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Oxazol[4,5-b]pyridine Das Hauptpatent betrifft Ckazol- und Thiazolpyridine,
die entzündungshemmende, antipyretische und analgetische Wirksamkeit aufweisen,
sowie ein Verfahren zur Herstellung derselben.
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine kleine, ausgewählte
Gruppe der unter die allgemeine Strukturformel des Hauptpatents fallenden, darin
aber nicht speziell beschriebenen Verbindungen, die sich gegenüber den letzteren
dadurch auszeichnen, dass sie bei lokaler Applikation eine höhere entzündungshemmende
Wirksamkeit und dabei keine unerwünschten Nebenwirkungen zeigen.
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Die Erfindung betrifft Oxazol[4,5-bgpyridine, die als lokale entzündungshemmende
Mittel wirken, sowie Verfahren zur Herstellung derselben.
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Insbesondere ist Gegenstand der Erfindung eine Verbindung der allgemeinen
Formel
in der n eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet, die Substituenten X gleich oder verschieden
sein können, R' Wasserstoff oder eine C1,3-Alkylgruppe und X (a) niederes Alkyl,
(b) niederes Alkoxy, (c) Halogen oder (d) Trifluormethyl bedeuten.
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Ganz besonders bezieht sich die Erfindung auf Verbindungen, wie 2-(3-tert.Butylphenyl)-oxazol[4,5-b]pyridin,
2-(3 ,5-Ditertbutylphenyl) -oxazol[4, 5-b]pyridin, 2-(2-Methyl-3-chlorphenyl)-oxazol[4,5-b]pyridin,
2-(2-Methyl-3-methoxyphenyl)-oxazol[4,5-bgpyridin, 2-(3-Methy1-5-tert.butylphenyl)-oxazol[4,5-b]-pyridin,
2-(3,5-Ditert.butylphenyl)-5-methyloxazol[4w5-b]pyridin oder 2-(3-Chlor-2-methylphenyl)-5-methyloxazol[4,5-b]pyridin.
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Die Oxazol[4,5-b]pyridine gemäss der Erfindung werden durch Kondensation
eines 2-Amino-3-hydroxypyridins mit einer substituierten Benzoesäure unter dem Einfluss
von Polyphosphorsäure hergestellt. Ein Gemisch aus dem Pyridin und'einem geringen
Überschuss einer Carbonsäure wird in Gegenwart von Polyphosphorsäure etwa 5 Minuten
bis 2 Stunden auf Temperaturen von 100 bis etwa 3000 C, vorzugsweise von etwa 130
bis'2300 C, erhitzt, die Polyphosphorsäure mit Wasser zersetzt und das gewünschte
Produkt gewonnen, indem die Lösung alkalisch gemacht wird.
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Die Oxazolpyridine gemäss der Erfindung eignen sich besonders als
lokale entzündungshemmende Mittel für die Behandlung von Hautleiden, wie Sonnenbrand,
atopische Dermatitis, Kontaktdermatitis, Ekzem an Händen und Flüssen einschliesslich
Dysidrosis und Pusteln, nummulärem Ekzem, Neurodermatitis, Lichen simplex chronicus,
ekzematischer Dermatitis, Lichen planus, infantilem Ekzem, Schuppenflechte, seborrhöischer
Dermatitis, externer Otitis, Stasis-Dermatitis, Insektenstichen, schuppenbildender
Dermatitis, akuter aktinischer Dermatitis, Lippenentzündung, ekzematoider mykotischer
Dermatitis, durch Nahrungsmittel verursachtem Ekzem, neurotischen Schürfwunden,
nach der Analchirurgie, Jucken mit Lichenifikation, Jucken im Anal-Genitalbereich,
Intertrigo, Miliaria und durch Windeln verursachtem Hautausschlag. Sie kennzeichnen
sich dadurch, dass sie bei dem auf die allgemeine Applikation folgenden Test auf
durch Carrageenin induziertes Rattenpfotenödem einen ziemlich geringen Aktivitätsgrad,
aber als Prostaglandinsynthetase-Hemmstoffe einen ungewöhnlich hohen Aktivitätsgrad
aufweisen.
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Ihre geringe allgemeine Aktivität ist die Folge des schnellen Stoffwechselabbaues,
der den ausgesprochenen Vorteil mit sich bringt, dass die Gefahr der üblichen Nebenwirkungen,
die nach der Absorption von entzündungshemmenden Verbindungen- nach der lokalen
Applikation auftreten, beseitigt wird.
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Für die lokale Applikation werden Cremes, Salben, Gele, Lösungen oder
Suspensionen verwendet, die den Wirkstoff enthalten. Die Verbindungen enthalten
etwa 0,01 bis 0,25, vorzugsweise etwa 0,1 Gewichtsprozent Wirksto im Gemisch mit
einem lokal zu applizierenden Träger.
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Beispiel 1 2-(2-Methyl-3-chlorphenyl)-oxazol[4,5-b]pyridin Ein Gemisch
aus 3,4 g 2-Methyl-3-chlorbenzoesäure und 1,0 g 2-Amino-3-hydroxypyridin wird in
einem Mörs er zerkleinert und
innig mit 17 g Polyphosphorsäure gemischt.
