DE3017151A1

DE3017151A1 - Menschliches blut-plaettchen analogon und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE3017151A1
Application number: DE19803017151
Authority: DE
Inventors: Jun David Lee Chastain; Harold Richardson Crews; Stephen Lawrence Ledis
Original assignee: Coulter Electronics Inc
Current assignee: Coulter Electronics Inc
Priority date: 1979-05-07
Filing date: 1980-05-05
Publication date: 1980-11-27
Also published as: HK10386A; GB2049186A; JPS6337905B2; FR2456324A1; GB2049186B; DE3017151C2; FR2456324B1; JPS55154466A; US4264470A; CA1126154A

Description

Patentanwälte

Dipl.-Ing· E- Eder ■ Q Π 1 7 1 R

Dipl. ing. K. Schieschke ό U I / I D I

München 40, Üistbethstraße 3*

COULTER ELECTRONICS, INC. Hialeah, Florida, USA

Menschliches Blut-Plättchen Analogem und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Erzeugung eines menschlichen Blut-Plättchen Analogons für für den Gebrauch als hämatologische Bezugs- und Vergleichszusammensetzung.

Derzeit werden hämatologische Voll-Blut-Vergleichszusammensetzungen aus stabilisierten menschlichen Erythrozyten, aus konservierten menschlichen Erythrozyten als Leukozytenanalogons und aus stabilisierten menschlichen Plättchen hergestellt. Menschliche Blutplättchen (Thrombozyten) sind runde oder ovale Scheiben von etwa einem Drittel bis zur Hälfte des Durchmessers der Erythrozyten (roten Blutkörperchen )_} wie sie im menschlichen Blut gefunden werden. Sie enthalten kein Hämoglobin (roten Blutfarbstoff) und sind normalerweise zwischen 150 000 bis 350 OCO in je 1 mm-^ im normalen menschlichen Blut enthalten.

Derzeit erhältliche Bezugs- und Vergleichszusammensetzungen für die Überprüfung der charakteristischen Eigenschaften von Teilchen-Analysiergeräten zur Bestimmung der Plättchenparameter weisen eine Reihe von Nachteilen auf. Diese liegen begründet in der begrenzten Verfügbarkeit oder den hohen Kosten von menschlichen Blutplättchen und der Schwierigkeit einer nur geringen Stabilität und/oder den umständlichen Methoden im Gebrauch insbesondere für automatisch arbeitende Texlchenzählgeräte. Kommerzielle

030048/0642 - ⁶ -

Erfahrung hat klar gezeigt, daß der Gebrauch menschlicher Plättchen betroffen ist von den schwerwiegenden Herstellungskosten, was eine Belastung darstellt für die Anwendung von menschlichen Blutreserven für "in vitro"-Diagnostik-Produkte und was seinerseits im Gegensatz steht zu dem Bedarf der Entwicklung eines freiwilligen Blutspenderprogramm es.

Ein für Kontrollen benutztes Produkt muß genau auf einer vergleichenden Basis anzeigen, was eine Testprobe von Blut bei einer speziellen Bestimmung darstellt. Weiterhin ist es offensichtlich, wie wichtig es für die zur Steuerung benutzten Produkte ist, Blut zu simulieren, welches in gewöhnlich benutzten Antikoagulantien gesammelt wird. Wenn beispielsweise das für den Vergleich benutzte Produkt Zellen enthält, welche in den Abmessungen größer sind, dann wird das experimentell gewonnene Resultat bei vielen Arten von automatischen Meßeinrichtungen ungenau, wenn nicht sogar völlig unbrauchbar, weil ohne Aussagekraft. -

Jegliches System für die automatische Zählung von Plättchen, welches menschliche Plättchen von anderen Zellen im Blut auf der Basis des charakteristischen Größenbereichs und der Volumenverteilung unterscheidet, macht es erforderlich, daß das hierfür benutzte Bezugs- und Vergleichsmaterial so nahe wie möglich den Größenbereich und die Volumenverteilungs-Charakteristik von Plättchen in normalem menschlichen Blut simuliert. Eine Vergleichskontrolle, welche nur mit Plättchen oder simulierten Plättchen arbeitet, welche eine enge Größenverteilung haben, würde nicht brauchbar sein, um zu bestimmen,ob die Größenverteilungs-Urenzen, zwischen denen das Instrument "Plättchen" zählte, korrekt gesetzt worden sind oder nicht. Beide,und zwar die

