JPS61126467A - 肉の判定システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 、本発明は改良した分析方法及び装置、特に試料中の汚
染物を検出し且つ同定するだめの方法に関するものであ
る。

外来の種及び物質による汚染に対する試料の試験は食品
工業に対して進行しつつある問題である。

九とえば、オーストラリアの牛肉輸出における羊肉、馬
肉及びカンガル−肉による代替は肉工業における問題で
ある。同様に、山羊孔に代わる牛乳の代替は、製品工業
に対する問題である。

従来、大部分の外来種の監視はオーチターロニ−（Ｏｗ
ｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散方法によって行なわれて
いる。この方法は試験目的には適しているが、大きな欠
点をも有している。第一に、免疫拡散方式の試験は約１
０％の汚染を検出することが可能である。それよりも低
い水準の汚染は検出がきわめて困難である。その上、オ
ーチターロニー試験は終夜の試料の展開を必要とし且つ
大量の特異的抗血清を使用する。これはｌ試験当りの比
較的高い費用をみちびき且つ試験手順の自動化の不可能
性をも伴なう。

ロケット免疫電気分解法（ｉＥＰ）、赤血球凝集抑制法
（ＨＡＩＬ、等電集束法（ｉＥＦ）及び標識免疫検定法
（ＲＩＡ）を含む従来からの他の方法は、すべて日常的
な種の監視のためには、禁止的に費用がかかり且つ複維
である。

かくして、本発明の目的は、従来の方法に関連する難点
の一つまたはそれ以上を克服するか又は少なくとも軽減
することにある。

かくして、本発明の第一の局面においてはｉｎ　　第一
のくぼみ慕及び （ｂ）　　第二のくぼみの列 を含む容器を包含する酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳ
Ａ）装置を提供する。

くぼみの第一の列（ａ）は （１）　　対照を形成するように適合した少なくとも一
つのくぼみ、及び （ｉｉ）第一の特異的抗原、抗体または類似物質で被覆
した少なくとも一つのくぼみ を包含することができ菖 くぼみの第二の列（ｂ）は （１）対照を形成するように適合した少なくとも一つの
くぼみ、及び （ｉＩ）第二の特異的抗原、抗体または類似物質で被覆
した少なくとも一つのくぼみ を包含することができる。

本発明による酵素結合した免疫吸着分析はオーチターロ
ニー試験に対する１６時間と比較して迅速に、一般には
２〜３時間で遂行することができる。その上、ＥＬＩＳ
Ａ試験は実質的に増大した感度を提供する。増大した感
度は、−好適局面においては、予備スクリーニングの目
的に対して５試料に至るまでのまとめを可能とする。次
いでまとめの試験（ｂｕｌｋ　ｔｅｓｔ）がプラスの結
果を与えた場合にのみ個々の試験を試験する必要がある
にすぎない。

本発明による容器（１）は、ミクロタイター（ｍｔｃｒ
Ｏ−一　〇　− ｔｉｔｒａ）とすることができる。

本発明によるミクロタイター板は、″ＵＩ＋字形の底を
持つ種類のものとすることができる。ミクロタイター板
はポリスチレン名は類似の材料で製造することができる
。

好適形態においては、本発明における容器は（ｂ）　　
少なくとも１列の他のくぼみの列を包含し、この列は （１）対照を形成するように適合した少なくとも一つの
くはみ、及び （ｉｉ）さらに他の特異的抗原、抗体または類似物質で
被覆した少なくとも一つのくぼみを包含する。

くぼみの各列は、水平の列又は垂直の行として配置する
ことができる。くぼみの各列は望ましいだけ多くのくば
みを包含することができる。好適実施態様においては、
各列は約８〜１２のくぼみを包含することができるけれ
ども、最低数は２である。

本発明によるミクロタイター板は、望ましいだ−　１　
〇　− けの数のくぼみの列を有することができる。好適局面に
おいては、ミクロタイター板は複式試験用として配列さ
せることができ、そのためには単一の板上に任意の多数
のくぼみの列を存在させるこ゛とができる。

かくして、本発明の好適局面においては、１）　上記の
種類の第一の容器、及び ２）　それに隣接する少なくとも１つの他の容器 を包含するＥＬＩＳＡ装置を提供する。

容器はミクロタイター板の形態をとることができる。

ミクロタイター板１及び２は一体的に形成せしめること
ができる。各ミクロタイター板は、その隣接する板から
何らかの適当な方式で分離することができる。かくして
、本発明によるＥＬ　Ｉ　ＳＡ装置は、さらに ３）　隣接する容器間の第一の分離部材を包含すること
ができる。

第一の分離部材（３）は隣接する板間の盛り上げた部分
から成ることができる。第一の分離部材は隣接する板の
間のくぼませた部分から成ることもできる。

別の局面においては、本発明によるＥＬＩＳＡ装置は ４）　少なくとも一つの被覆したくぼみと対照のくぼみ
の間の第二の分離部材 を包含することができる。

第二の分離部材は第一の分離部材と類似のものとするこ
とができる。しかしながら、第二の分離部材は該第−の
分離部材に対して直角的に走っている。

前記のように、くぼみの第一の列は １）　第一の特異的抗原、抗体または類似物質は試料を
認識し目、つそれに結合するものから選ぶことができる
。抗原、抗体又は類似物質は、試料中の血清成分、試料
中に含有される非血清血液成分、筋肉成分などを認識し
且つそれと結合するように選択することができる。

