1) Simplificering af teknikken, da det ikke længere er nødvendigt at adskille serum fra blod eller at befri blodserujn'et for ledsagende bestanddele, hvilket betyder en væsentlig reduktion af de operationer og den tid, der kræves for analysen, 2) Fritagelse for de røde blodlegemer, hvis fremstilling er en væsentlig ulempe på grund af vanskeligheden ved at fremskaffe materialet og lagre det og vanskeligheden ved dets oparbejdning.

Claims (3)

145276 5

3. Reduktion af både tid og omkostninger ved prøvemetoden som følge af det mindre antal operationer og muligheden for at anvende utrænet personale grundet den store simpelhed ved metoden.

4. Muligheden for til prøven at anvende meget små blodprøver, hvilket letter prøveudtagning i de tilfælde, hvor der kan opstå vanskeligheder som følge af patientens tilstand. Udgangsmaterialerne til bestemmelsen af antistreptolysinmængden er følgende: - patientfuldblod, - fortyndende opløsning for blodet, - oxideret O-streptolysin, fordelt i beholdere (reagensglas) i forskellige kendte koncentrationer, - opløsning af reducerende stof, såsom, blandt organiske reducerende stoffer, thioler, f.eks. mercaptoethanol, dithiotreitol, cystein eller N-acetyl-cystein, og, blandt de uorganiske reducerende stoffer, for eksempel natriummetabisulfit eller natriumsulfit, De fornødne stoffer kan med fordel i afmålte mængder emballeres i enkelte beholdere og bringes i handelen i form af en analysepakke indeholdende alle de nødvendige bestanddele. Efter at blodprøven er taget på patienten (på grund af den lille mængde, der kræves, kan blodet udtages også fra fingerspidsen eller øreflippen), foretages en passende fortynding med en egnet fortyndingsopløsning, hvorefter små mængder (såsom 0,2 ml) anbringes i hver beholder fra et sæt beholdere, hvori lyofili-seret oxideret O-streptolysin allerede er til stede i fastlagt mængde. Efter en kort inkubationsperiode, for eksempel 15 minutter ved en temperatur fra stuetemperatur til 50°C, tilsættes et fastlagt volumen af det reducerende stof, og inkubering fortsættes ved fra stuetemperatur op til 50°C i det tidsrum, der er nødvendigt for sedimentation af de røde blodlegemer (f.eks. 1-2 timer). Efter endt sedimentation aflæses transparensen for de hæmolyserede og ikke-hæmolyserede overliggende materialer, dvs. der noteres de beholdere, hvori der ikke er sket hæmolyse. Antistofmængden i de undersøgte prøver, udtrykt ved anti-streptolysinenheder pr.ml, angives af den sidste beholder, hvori der ikke har fundet hæmolyse sted af de røde blodlegemer. Fremgangsmåde til bestemmelse af antistreptolysinmængden i en prøve af menneskeblod, kendetegnet ved, at a) der fremstilles flere opløsninger med forskellige koncentrationer af oxideret O-streptolysin,