— 7 — 030043/0842

obere und die untere Größen-Grenze der Plättchen muß in dem zum Vergleich benutzten Bezugsmaterial vertreten sein. Weiterhin sollte das mittlere Plättchenvolumen des zum Vergleich benutzten Materials möglichst nahe bei dem der normalen menschlichen Plättchen liegen. Wenn die oberen und die unteren Grenzen für die Größe und das mittlere Plättchenvolumen auf diese Art und Weise bestimmt sind, wird es eine tatsächliche Notwendigkeit für das Volumen-Vertei-

.logarithmische

lungSr-Histogramm des Plättchenmaterials die/Normal-Verteilung frischen menschlichen Blutes möglichst genau anzunähern.

Ein Vergleich der Volumenverteilung eines Histogramms der Plättchen in frischem menschlichen Blut mit dem Histogramm der Volumenverteilung eines typischen kommerziellen, aus menschlichen Plättchen hergestellten Vergleichsmaterials zeigt, daß der Modenverteilungspunkt der Verteilung der kommerziellen Plättchen-Vergleichs-Suspension signifikant niedriger liegt als der der Plättchen im frischen Blut. Zusätzlich ist das Ende im Bereich der niedrigen Volumenwerte des Histogramms für das Vergleichsmaterial niedriger als das, welches bei den frischen Plättchen gefunden wird» Dies scheint anzudeuten, daß der gegenwärtig bei der Herstellung der Vergleichssuspension benutzte Herstellungsprozess einen signifikanten Schwund der Plättchen bewirkt hat.

Andere kommerzielle Plättchen-Vergleichs-Präparate leiden darunter, daß altersabhängig eine Verschlechterung der Volumenverteilung in der Charakteristik des Histogramms eintritt und auch eine Verschlechterung anderer Parameter gegeben ist. Auf diese Weise kann die Brauchbarkeit einer gegebenen Anzahl von Vergleichszusammensetzungen oder auch von echtem Blut, welches Plättchen enthält,

- 8 -030048/0642

durch den Mangel an Stabilität der zugehörigen ¥_erte eingeschränkt sein.

Es scheint eine Unvereinbarkeit . vorhanden zu sein zwischen der Notwendigkeit, die Vergleichsplättchen für die Erzielung einer guten Haltbarkeit zu stabilisieren und der Erhaltung des Größenbereiches, des mittleren Volumens und der logarithmisch-normalen Größenverteilung im Histogramm, welche charakteristisch sind für. eine normale Plättchenverteilung. Die Lösung- für dieses Problem liegt nicht in der Richtung eine noch effektivere Art der Stabilisierung von "echten" (menschlichen) Plättchen zu finden, sondern darin, ein Surrogat zu schaffen, welches die Anforderungen erfüllt, welche an dieses Produkt gestellt v/erden. Tierische Plättchen sind im allgemeinen nicht brauchbar, weil sie in nur geringer Zahl auftreten und auch dazu neigen zusammenzuklumpen.

Mit dem steigenden Gebrauch von automatisch arbeitenden Vorrichtungen zur Durchführung verschiedener hämatologischer Untersuchungen und mit der Einführung von Techniken automatischer Zeil-Zählung ist ein erhöhter Bedarf entstanden nach der Entwicklung von Teilchen, welche einerseits als Vergleichsgrößen benutzt werden können oder andererseits auch als Kalibratoren (Kormale).

Drei grundsätzlich unterschiedliche Typen von Partikeln wurden in diesem Zusammenhang untersucht, nämlich menschliche oder tierische Zellen, nichttierische Zellen, wie z.B. Hefe oder Pollen und synthetische Teilchen, wie z.B. Polystyrol-Latex. Latex-Teilchen, welche an sich geeignet sind, in sehr engen Volumenbereichen und Größen Verteilungen hergestellt zu werden, ergeben eine Schwierigkeit dadurch, daß.Probleme auftreten, weiche und gleichmäßige Suspensionen

030048/0642 " 9 -

zu erhalten. Bei Pollen und Hefen, welche auch die Probleme mit der Stabilität der Suspension wie bei Latexteilchen aufweisen, tritt zusätzlich die Schwierigkeit auf, daß von Fall zu Fall die Gleichmäßigkeit nicht gewährleistet werden kann und auch manchmal die Verfügbarkeit nicht gegeben ist. Ein weiteres Erfordernis für Plättchenkomponenten in einem Vergleichsmaterial für Multi-Parameter-Instrumente besteht darin, daß die Zellen durch ein lytisches Reagenz gelyst werden müssen. Latex-Teilchen und nichttierische Zellen haben diese Eigenschaft nicht.