抗原、抗体又は類似物質は動物を血清によってヤギ又は
チキンから選ぶことができる。、あるいはまた、抗体は
合成的な手暗によって製造することができる。モノクロ
ナル／抗体方法を用いることができる。たとえば、特異
的抗−ヒッジ試薬はフロインドアジユバントの複合エマ
ルジョン中の約２０１１Ｉｔの全ヒツジ血清でヤギを免
疫にすることによって調製することができる。

特異的抗一種試薬は親和性クロマトグラフィ一方法を用
いて精製することができる。交差反応が生じる場合には
、交差反応種の別の親和性カラム上の吸着によって、い
っそうの精製を達成することができる。

抗−イディオタイプの抗体を製造する場合には、それら
は適当な親和性抽出抗体を、その抗体の調製に対して用
いたものと同種の血清親和性カラム中に通じることによ
って、取り出すことができる。

たとえばヤギー抗ヒツジはヤギ血清親和性カラム中に通
じなければならない。

試験すべき試料は蛋白質含有材料から選択することがで
きる。試料は肉、乳又はそれらの製品とすることができ
る。

試験すべき試料の好適局面は肉の試料とすることができ
る。抗原、抗体又は類似の材料は牛肉、羊肉及びそれら
の代替物を認識するように選ぶことができる。好適形態
においては、本発明によるミクロタイター板は８種の特
異的抗原、抗体又は類似物質で被覆した８列のくぼみを
包含することができる。８種の特異的抗原、抗体又は類
似物質は８種の特異的抗血清から選ぶととができる。抗
血清は肉牛／アメリカ野牛−特異的抗血清、ヒツジ−特
異的抗血清、ブタ−特異的抗血清、アメリカ野牛−特異
的抗血清、ヤギ−特異的抗血清及び四バー特異的抗血清
を包含することができる。

場合によっては、たとえばラクダまたはその他のような
、別のあるいは追加の代替物用に装置を準備することが
できる。

別の実施形態においては、簡単化した配列は６種の特異
的抗原、抗体又は類似材料によって被覆した６列のくぼ
みを包含することができる。６種の特異的抗血清は肉牛
／’ｔアメリカ野牛特異的抗血清、ヒツジ／ヤギ−特異
的抗血清、ブタ−特異的抗血清、ウマ／ロバ−特異的抗
血清、カンガル−特異的抗血清及びアメリカ野牛−特異
的抗血清とすることができる。

本発明の別の実施形態においては、試験すべき試料は異
なる蛋白質を含有する材料とすることができる。試料は
乳又は乳製品とすることができる。

一形態においては、試験すべき試料は牛乳を混入したヤ
ギ乳とすることができる。この形態においては、第一及
び第二の特異的抗原、抗体又は類似物質で被覆した２列
のみのくぼみを必要とするにすぎない。第一の種−特異
的抗原、抗体又は類似物質は乳牛−特異的抗血清とする
ことができる。

第二の種−特異的抗原、抗体又は類似物質はヤギ−特異
的抗血清とすることができる。特に好適なものはヒツジ
−杭孔牛抗血清及びヒツジ抗−ヤギ抗血清である。

前記のように、本発明によるＥＬＩＳＡ装置はα（１）
対照を形成するように処理した第一の列中の少なくとも
一つのくぼみ及び （Ｌ　（ｉｉ）　　対照を形成するように処理した第二
の列中の少なくとも一つのくぼみを包含する。Ｅ　Ｌ　
Ｉ　ＳＡ試験装置が２列よりも多いくぼみの列を包含す
るときは、くぼみの各列は対照を形成するように処理し
た少なくとも一つのくぼみを包含することができる。

好適実施形態においては本発明によるＥＬＩＳＡ装置は
（（Ｚ）陽性の対照を形成するように処理した各列中の
一つのくぼみ（ｂ）陰性の対照を形成するように処理し
た各列中の一つのくぼみを包含することができる。

便宜のために、陽性及び陰性の対照は各列中の最後の二
つのくぼみから成るものとすることができる。

陽性対照のくぼみ（ａ）は特異的抗原、抗体又は類似物
質の第一の被覆及び特異的酵素−結合した抗体試薬の第
二の被覆を包含することができる。

酵素結合した抗体試薬は未希釈標準の約４０〜５０チの
光学密度を与えるように希釈することができる。前記の
ように、この溶液は１％の種の含量にほぼ等しい色を生
じる反応を提供する。

陰性の対照（ｂ）のくぼみは特異的抗体、抗原又は類似
物質の第一の被覆を包含することができる。

陰性の対照は系を適切に使用するならば呈色試薬に対し
て陰性の結果を提供しなければ々らない。

本発明のさらに他の局面においては α）　試料を準備し、 ｂ）　前記の種類の容器を準備し、 Ｃ）　試料を第一の列の少なくとも一つの被覆した非対
照くぼみに加え、 ｄ）試料を第二の列の少なくとも一つの被覆した非対照
くけみに加え、且つ ＃）　第一及び第二の列の被覆したくぼみ中の試料に対
して酵素結合した種特異的抗体配合体を添加する ことを包含する、試料の分析方法を提供する。