Das harzartige Gemisch wird unter Stickstoff langsam innerhalb 75 Minuten unter
Rühren auf 1780 C erhitzt. Die entstandene Lösung wird langsam unter Rühren in 300
ml Eiswasser gegossen. Nach einer Stunde wird der Niederschlag abfiltriert und unter
Rühren zu verdünnter Natronlauge zugesetzt. Nach 15 Minuten wird der Niederschlag
abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei man 2,1 g Rohprodukt erhält.
Dieses wird umkristallisiert, indem es in 75 ml Cyclohexan gelöst, die Lösung filtriert,
auf etwa 50 ml eingeengt und gekühlt wird. Man erhält 1,76 g 2-(2-Methyl-3-chlorphenyl)-oxazol[4,5-b]pyridin;
F. 118,5-120° C.
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Wenn man bei dem Verfahren des Beispiels 1 die 2-Methyl-3-chlorbenzoesäure
und das 2-Amino-3-hydroxypyridin durch äquimolekulare Mengen der in Tabelle I aufgeführten
substituierten Benzoesäuren und Aminohydroxypyridine ersetzt, erhält man nach der
folgenden Gleichung die in Tabelle I genannten 2-(subst.Phenyl)-oxazol[4,5-b]pyridine:
Polyphosphorsäure
Tabelle 1 R Rt F., OC 2-Chlor-3-methylphenyl H 75-77 3,5-Dimethylphenyl H 155-157
3-Isopropoxyphenyl H 68,5-70,5 3-tert. Butyl-5-methylphenyl H 131-132 2-Methyl-3-methoxyphenyl
H 138-141 2-Methyl-3-chlorphenyl 6-CH3 139-143 3-Jodphenyl H 172-176
Tabelle
I (Fortsetzung) R Rt F., C-2-Chlor-3-methoxyphenyl H 165,5-167 3-Fluor-2-methylphenyl
H 98-100 3-Chlor-5-methylphenyl H 121-123 3-Methyl-5-methoxyphenyl H 2-Methyl-3-trifluormethylphenyl
2-Chlor-3-äthylphenyl H 3-tert . Butylphenyl H 124-126 3,5-Di-(tert.butyl)-phenyl
6-CH3- 161-163 B e i s p i e l 2 2-(3-Chlor-2 ,5-dimethylphenyl)-oxazol[4,5-b]pyridin
Stufe A: Herstellung von 3-Amino-2,5-dimethylbenzoesäure 10,0 g 2,5-Dimethyl-3-nitrobenzoesäure
werden in 200 ml Methanol in Gegenwart von 0,5 g 5-prozentigem Palladium auf Kohlenstoff
hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft.
Man erhält 8,3 g 3-Amino-2,5-dimethylbenzoesäure; F. 145,5-146,5°C.
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Stufe B: Herstellung von 3-Chlor-2,5-dimethylbenzoesäure Eine Aufschlämmung
von 4,95 g der in Stufe A hergestellten Aminoverbindung in 25 ml 6n Salzsäure wird
in einem Eis-Acetonbad (-3 bis 0° C) gekühlt und im Verlaufe von 20 Minuten mit
einer Lösung von 2,3 g Natriumnitrit in 6 ml Wasser in Anteilen von je 0,5 ml versetzt.
Nach einer Stunde bei 0 bis EiO C wird das Gemisch in eine Lösung von 4 g Kupfer(I)-chlorid
in 25 ml konzentrierter Salzsäure von 10 C gegossen. Nach einer Einwirkungszeit
von 0,5 Stunden bei 1 bis 20 C, 2 Stunden bei Raumtemperatur, 1 Stunde bei 600 C
und 15 Stunden bei Raumtemperatur wird der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser
gewaschen und getrocknet. Man erhält 4,5 g 3-Chlor-2,5-dimethylbenzoesäure; F. 167,5-1700
C.
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Stufe C: Herstellung von 2-(3-Chlor-2,5-dimethylphenyl)-oxazol [4,
5-b ]pyridin Wenn man nach dem Verfahren des Beispiels 1 arbeitet und dabei die
2-Methyl-3-chlorbenzoesäure durch ein molares Äquivalent 3-Chlor-2,5-dimethylbenzoesäure
ersetzt, erhält man 2-(3-Chlor-2,5-dimethylphenyl)-oxazol[4,5-bgpyridin; F. 99,5-101°
C.
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Beispiel 3 2-(2-Chlor-5-tert,butylphenyl)-oxazol[4,5-b]pyridin Stufe
A: Herstellung von 5-tert.Butyl-2-nitrobenzoesäure 7,0 g 3-tert.Butylbenzoesäure
werden im Verlaufe von 50 Minuten anteilweise bei -5° C unter Rühren zu 50 ml rauchender
Salpetersäure zugesetzt. Nach 15 Minuten bei 0o C wird das Gemisch in Eiswasser
gegossen und der Niederschlag nach weiterem 15 Minuten langem Rühren abfiltriert
und mit Wasser gewaschen; F. 128-134°C. Diese 12 g werden in 65 ml Äthanol gelöst,
die Lösung wird filtriert, auf 700 C erhitzt und mit Wasser auf 400 ml aufgefüllt.