Von uns wurde gefunden, daß Ziegen, welche Erythrozyten aufweisen, die normalerweise in den niedrigen Größen-(Volumen) Bereich fallen, auf eine entsprechend beeinflußte Umgebung durch die Erzeugung von Erythrozyten reagieren, welche ähnlich sind oder geändert bzw. gemischt werden können, um sie ähnlich zu machen der Verteilung von menschlichen Blutplättcnen,und zwar hinsichtlich der Zahl, der Größe und in Bezug auf die Verteilung der Zahl, der Größe, den Plättchen im menschlichen Blut. Auf diese V/eise lassen sich diese Erythrozyten als ein den menschlichen Plättchen entsprechendes Analogon verwenden, welches stabil und reproduzierbar ist und besonders geeignet als Vergleichszusammensetzung in Teilchenanalysiergeräten des Coulter-Typs, wie sie beispielsweise unter den Markennamen Cöulter-Channelyzer, Coulter-Counter S-Plus oder Thrombocounter bekannt sind und die alle von dßr Firma Coulter Electronics Inc. Hialeah, Florida hergestellt werden.

Der vorliegenden Erfindung, welche sich auf ein Verfahren der eingangs genannten Art bezieht, liegt die Aufgabe zugrunde, ein Vergleichsmaterial zu schaffen, dessen Eigenschaften so weit als möglich diejenigen frischen menschlichen Blutes zu simulieren gestatten. Gemäß der Erfindung

030048/0642

wird dies durch folgende Schritte erreicht:

a) Beschaffen von Ziegen-Erythrozyten, welche eine mittlere Größenverteilung um nicht mehr als etwa 30 % größer als die menschlicher Plättchen auf v/eisen,

b) Verändern des spezifischen Volumens dieser Erythrozyten, wie benötigt, um sie dahin zu bringen, daß sie mehr dem Volumen menschlicher Plättchen angenähert sind,

c) Bestimmen der Anzahl und der mittleren Größenverteilung der vorgenannten veränderten Erythrozyten mittels eines Teilchenzählgerätes und

d) Kombinieren von Proben von verschiedenen individuellen Ziegen, wie benötigt, um eine Mischung von Ziegen-Erythrozyten zu erhalten, welche nach Zahl, Größe und Volumenverteilung die im menschlichen Vollblut vorhandenen Plättchen simuliert.

Durch die Erfindung können Erythrozyten, die von Ziegen stammen, geändert oder so gemischt werden, daß ein menschliches Plättchen-Analogon gewonnen wird, welches stabil und reproduzierbar ist im Hinblick auf die absolute Zahl von Erythrozyten pro mm^ Blut und auch im Hinblick auf die Anforderungen bezüglich der Volumen- und Größenverteilung. Zusätzlich weist das durch die Erfindung hergestellte Produkt Eigenschaften auf, die bei frischen, normalen Plättchen nicht gefunden werden, nämlich ein hohes Maß an Stabilität der Parameter, wie sie von den Zellen-Zählern gemessen werden, in denen das Produkt benutzt wird. Dementsprechend ist eine standardisierte und stabilisierte Komposition aus roten Blutkörperchen von Ziegen/Referenz- und Vergleichsmaterial geeignet, wie es bei.der Zählung von menschlichen Plättchen durch automatisch arbeitende Meßinstrumente nach dem Coulter-Prinzip benötigt wird. Darüber hinaus sind Anwendungsmöglichkeiten bei verschiedenen Mikroskopiertechniken gegeben, beispielsweise bei der Illuminations- oder Phasen-Kontrast-Methode. Die ZeI-

030048/0642

- 11 -

len, welche nach dem erfinderischen Verfahren behandelt worden sind, liefern ein hervorragendes System von Überprüfungen in einer Ausgewogenheit, welches für die Bestimmung von hämatologischen Größen notwendig ist.

Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung können folgende allgemeine Verfahrensschritte angewendet werden, um zu stabilen Ziegen-Erythrozyten zu gelangen, welche als Bezugsgrößen für automatische Zählvorgänge von menschlichen Blutplättchen benutzt werden können:

a) Frisch abgezapftes Blut von einer Ziege, welche im Hinblick auf eine überwachte Umgebung ausgewählt worden ist und bei der Erythrozyten gefunden wurden mit einer mittleren Größenverteilung mit nicht mehr als 30 % größer als die von menschlichen Plättchen, wird mit einem passenden Antikoagulans gemischt und die zellularen Komponenten werden in eine:· isotonischen Lösung suspendiert.

b) Das spezifische Volumen der Zellen der Ziege wirdj falls notwendig, geändert durch eine oder beide der folgenden Techniken:

(1) durch chemische Mittel: man benutzt eine Lösung zur Stabilisierung und zur Volumenänderung, um die roten Blutkörperchen zum Schrumpfen zu bringen und wäscht dann die Zellen mit einer passenden Wasch-Lösung aus,

(2) durch milde Erwärmung von etwa 20° C bis etwa 60 C für etwa-4 bis mehr als 120 Minuten. Die bevorzugte Temperatur liegt gewöhnlich bei 45° C.

c) Die Anzahl und die Größenverteilung der Erythrozyten in der Probe werden bestimmt,und zwar unter Benutzung

030048/0642 - 12 -

eines Teilchen-Zähl-Instruments, beispielsweise eines der vorgenannten Coulter-Geräte.

d) Proben von verschiedenen individuellen Ziegen werden kombiniert, wie nachfolgend beschrieben wird, um eine Mischung zu erhalten für den- Gebrauch, bei Vergleichsüberwachungen, bei denen die geänderten Zellen in Größe, Zahl und logarithmischer Normalverteilung die Plättchen simulieren, welche im menschlichen Blut vorhanden sind. ' -

Erythrozyten von Ziegen fallen normalerweise in den Bereich kleinen Volumens. Es wurde nun gefunden, daß die Verteilungsbereiche für das Volumen und die Größe der Ziegen-Erythrozyten einer bestimmten Ziege von verschiedenen Faktoren beeinflußt werden, so/von ihrem Alter in Monaten, ihrem Geschlecht, von Erbfaktoren, welche durch selektive Züchtung gesteuert werden können, von der Veterinären Behandlung in vivo oder in vitro, von Phlebotomie (Blutung), welche eine entweder zugefügte oder erhaltene Anämie ergibt, vom generellen Gesundheitszustand, von der Nahrung, und von einer entsprechend beeinflußten Umgebung oder von pharmakologischen Einflüssen. Durch sorgfältige Auswahl dieser Faktoren können Ziegen-Erythrozyten erhalten werden, welche eine Volumen- und Größenverteilung haben, welche nahe der typischen Größen-und Volumenverteilung von frischen menschlichen Plättchen liegt. Derartige Ziegen haben mittlere Erythrozyten-Volumina, welche nur zwei- oder dreimal so groß sind wie das mittlere Volumen von menschlichen Plättchen (7 bis 9 Kubikmikron).

Diese Erythrozyten zeigen im allgemeinen ausgezeichnete Suspensionsßtabilität, eine in hohem Maße reproduzierbare Volumen-Verteilungs-Charakteristik und sind im kommerziellen

030048/0842

Bereich bereits verfügbar. Ziegen zwischen drei und neun Monaten sind besonders bevorzugt geeignet.

Die Nützlichkeit derartiger Erythrozyten als Surrogat-Plättchen könnte von der Notwendigkeit beschränkt werden, sie bis zum Größenbereich der Plättchen zu schrumpfen. Wenn die Erythrozyten hyper- oder hypo-osmotischen Umgebungen ausgesetzt werden, so hat dies den grundsätzlichen Effekt einer Änderung des mittleren Korpuskularvolumens, wobei eine geringfügige Erhöhung oder Erniedrigung der Breiten der Größen-Verteilungs-Histogramme eintritt, jedoch nur ein geringer Effekt bei der Symmetrie des Größen-Verteilungs-Histogramms.