好適形態においては、本発明による分析方法は、さらに ｆ）　段階−）の生成物を酵素結合した抗体配合−１７
一 体に対する基質によって処理する 段階を包含することができる。

前記のように、分析すべき試料はＥＬＩＳＡ方法におい
て使用するために適する任意の蛋白質含有材料とするこ
とができる。試料は肉又は乳、あるいはそれらからの製
品とすることができる。試料は試料の血清成分又は筋肉
構成成分から成ることができる。

乳又は乳製品の場合には、これらは直接に試験すること
ができる。ＥＬＩＳＡ方法の感度は、たとえば乳中の血
清アルブミン及び血清グロブリンのような蛋白質の直接
の検出を、たとえ、それらが比較的低濃度で存在してい
る場合ですら、可能とするということを了解すべきであ
る。

試料は次のようにして調製することができる。

試料を蒸留水によって抽出する。たとえば約５０ｇの肉
は十分な時間浸漬することによって約５０ｍ１の蒸留水
を用いて抽出することができる。浸漬は５分またはそれ
以上続ければよい。あるいはまた、抽出はプラスチック
の袋中で効果的な時間にわたって消化するととによって
達成することができる。通常は約１０秒が適当である。

試料抽出物の濃度は限定的ではない。１ｇの試料当り約
１　ｔｎｌという比を用いることができる。

所望するならば、実際に得られる結果に大きな影響を及
ぼすことなく、多数の試料をまとめることができる。所
望するならば５試料までをまとめて試験するととができ
る。本発明の方法による利点は、ＥＬＩＳＡ方法は、約
０，１チ又はそれ以上の量における汚染物の検出を可能
とするような感度を有するものであるという点にある。

外来種の存在が検出される場合には、まとめた試料の中
のどれが代替穫を含有していたかを決定するために、個
々の試料を試験すればよい。

前記のように分析方法の段階（ｃ）及び（ｄ）は試料を
各列の被覆した非対照くぼみに添加することから成って
いる。

好適形態においては試料添加段階（ｃ′）及び（ｄｌは （１）各列中の被覆した各非対照くぼみに対して一滴の
試料抽出物を添加する段階を包含する。

抽出液滴はパスツールピペットを用いて分与することが
できる。液滴の大きさけ限定的ではない。

約５０〜６０ｎｌの範囲の量を有する液滴け、はぼ同等
の結果を与える。それ故、約５０＃ｌの液滴を与えるべ
きパスツールぎベットを選ぶとよい。

試料添加段階（ｌ及び（ｄｌは、さらに（ｉｉ）　　試
料中の特異的抗体が種−特異的抗原、抗体又は類似物に
結合するように々るために充分な時間にわたって、被覆
した容器を温置する。

ことを包含することができる。

との温置段階は、はぼ室温で行なうことができる。温置
段階は約３０分続ければよい。後記のように温置の間に
容器にふたをしてもよい。

試料添加段階（ｃ）及び（ｄｌ［、さらに（ｉｉｉｌ　
　容器をからにしてそれを水で洗浄する段階をも包含す
ることができる。

容器は清浄な水を用いて５回またはそれ以上洗浄する。

本発明による分析力法の段階（ｇｌは容器の第一及び第
二列中の被覆したくぼみ中の試料への酵素結合１−だ種
−特異的抗体配合体の添加を樟供す石。別の種−特異的
配合体を容器の続く列の被覆した非対照くぼみに添加す
ることができ石。

配合体は １、免疫付与のために用いた血清の種類、及び２、免疫
性を与える動物種、たとえば、ヒツジ、ウサギ、乳牛な
ど によって変化する。

酵素ＪｄＥＬＩＳＡ法において使用するために適するも
のの中の倒れかから選択することができる。

たとえば、酵素はアルカリ性ホスファターゼ、グルコー
スオキシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼと
することができる。好適な酵素はセイヨウワサビペルオ
キシダーゼである。

酵素−抗体配合体は、伺らかの適当な方法で調製するこ
とができる。酵素−抗体配合体の調製のための好適方法
は、ウィルソン及びナカネの方法（免疫螢光及び関連す
る染色方法、Ｋ、クナツプ、Ｋ、ホルパー及びＧ、ウィ
ック編、アムステルダム、エルゼピャ、２１５〜２２５
頁、１９７８年）である。

配合体は、同定すべき各外来種に相応するように選ぶ。

かくしてヤギ乳中の外来種の同定のためには、２種の配
合体はヒツジ抗ヤギＩＩＧ−セイヨウワサビペルオキシ
ダーゼ及びヒツジ抗−乳牛ＩＩＧ−セイヨウワサビペル
オキシダーゼとすることができる。

次いで酵素−抗体配合体を好適希釈度を力える　　。

ように滴定する。好適な希釈度は少なくとも１．０の後
記の酵素基質による光学密度を与えるようなものである
。このような希釈度は配合体によって且つ配合体のパッ
チによって異なるが、簡単な実験によって決定すること
ができる。だとえば、肉牛／アメリカ野牛−特異的試薬
に対しては１：４００の希釈度を用いることができ、ま
たカンガル−特異的試薬に対しては約１：６００の希釈
度を用いることができる。

配合体添加段階（ｉｉは （ｉ）　　Ｉｎ＋定すべき種に相応する各列の各被覆し
た非対照くぼみに対する１滴の酵素結合種−特異的抗体
配合体の添加 を包含することができる。

酵素抗体配合体は水溶液中で調製することができる。水
溶液は緩衝剤溶液とすることができる。

緩衝剤溶液は燐酸塩緩衝食塩水とすることができる。燐
酸塩緩衝食塩溶液は界面活性剤をも含有することができ
る。界面活性剤はポリソルベートとすることができる。

ポリソルベートけ１ツイーンツエンテイー“の商品名下
に市販されている。

緩衝剤溶液は、さらに酵累−抗体配合体安定剤をも含有
することができる。安定剤はオパルプミン、メチオレー
ト及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ｐｕｓｐ
＋又はそれらの混合物から選択することができる。緩衝
剤溶液は、さらに不活性染料をも包含することができる
。不活性染料は配合体の添加の間の可視化助剤として作
用する。

ブロモフェニルブルーを不活性染料として使用すること
ができる。

配合体添加段階（ｅ）は、さらに （ｉｉ）被覆した容器を、配合体と捕獲された抗体との
間の反応を生じさせるために充分な時間にわたって温置
することを包含することができる。

温置けほぼ室温において約３０分にわたって続ければよ
い。

前記のようｆＥＬＩｓＡ分析方法は、さらに段階（ｆｌ
を包含し、これは （１）段階（ｉｉの生成物を基質によって処理すること
から成っている。酵素−結合した抗体配合体処理段階（
ｆｌは、生じる抗原の量の定性的及び／又は定量的測定
をｏｌ能とする。

基質は容器の各列の各くぼみに対して加えることができ
る。

段階（ｆｌは、さらに （ｉｉ）段階（ｇ）の生成物と酵素基質の間の反応を許
すために充盆な時間にわたって容器を放置する段階をも
包含することができる。

容器は約１０〜２０分放置すればよい。上記の実施形態
における青色の発現は陽性の反応を特徴付けるというこ
とを了解すべきである。１チ陽性対照〈はみにおける色
濃度との比較によって、外来種が存在しているかいない
かについての定性的な測定を行なうことができる。必要
に応じ、定量的な測定は、公知の方法によって、たとえ
ば光学密度の測定または滴定によって達成することかで
ば、セイヨウワサビペルオキシダーゼに対しては、ｏ−
）ルイジン溶液を用いることができる。溶液は水溶液と
することができる。水溶液は約４．５のＰＨＫ緩衝する
とよい。緩衝溶液はくえん酸ナトリウム中の過酸化水素
（Ｈ，０，）から成ることができる。約５ＱｍＭの・く
えん酸ナトリウム中の約２．５ｍＭの仇Ｏ８を用いれば
よい。０−トルイジノは約２．５ｒｒＬＭの濃度で存在
させればよい。

容器上の各くぼみに対して１．２滴の基質溶液を加える
。基質の添加の前に、適当な洗浄液を用いて板を洗うと
よい。前記のように、液滴の大きさは限定的でけ々い。

約２５＃ｌ〜６０ｔｔｌの範囲の液滴の大きさが記載の
系において受容しつる結果を与える。

本発明のさらに他の局面においては、試料を分析するた
めの方法において使用するための容器を調製するための
方法を提供するが、この方法は（ａ）　　（１）　　第
一のくぼみの列　及び（ｉｉ）第二のくぼみの列 を包含する容器を用意する、 （ｈ）第一の列の少なくとも一つのくぼみを第一の種−
特異的抗原、抗体又は類似物によって被榛する、 （ｃ）　　第二の列のくぼみの少なくとも一つを第二の
稲−特異的抗原、抗体又は類似物によって被覆する、 （ｄ）第一の列中の少なくとも７つのくぼみを対照を形
成するように処理する、及び （ｃ）第二の列中の少なくとも一つのくぼみを対照を形
成するように処理する ことを包含している。

本発明による調製方法の段階（ａ）において用意する容
器はミクロタイター板とすることができる。

ミクロタイター板は前記の種類のものとすることができ
る。

被覆段階（ｈ）及び（ｃ）は （１）第一の列の少なくとも一つのくぼみを緩衝剤溶液
中の第一の種−特異的抗原、抗体又は類似物によって処
理する、 （ｉｉ）被覆した容器を特異的抗原がくぼみの壁に結合
するようになるために充分な時間にわたって温置する、
及び （ｉｉｉ）　　被覆した容器を食塩溶液中で洗浄すると
とから成ることができる。