Die Schrumpfung oder Dehnung der Zellen durch eine Manipulation ihrer osraotischen Umgebung vor ein Fixierung hat Grenzen in Bezug auf den Fixierungsprozeß, welcher notwendig ist, um die Stabilität der geänderten Zellen zu gewährleisten. Im allgemeinen kann man Erythrozyten nicht mehr schrumpfen oder anschwellen lassen als um etwa 30 % für diesen Zweck. Deshalb ist es notwendig, mit tierischen Erythrozyten zu beginnen, welche nahe in dem Größenbereich liegen, für den sie schließlich als menschliches Blutplättchen-Surrogat benötigt werden.

Nachfolgend wird ein spezifisches Beispiel von bevorzugten Reagenzien für die Behandlung der Ziegen-Zellen gegeben. Es wird darauf hingewiesen, daß die Angaben nur zur Erläuterung dienen und verschiedene andere Ingredenzien und Proportionen im Zusammenhang mit der Erfindung ebenfalls angewendet werden können.

030048/0642

AntikoagulanzLen fur die Sammlung von Ziegen-Blut Eines oder mehrere der folgenden Antikoagulanzien können in passender Menge benutzt werden, wie vom Fachmann 'zu bestimmen ist.

1. Standard ACD (acid-citrate-dextrose; Säure -Zitrat-

Dextrose)

2. Standard CPD (citrate-phosphate-dextrose; Zitrat-Phos-

phat-Dextrose)

3. Disodium EDTA (ethylenediamine tetraacetate

Ä'thylendiamintetraacetat), 2mg/ml Blut

Zf. Die Stabilisierungs- und Volumenänderungslösung wird nachfolgend beschrieben. (Liter-Formulierung)
Laktose (lactose)
Natriumazid (sodium azide)

Trinatriura-Zitrat-Dihydrat (Trisodiura citrate dihydrate)

Zitronensäuremonohydrat (Citric acid monohydrate) Nichtionischer Schaumerzeuger

(Non-ionic suriactant-Pluronic F 68) 1,0 gm

Wasser DjS bis 350 mOs/kg

pH 6,8-7,0 zugelassener pH Bereich 6_r5-7,5 Osm = 350-36O mOsm/kg Waschlösung (Liter-Formulierung)

Laktose (lactose) 100,00 gm

Trinatrium-Zitrat-Dihydrat

(Trisodium citrate dihydrate) 2,50 gm

Zitronensäuremonohydrat

(Citric acid monohydrate) 0,20 gm

Zellen von Ziegen, welche in der vorstehend beschriebenen Weise behandelt werden, sind äußerst stabil, wenn sie als Blut-Vergleichs- und Bezugsmittel benutzt v/erden.

90,0	gm
1,5	gm
5,0	gm
0,1	gm

030048/0642 - 15 -

Obwohl Ziegen-Erythrozyten normalerweise in den Bereich kleiner Volumengröße fallen, zeigt Blut von irgendeiner Ziege eine offensichtlich universelle Charakteristik von Erythrozyten, nämlich, daß das Volumen-Verteilungs-Histogramm ganz oder nahezu nach einer Gauß-Verteilung verläuft (Glockenkurve) und weniger nach einer logarithmischen Normal-Volumenverteilung, welche für genaue Simulation menschlichen Blutes erforderlich ist. Jedoch sind die mathematischen Beziehungen von .nicht-Gauß-förmigen Verteilungen ausgedrückt in Termen von multiphasigen Gaußfamilien wohlbekannt. Beides, nämlich sowohl einfache harmonische Analyse und Fourier-Analyse-Techniken sind auf komplexe Wellenform en seit vielen Jahren angewandt worden, und es ist bekannt, daß virtuell jegliches Verteilungs-Histogramm von Wellenformen durch eine passende Kombination von einfachen symmetrischen Wellenformen(oder Histogrammen j synthetisiert werden kann, wobei jede Wellenform e"ine bekannte Amplitude und Frequenzcharakteristik hat.