種−特異的抗原、抗体又は類似物け５０ミクロリツトル
の量で調製するとよい。種−特異的抗体は緩衝剤溶液中
で約２１１１／ｍｌＫ希釈するとよい。

緩衝剤溶液は燐酸塩緩衝食塩（ＰＢＳ　ｌ溶液とするこ
とができ、それは約１２のｐＨを有することができる。

温置段階（ｉｉ）は室温で行なうことができる。温置は
約１２〜２４時間、好ましくけ１６時間続ける。

洗浄段階（ｉｉｉ）は燐酸塩緩衝食塩溶液を用いて行な
えばよい。食塩溶液は界面活性剤を含有することができ
る。界面活性剤はポリツル・り一トとすることができる
。ポリソルベートは”ツイーン２０”の商品名下に市販
されているものとすることができる。

種−特異的抗原のそれぞれに対して被覆段階を繰返すと
いうことを了解すべきである。温置及び洗浄段階は、各
列のくぼみを核種し終ったのちに行なうことができる。

容器は側らかの適当なシーラーを用いておおうことがで
きる。自己粘着性のプラスチックシーラーを用いること
ができる。容器は室温で貯蔵することができる。容器は
低温、たとえば約４℃で貯蔵してもよい。容器は、この
ような条件下に約６ケ月にわたって安定であり、目つ活
性を保持することが認められている。

前記のように、調製方法はさらに次の対照処理段階を包
含する： （ｄ）　　第一の列中の少なくとも一つのくぼみを対照
を形成するように処理する。対照は陰性の対照であるこ
とが好ましい。陰性の対照のために被覆段階（ｈ）を対
照〈はみに対して繰返すことができる。

好適形態においては、処理段階（ｄ）及び（−）は陽性
の対照をも形成させる。対照処理段階＠）及び（−）は
（１）第一の列の第二のくぼみに対して段階（Ａ）を繰
返す、及び （ｉｉ）第一の列の第二のくぼみを種−特異的抗体−酵
素配合体によって被覆する ことを包含する。

種−特異的抗体一酵素配合体は前記のように選択するこ
とができ石。配合体被覆段階は前記と同様にして行なう
ことができる。

容器中に２列よりも多いくぼみの列が存在する場合は、
被覆及び対照処理段階を繰返すことができる口 本発明のさらに他の局面においては、試料を分析するた
めの試験キットを提供するが、この試験キットは α）前記の種類の酵素結合免疫吸着分析装置、ｈ）適当
な容器中の複数の種−特異的抗体一酵素配合体、及び Ｃ）適当な容器中の酵素基質 を包含している。

好適形態においてはＥＬＩＳＡ装置は α）第一のくぼみの列 ｂ）第二のくぼみの列 を包含する容器を包含している。

各列のくぼみはさらに■確認標識をも包含することがで
きる。確認標識は色符号から成ることができる。同定す
べきそれぞれの種に対して異なる色を選択するとよい。

種−特異的抗体一酵素配合体を包含する各容器（ｂ）も
また相当する確認標識を包含する。やけり色符号を用い
ることができる。

本発明を次いで付随する図面及び実施例を参照してさら
に詳ｌ１ｉｉｌＫ説明する。しかしながら、以下の説明
は単に例証であるにすぎず、上に記した本発明の一般原
則を伺ら制限するものと考えるべきでけ々い。

第１図は８種の特異的抗原で被覆した８列のくぼみを包
含する本発明によるミクロタイター板の一実施形態を示
す。第１図のミクロタイター板は単一の板上の１０試料
の試験を可能とし１っ各列上に組み込んだ陽性（標準１
及び陰性（ブランク）対照を包含している。

第２図は本発明によるミクロタイター板の他の一実施形
態を示す。このミクロタイター板は複式配置とした６種
の特異的抗原で被覆した６列のくぼみを包含する。この
実施形態においてはミクロタイター板上にカバーを置く
ことができるということを了解すべきである。カバーは
一度にミクロタイター板の一方の側のみを暴露すること
ができるように列６と７の間で裂くか又はその他の方法
で穴を開けることができる。

第３図は多重使用方式として２種の特異的抗原で被覆し
た２列のくぼみを包含する本発明によるミクロタイター
板の一実施形態を示す。この実施形態においてもやけり
、カバーを用いることができＵつ必要に応じ各部分から
取り除くことができる。

実施例 抗血清の製造 試験すべき株に応じて、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ロバ、ウ
シ又はその他の適当な動物中で抗血清を生じさせる。典
型的な抗血清及びそれらの抽出を第１狭中に示す。たと
えば、特異的抗−ヒツジ試薬は、フロインドアジュバン
トの多重エマルジョン中で２０■の倹ヒツジ血清により
ヤギを免疫性とすることによって製造された。調製した
ばかりのこのヤギからの抗血清は比較的低い力価を有し
ていた。その理由は、ヒツジとヤギは近い関係を有する
動物であるためにヒツジの血清はヤギの免疫系に対゛し
て特に異物ではないものとみられることである。

この理由によ）、すべての場合に特異的抗体は一般的な
親和性クロマトグラフィ一方法を用いて全抗血清から精
製する。これは簡単であるように思われたが、多くの問
題に遭遇した。たとえば、ヤギ抗−ヒツジは肉牛ときわ
めて僅かな交差反応を生じるのみであった。これは肉牛
と羊は共に反部動物であり、ヤギとヒツジはど近い関係
はないけれども、ある程度の重複が存在する故に、予想
されることである。この交差反応は１肉牛１血清親和性
カラム上の吸着によって除かれた。

第二に、ある場合には抗イデイオタイプの抗体が生じ、
これが偽陽性反応の原因となることが認められた。これ
は、抗体を調製するために用いた種と同じ種の血清親和
性カラム中に適当な親和性抽出したその抗体を通じるこ
とによって除去することができた。たとえば、ヤギー抗
ヒツジはヤギ血清親和性カラ、ム中を通過させねばなら
ない。

これらは、これらの糸において使用するための特異的且
つ非交差反応性抗血清の製造において遭遇した問題の二
つの例である。同様な問題は、それぞれの種において遭
遇した。すべての抗血清は問題とする種からの全血清蛋
白質を用いて動物を免疫に５するととによって製造した
。たとえば、精製した血清アルブミン又は血清免疫グロ
ブリンもまた実用できる試薬を与えるが、それらは免疫
原として全血清蛋白質を用いて得たものと同等に良好で
あるとは思われない。後者は密接に関係する種、九とえ
ばヒツジ／ヤギ、の区別において特に有用な大きな範囲
の抗原性エピトープを提供する。

第　　１　表 肉判定ＥＬＩＳＡ用試薬の調製 抗−乳牛：−ヒツジ抗抗乳牛血清。

試薬：　　　特異的抗体をウシの血清親和性カラム上で
親和性抽出した。

抗−ヒツジ：−ヤギ抗−ヒツジ血清。

試薬：　　　粗製抗血清をウシの血清親和性カラム中に
通じ且つ次いで特異的抗体を ヒツジ血清親和性カラム上で親和性 抽出した。

抗−プタ：−ヒツジ抗−プタ血清。

試薬：　　　特異的抗体をブタ血清親和性カラム上で親
和性抽出した。

抗−ウマ：−乳牛抗−ウマ血清。

試薬：　　　特異的抗体をウマ血清親和性カラム上で親
和性抽出した。

抗−カンガルー：一乳牛抗−力ンガルー血清。

試薬：　　　特異的抗体をカンガル−血清親和性カラム
上で親和性抽出した。

抗−アメリカ野牛ニー乳牛抗アメリカ野牛血清。

試薬：　　　粗抗血清をウシの血清親和性カラム中に通
じ且つアメリカ野牛血清親和 性カラム上で特異的抗体親和性抽出 した。

抗−ヤギ：−ヒツジ抗−ヤギ血清。

試薬：　　　特異的抗体をヤギ血清親和性カラム上で親
和性抽出した。

抗−ロパ：−ウマ抗−ロパ。

試薬：　　　特異的抗体をロバ血清親和性カラム上で親
和性抽出した。

■ 板のシーラーニリンプロ　／タイターチックの接着剤裏
張シしたアセテート板シー ラー（１五２　ｃｍ　Ｘ　ａ　２　ｉｓ　）カタログ番
号７６−４０１−０５ 実施例１ 肉の判定 段階１　試料の調製 試料を蒸留水中への最低５分の浸漬又はプラスチック袋
中の１０秒間の“消化”によって抽出す石。試料抽出物
の濃度は限定的ではないけれども、１ｇの内当シに約１
ゴの比が推称される。試料抽出物は、望むならば、まと
゛めることかできる（１試験当シ５試料以内）。

段階２　試料の添加 使い捨てプラスチック又はガラスバスツールビプツトを
用いて試料容器から直接に試料抽出物を下に下がる各縦
列に加える（１くぼみ当９１滴）。

縦列１〜１０を試験試料に対して使用し、縦列１１及び
１２は、それぞれ、１ｔｓ種検出標準とブランク（背景
）対照用とする（縦列１１及び１２には試料抽出物を加
えない）。板上にふたを置き、それを室温で３０分放置
する。

段階３　板の洗浄 流し中で板を振って液をからにする。清水を用いて、た
とえば静かに流す水道水下に、少なくとも５回洗浄する
。各洗浄の間に板を振り且つ最後の洗浄後に紙タオル上
で裏返しにして板を強くたたく。

返僅１　配合体の添加 ゛　種−特異的抗体一酵素配合体を、色で符号付けした
滴下びん中に用意する。一つのくぼみ肖り１滴を種に対
応する横列に水平的に、色符号を確認しながら、加える
。たとえば赤符号を付した配合体は板の赤符号を付した
横列に加える。全部の配合体が、液滴の正しい添加を容
易にするために、不活性の青色染料を含有している。次
いで板にふたをかぶせて室温で５０分放置する。

段階５　段階３と同様な板の洗浄 段階６　基質の添加 ２ペルを付し九頭部の白いびん中に基質（呈色試薬）を
用意する。この無色の基質鹸液２滴をミクロタイター板
上の９６のくぼみのそれぞれに加える。