Bei einer Ausführungsform der Erfindung können die mathematischen Beziehungen der Wellenform-Analyse angewandt werden, um die quantitativen Beziehungen einer minimalen Zahl von verschiedenen Ziegen-Erythrozyten-Populationen innerhalb der Klein-Zellenkolonien zu spezifizieren, welche, wenn sie zusaramengemixt werden, ein Volumen-Verteilungs-Histogramm ergeben, welches sehr nahe angenähert ist an das Volumen-Verteilungs-Histogramm von Plättchen in frischem normalen menschlichen Blut. Ziegen-Erythrozyten ergeben eine Quantität der kleineren Zellen, welche ausreicht, um eine logarithmische h'ormal-Verteilung auf dem Histogramm zu erzeugen. Auf diese Weise kann eine passende logarithmische Normal-Verteilung von Ziegen-Erythrozyten hergestellt werden durch Mischung verschiedener Populationen von vorgegebenen Verhältnissen von Blut aus

- 16 030043/0842

vielen einzelnen Ziegen.

Um einen Bezug und einen Vergleich von Ziegen-Erythrozyten zu erhalten, welcher stabil und reproduzierbar ist, und so sinnvoll als menschliches Plättchen-Analogon verwendet werden kann mittels manueller Methoden, wird die Erfindung nun beispielsweise unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in denen Populationshistogramme dargestellt sind. Es zeigen: Fig. 1 eine Ausgangs-Probe von roten Zellen von Ziegenblut nach einer Volumenänderung und Fig. 2 eine Probe von Zellen, zu denen rote Blutzellen einer Ziege hinzugefügt worden sind, und zwar ausgehend von einer Verteilung zunächst nach Fig. 1. Dadurch erhöht sich die Neigung der Kurve nach rechts.

Fig. 3 zeigt die Populations-Verteilungs-Kurve, wenn Zellen mit einem kleineren mittleren Zellvolumen der Probe nach Fig. 2 hinzugefügt werden, wodurch die Verteilung in Richtung auf kleinere Mittelwerte verschoben wird. Fig. Zf zeigt die Populations-Verteilungs-Kurve, wenn Zellen von einem dazwischen liegenden mittleren Zeil-Volumen- Vorrat der Probe hinzugefügt werden, um den mittleren Teil der Kurve anzuheben durch eine Versteilerung der Kurve nach rechts und so eine logarithmische Normal-Kurve zu erhalten.

Fig. 5 zeigt die Populations-Verteilungs-Kurve, welche der logarithmischen Normal-Verteilung von frischen unbehandelten menschlichen Blutplättchen entspricht.

Ein manuell durchgeführtes Herstellungsverfahren ist in den folgenden Schritten durchführbar:

Aus erhältlichen Vorräten von Ziegenzellen werden stabilisierte Ziegen-Zellen ausgewählt, welche (durch Aufteilung in einzelne Kanäle) geprüft worden sind und von denen man gefunden hat, daß sie eine Gauß'sche oder nahezu Gauß'sche

030048/0642

- 17-

Zellverteilung aufweisen. Zellproben, welche mittlere zellulare Volumina zv/ischen 7,5 und 12 Kubikmikrons aufweisen, sind für die Mischung annehmbar. Aus diesen niederohmigen Zellvorräten wird derjenige Zellvorrat ausgewählt, welcher das kleinste mittlere Zellvolumen aufweist. Um die im wesentlichen Gauß'sche Verteilung dieses Ausgangsvorrates in die gewünschte logarithmische Normalverteilung, welche typisch ist für Plättchen, zu modifizieren, v/ird es notwendig sein, diesem Ausgangsvorrat kleinere Mengen von Zellvorräten hinzuzufügen, welche ein größeres mittleres Zellvolumen aufweisen. Man vergleicht die Ausgangsvorrats-Verteilung mit derjenigen der anderen verfügbaren Vorräte und wählt einen solchen aus, welcher ein mittleres Zellvolumen aufweist, welches etwa 10 bis 25 % größer ist als von dem Ausgangsvorrat. Dann fügt man dem Ausgangsvorrat einen Anteil von Zellen aus dem ausgewählten Vorrat hinzu, welcher etwa 10 bis 20 % von dem Zellenzählwert des gesamten Ausgangsvorrates ist und mischt das Ganze gut durch. Anschließend wird die Gesamtverteilung gemessen und mit der logarithmischen Normalverteilung verglichen, v/eiche gewünscht v/ird. Falls notwendig, wird ein anderer Zellvorrat ausgewählt und Zellen zu diesem Ausgangsvorrat hinzugefügt, um die Verteilung zu verbreitern. Dann wird wieder die Gesamtverteilung gemessen und aufgezeichnet. Anschließend wird der Anpassungsprozeß mit dem gleichen Zellvorrat oder einem anderen Zellvorrat wiederholt, um die Form der Kurve so lange anzupassen, bis eine logarithmische Normalverteilung erhalten v/ird.

Verschiedene Arten von pharmakologischen Einflüssen tendieren dazu, die Gauß¹sehen Verteilungs-Histogramme einer speziellen Ziege etwas zu verändern. Beispielsweise kann eine mikrozytische Anämie mit einem erhöhten Anteil von Retikulozyten durch Blutung erzeugt werden. Eine abge-r

030048/0642

- 18 -

schrägte Verteilung der Erythrozyten ergibt ein Histogramm, welches stärker die logarithmische Normalform annähert, welche dem frischen menschlichen Blutes ähnlich ist. Es ist ein Vorteil der vorstehend erwähnten manuellen Verfahrensweise, daß diese Methode anwendbar ist, wenn von einem spezifischen Vorrat an Ziegen-Zellen ausgegangen wird, wie auch immer zu Anfang die jeweilige Form der Verteilung der Erythrozyten sich auch herausstellt. In einigen Fällen kann nur eine geringe Anpassung notwendig werden, um die Kurve an die gewünschte logarithmische Normalform anzupassen, um die Plättchen von frischem normalen menschlichen Blut zu simulieren. Manchmal ist sogar überhaupt keine Anpassung notwendig.

Patentanwalt!

Dipl. Ing E. Ader

DIpI. Ing. K. ScäJeschke

«JM0nchen4O, Qisaft«istraße34

030048/0642

Claims

Patentanwälte

Dipl. -Jng. E. Eder

Dipl. !ng. K. Schieachke

München 40, Elisabethstraße 34

COULTER ELECTRONICS, INC. ^

HialeatL, Florida, TISA ^ ^ ' ' ^ *

Menschliches Blut-Pl'ättchen Analogon und Verfahren zu seiner Herstellung

Patentansprüche

1.]Verfahren für die Erzeugung eines menschlichen Blut-

V ' Plättchen-Analogons für den Gebrauch als hämatolo-

gische Bezugs- und Vergleichszusammensetzung, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

a) Beschaffen von Ziegen-Erythrozyten, welche eine mittlere Größenverteilung um nicht mehr als etwa 30 % größer als die menschlicher Plättchen aufweisen,

b) Verändern des spezifischen Volumens dieser Erythrozyten, wie benötigt, um sie dahin zu bringen, daß sie mehr dem Volumen menschlicher Plättchen angenähert sind,

c) Bestimmen der Anzahl und der mittleren Größenverteilung der vorgenannten veränderten Erythrozyten mittels eines Teilchenzählgerätes und

d) Kombinieren von Proben von verschiedenen individuellen Ziegen, wie benötigt, um eine Mischung von Ziegen-Erythrozyten zu erhalten, welche nach Zahl, Größe und Volumenverteilung die im menschlichen Vollblut vorhandenen Plättchen simuliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ziegen-Erythrozyten nach Schritt a) von etwa drei bis neun Monate alten Ziegen stammen.

030048/0642

ORIGINAL

3. Verfahren nach Anspruch Ϊ, dadurch gekennzeichnet, daß die Ziegen-Erythrozyten nach Schritt a) von Ziegen stammen, welche ein« durch Phleb.otomie verursachte Anämie haben*

Zf. Verfahren nach Anspruch 1, dadurcli gekennzeichnet, daß der Schritt c) mit mindestens einer der folgenden Techniken durchgeführt wird:

(1) durch chemische Mittel unter Verwendung einer Stabilisierungs- und VoIumenänderungslösung, um die Erythrozyten zu schrumpfen;