段階７　判定 １０〜２０分後に陽性の反応の特徴である青色の発現に
ついて板を調べる。試験が妥当であるためには、標準は
すべて陽性であり且つブランクのくぼみは無色でなけれ
ばならない。陽性の反応は１チの陽性対照くぼみ中の濃
度と等しいか又はそれよりも濃い青色を発現するくぼみ
として定義される。

注：２５μを乃至６０μｔの範囲内の液滴の大きさが上
記の方式において受容できる結果を与える。

実施例２ 乳の判定 段階１　試料調製 試料の調製は必要ではない。全乳又は希釈した乳を試験
することができる。

段階２　試料添加 使用前に適当なくぼみから密封テープを取シ除く。使い
捨てプラスチックノクスツールピペツ）ｔ−用いて、必
要な数の乳牛（赤）及びヤギ（褐色）のくぼみに対して
、試料を加える（１くぼみ当９１滴）。この段階におい
ては１＋１及び１−″の記号を付した列には添加を行な
ってはならない。

板にふたをして室温で５〜１０分間放置する。

段階３　板の洗浄 流し中で振って板から液を除く。たとえば、穏やかに流
れる水道水下で、清浄な水を用いて少なくとも３回洗浄
する。洗浄の間に板を振り且つ最後の洗浄後に、紙タオ
ル上で板を裏返しにして強くたたく。

段階４　特異的試薬の添加 乳牛及びヤギ−特異的試薬を、色で符号付けした滴びん
中に用意する。色符号を確かめながら、すなわち１赤“
の試薬を１赤“のくぼみに且つ１褐色“の試薬を１褐色
０のくぼみへと、適切なびんから必要な数のくぼみに、
一つ当９１滴を添加する。これらの試薬は板の下端にお
ける１＋１及び１−１のくぼみにも添加する。次いで板
にふたをして室温で５〜１０分放置する。

段階５　段階６におけると同様にして板を洗浄する。

段階６　発色 ラベルを付した、頭部の白いびん中に発色試薬を用意す
る。次いで２滴のこの無色のｍ液を適切なくぼみに加え
る。

段階７判定 ５〜１０分後に、明白な青色として示される陽性の反応
の発現について調べる。色の検出は板を白い背景上に置
くξとによって容量となる。

対照は陽性及び陰性のくぼみの形態として板上に提供さ
れる。陽性のくｔ″！′みは、その乳の１％の試料によ
って示されるものに近似する反応を与えるように、予め
処理して□ある。とれらのくぼみは、１試料又は一連の
試料を分析するときは常に、試験体系中に包含せしめる
ことが提案される。′＋１のくぼみ中に明らかな青色が
認められ、且っ１．−１のくぼみが無色のままであると
きは、系は正当に働らいている。

キット試薬によって下記の結果が得られた。すべての測
定は４回繰返して行ない且つ生じた色をＥＬＩＳＡプレ
ートリーダーを用いて定量した。

明瞭とするために、読みを光学密度Ｘ１０口士標準偏差
として表わす。

乳牛系： １００％牛乳　　　　　１３５±４ １０％牛乳　　　　　　　　１４３±１１チ牛乳　　　
　　　　　　１３６±２゜０．１％牛乳　　　　　　　
　１１６±５０．０１チ牛乳　　　　　　　　４５±４
１００％ヤギ乳　　　　　　　　５±２ヤギ系： １００チヤギ乳　　　　　　１６４±６１０チヤギ乳　
　　　　　　１５６±６１％ヤギ乳　　　　゛　　　　
１１０±６０．１係ヤギ乳　　　　　　　　５０±２０
．０１ｑｂヤギ乳　　　　　　　２３±２１００％牛乳
　　　　　　　　１２±４上記献間゛題とする種からの
適当な容量の乳を相補的表種からの乳中で希釈すること
、たとえば１容量の十ｋを９９容量のヤギ乳に加えて１
チの゛牛乳とする、から成っている・ 最後にζこに概説したような本発明の精神から逸脱する
ことなく、種々のその他の修飾及び／又は変更を本明細
書に加えることができるということを了解すべきである
。

【図面の簡単な説明】

第１図は８種の特異的抗原で被覆した８列のくぼみを包
含する本発明によるミクロタイター板の一実施形態を示
す。 第２図は複式配置とじ７’Ｃ６種の特異的抗原で被覆し
た６列のくぼみを包含する本発明のンクロタイター板の
一実施形態を示す。 第６図は多重使用方式として２種ＯＩ＃異的抗原で被覆
した２列のくぼみを包含する本発明のミクロタイター板
の一実施形態を示す。 特許出願人　ザ・ステイト・オツ・ビクトリアメ　を 光　Ｖ １口 二 も ば と ］■口Ｉ口口

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酵素結合させた免疫吸着分析のための、（１）（ａ
   ）第一のくぼみの列；及び （ｂ）第二のくぼみの列 を包含する容器を包含し、該第一のくぼみの列は（ｉ）
   対照を形成するように適合した少なくとも一つのくぼみ
   、及び （ｉｉ）第一の特異的抗原、抗体又は類似物質で被覆し
   た少なくとも一つのくぼみ を包含し、該第二のくぼみの列（ｂ）は （ｉ）対照を形成するように適合した少なくとも一つの
   くぼみ、及び （ｉｉ）第二の特異的抗原、抗体又は類似物質で被覆し
   た少なくとも一つのくぼみ を包含し；各特異的抗原、抗体又は類似物質は試料を認
   識し且つそれに結合するように選択することを特徴とす
   る装置。 ２、容器はさらに （ｃ）少なくともさらに１列のくぼみの列 を包含し、この列は （ｉ）対照を形成するように適合した少なくとも一つの
   くぼみ、及び （ｉｉ）さらに他の特異的抗原、抗体又は類似物質で被
   覆した少なくとも一つのくぼみ を包含する、特許請求の範囲第１項記載の装置。 ３、各特異的抗原、抗体又は類似物質は肉牛／アメリカ
   野牛−特異的抗血清、ヒツジ−特異的抗血清、ブタ−特
   異的抗血清、ウマ／ロバ−特異的抗血清、カンガルー−
   特異的抗血清、アメリカ野牛−特異的抗血清、ヤギ−特
   異的抗血清、及びロバ−特異的抗血清又はそれらの混合
   物を包含する抗血清から選択する、特許請求の範囲第２
   項記載の装置。 ４、試験すべき試料は乳又は乳製品であり且つ抗血清は
   ヒツジ抗乳牛抗血清及びヒツジ−抗ヤギ抗血清から選択
   する、特許請求の範囲第２項記載の装置。 ５、各列中の一つのくぼみ（ａ）を陽性の対照を形成す
   るように処理し且つ各列中の一つのくぼみ（ｂ）を陰性
   の対照を形成するように処理し； 陽性の対照くぼみ（ａ）は特異的抗原、抗体又は類似物
   質の第一の被覆を包含する、特許請求の範囲第２項記載
   の装置。 ６、酵素結合免疫吸着分析のための （１）特許請求の範囲第２項記載の第一の容器、（２）
   それに隣接する少なくともさらに１個の容器、 （３）隣接する容器間の第一の分離部材、及び（４）少
   なくとも一つの被覆したくぼみと対照くぼみの間の第二
   の分離部材 を包含する装置。 ７、（ａ）試料を用意し、 （ｂ）特許請求の範囲第１項記載の装置を用意し、 （ｃ）試験すべき試料の一部分を第一の列の少なくとも
   一つの被覆した非対照くぼみに対して添加し、 （ｄ）試料の一部分を第二及び続く何れかの列の少なく
   とも一つの被覆してない非対照くぼみに対して添加し、 （ｅ）酵素−結合した種−特異的抗体配合体を第一及び
   第二の列の試料くぼみ及び対照くぼみに添加し、且つ （ｆ）段階（ｅ）の生成物を酵素−結合した抗体配合体
   に対する基質によつて処理する ことを包含する、試料の分析方法。 ８、試料添加段階（ｃ）及び（ｄ）は （ｉ）１滴の試料抽出物を各列中の各被覆した非対照く
   ぼみに添加し、 （ｉｉ）被覆した容器を試料中の特異的抗体が種−特異
   的抗原、抗体又は類似物質と結合するようになるために
   充分な時間にわたつて温置し；且つ段階（ｅ）の配合体
   の添加は （ｉ）１滴の酵素−結合した種−特異的抗体配合体を同
   定すべき種に相当する各列の各被覆した非対照くぼみに
   添加し、且つ （ｉｉ）被覆した容器を配合体と捕獲された抗体との間
   の反応を生じさせるために充分な時間にわたつて温置す
   る ことを包含する、特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、（ａ）（ｉ）第一のくぼみの列、及び （ｉｉ）第二のくぼみの列 を包含する容器を用意し、 （ｂ）第一の列の少なくとも一つのくぼみを第一の種−
   特異的抗原、抗体又は類似物質によつて被覆し、 （ｃ）第二の列の少なくとも一つのくぼみを第二の種−
   特異的抗原、抗体又は類似物質によつて被覆し、 （ｄ）第一の列中の少なくとも一つのくぼみを対照を形
   成するように処理し、且つ （ｅ）第二の列中の少なくとも一つのくぼみを対照を形
   成するように処理する ことを包含する、試料を分析するための方法において使
   用するための容器の調製方法。 １０、被覆段階（ｂ）及び（ｅ）は （ｉ）第一の列の少なくとも一つのくぼみを緩衝剤溶液
   中の第一の種−特異的抗原、抗体又は類似物質によつて
   処理する ことを包含する、特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、段階（ｄ）は第一の列中の少なくとも一つのくぼ
   みを陽性又は陰性の対照を形成するように処理すること
   を包含する、特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、対照は陽性の対照であり且つ処理段階（ｄ）は （ｉ）第一の列の第二のくぼみに対して段階（ｂ）を繰
   返し、且つ （ｉｉ）第一の列の第二のくぼみを既知組成の分析試料
   である被覆標準物で被覆する ことを包含する、特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、試験キットは （ａ）特許請求の範囲第１項記載の酵素−結合した免疫
   吸着分析のための装置、 （ｂ）適当な容器中の複数の種−特異的抗体−酵素配合
   体、 （ｃ）適当な容器中の酵素基質、 を包含する試料分析用試験キット。