(2) durch leichte Erwärmung innerhalb des Bereiches von 20° C bis 60° G für vier bis mehr als einhundertzwanzig Minuten.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Stabilisierungs- und Volumenänderungslösung in passender Zusammensetzung eine Mischung aus Natriumazid, Laktose, Zitronensäure und Trinatrium-Zitrat.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 3 oder k, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem Schritt d) von der Lehre der Wellenform-Analyse Gebrauch gemacht v/ird, um die quantitativen Beziehungen einer Anzahl von verschiedenen Vorräten von Ziegen-Erythrozyten zu bestimmen, welche, wenn sie zusammengemischt werden, eine Volumen-Verteilung ergeben, welche die Plättchenverteilung im menschlichen Blut eng annähert.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 3- oder if, dadurch gekennzeichnet, daß das Kombinieren nach Schritt d-) in der folgenden Weise durchgeführt wird:

030048/0642

— "³J ■ —

(a) Auswählen von Zellvorräten mit mittleren Zellvolumina zwischen 7»5 und 12 Kubikmikrons, wobei ein Ausgangszellvorrat ein ziemlich kleines mittleres Zellvolumen aufweist,

(b) Bildung eines modifizierten Zellvorrates durch Hinzufügen zu dem genannten Ausgangszellvorrat eines Anteils von einem anderen Zellvorrat von etwa 10 bis 20 % der Anzahl der Zellen in dent Ausgangsvorrat, wobei der andere Zellvorrat ein mittleres Zellvolumen hat, das etwa 10 bis 25 % größer ist als beim Ausgangszellvorrat,

(c) Bestimmung der Populationsverteilung des modifizierten Zellvorrats und Vergleich desselben mit der gewünschten menschlichen Plättchen-Verteilung,

(d) Auswahl eines anderen Zellvorrates, falls nötig, für die Hinzufügung von Zellen zu dem modifizierten Zellvorrat, um seine Populations-Verteilung· zu ändern,

(e) Bestimmung der geänderten Populations-Verteilung und Vergleich derselben mit der gewünschten menschlichen Plattchen-Verteilung und

(f) Wiederholung der Schritte (d) und (e) mit Zellvorräten bis die erhaltene Populations-Verteilung eine Verteilung von menschlichen Plättchen annimmt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung von Ziegen-Erythrozyten eine logarithmische Normalverteilung ergibt.

9. Menschliches Plättchen-Analogon, dadurch gekennzeichnet, daß Ziegen-Erythrozyten vorgesehen sind, welche einen Größenbereich und eine Volumenverteilung nahe der von typischen menschlichen Plättchen aufweisen,und daß

030048/0642

diese eine bekannte Anzahl von solchen Erythrozyten pro Volumeneinheit haben, für welche eine bestätigte Verdünnung geformt wird, um die Größe, die Anzahl und die Volumenverteilung von Plättchen in vollem menschlichen Blut zu simulieren.

10. Menschliches Plättchen-Analogon nach Anspruch 9j dadurch gekennzeichnet, daß die Erythrozyten von Ziegen besorgt sind, welche ausgewählt werden im Hinblick auf mindestens eines der folgenden Merkmale: Alter, Geschlecht, selektive Züchtung, beeinflußte Umgebung, erhaltene Anämie in vivo, zugefügte Anämie in vivo und Nahrung, um Erythrozyten zu erhalten, die nahe bei der typischen Größe und dem Volumenverteilungsbereich von menschlichen Plättchen liegen.

11. Menschliches Plättchen-Analogon nach Anspruch S, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen der Erythrozyten durch mindestens eine der folgenden Maßnahmen geändert wurde: leichtes Erhitzen innerhalb des Bereiches von 20° C bis 60° C für /f bis mehr als 120 Minuten, sowie chemische Mittel.

12. Menschliches Plättchen-Analogon nach Anspruch 1C, dadurch gekennzeichnet, daß die Ziegen-Erythrozyten von verschiedenen individuellen Ziegen kombiniert sind, um eine Mischung dieser Erythrozyten zu erhalten, welche in Zahl, Größe und Volum env ert eilung die Zahl,- die Größe und die Volumenverteilung der im vollen menschlichen Blut vorhandenen Plättchen simuliert.

Patentanwälte

Dipl.-Ing*E. Eder

Dipl. mg. K&äfishleachke

030048/0642