Nach dem Kühlen wird der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet;
Ausbeute 9,55 g. Nach dem Extrahieren mit 200 ml warmem Cyclohexan wird der unlösliche
Rückstand abfiltriert. Man erhält 6,4 g 5-tert.Butyl-2-nitrobenzoesäure; F. 137-139°C.
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Stufe B: Herstellung von 2-Amino-5-tert.butylbenzoesäure 6,2 g der
in Stufe A hergestellten Nitroverbindung werden in 100 ml Methanol in Gegenwart
von 0,5 g 5-prozentigem Palladium auf Kohlenstoff hydriert. Der Katalysator wird
abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Man erhält 5,0 g 2-Amino-5-tert.butylbenzoesäure;
F. 142-145° C; nach dem Wiedererstarren schmilzt die Substanz wieder bei 1510 C.
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Stufe C: Herstellung von 2-Chlor-5-tert.butylbenzoesäure 3,86 g der
in Stufe B hergestellten Aminoverbindung werden in 25 ml 6n Salzsäure bei -2°C gerührt,
wobei man im Verlaufe einer halben Stunde eine Lösung von 1,6 g Natriumnitrit in
3 ml Wasser zusetzt. Nach einer weiteren Verweilzeit von 0,5 Stunden bei 0o C wird
das Gemisch in eine Lösung von 2,7 g Kupfer(l)-chlorid in 20 ml konzentrierter Salzsäure
von 0 C gegossen. Nach halbstündigem Stehenlassen bei 0° C und halbstündigem Stehenlassen
bei Raumtemperatur wird der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.
Diese Ausbeute (A) beträgt 0,17 g; F. 88-94O C. Das Filtrat wird mit etwas Kupferpulver
eine halbe Stunde auf 1000 C erhitzt und dann gekühlt. Der Niederschlag wird abfiltriert,
in Natronlauge gelöst und wieder mit Salzsäure ausgefällt. Dieses Material wird
abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.
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Dieser Teil der Ausbeute (der mit B bezeichnet wird) beträgt 3,15
g; F. 99-103° C. Die Ausbeuten A und B werden vereinigt und aus 20 ml n-Hexan umkristallisiert.
So erhält man 1,6 g 2-Chlor-5-tert.butylbenzoesäure; F. 106-108,5O C.
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Stufe D: Herstellung von 2-(2-Chlor-5-tert.butylphenyl)-Oxazol 4,5-b
pyridin Wenn man bei dem Verfahren des Beispiels 1 die 2-Methyl-3-chlorbenzoesäure
durch ein molares Äquivalent 2-Chlor-5-tert.butylbenzoesäure ersetzt, erhält man
2-(2-Chlor-5-tert.-butylphenyl)-oscazol[4,5-bgpyridin; F. 111-112° C.
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B e i s p i e l 4 2-(3-tert.Butyl-5-methoxyphenyl)-oxazol[4,5-b]pyridin
Stufe A: Herstellung von 3-tert.Butyl-5-methoxybenzoesäure Ein Gemisch aus 2,8 g
Kaliumhydroxid in 9 ml Wasser, 17,1 g Pyridin und 5,0 g 3-tert.Butyl-5-methoxytoluol
wird im Ölbad auf 950 C erhitzt. Unter schnellem Rühren werden im Verlaufe
von
2 Stunden 11,1 g Kaliumpermanganat zugesetzt, worauf man weitere 1,5 Stunden auf
950 C erhitzt. Nach dem Kühlen auf Raumtemperatur werden 5 ml Alkohol zugesetzt.
Das Gemisch wird filtriert und das Filtrat mit 100 ml Äther geschüttelt, wobei sich
drei Schichten bilden. Die untere Schicht (50 ml) und die mittlere Schicht (25 ml)
werden gesondert aufgefangen, auf je die Hälfte ihres Volumens eingeengt und mit
4n Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 angesäuert. Die Niederschläge werden abfiltriert,
mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei man 0,6 g bzw. 1,1 g Rohprodukt
(F. 75-85° C) erhält, welche nach dem Vereinigen und Umkristallisieren aus 10 ml
Essigsäure und 5 ml Wasser 0,85 g 3-tert.Butyl-5-methoxybenzoesäure ergeben; F.
84-87° C.
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Stufe B: Herstellung von 2-(3-te'rt.Butyl-5-methoxyphenyl) oxazol
[4, 5-b]pyridin Ein Gemisch aus 6,0 g Polyphosphorsäure, 0,8 g 3-tert.Butyl-5-methoxybenzoesäure
und 0,46 g 2-Amino-3-hydroxypyridin wird unter Stickstoff in ein auf 1500 C vorerhitztes
Ölbad eingesetzt. Nach 12 Minuten langem Rühren wird die Schmelze in 100 ml einer
Eisaufschlämmung gegossen. Der harzartige Niederschlag wird in Methylenchlorid aufgenommen
und die Lösung einmal mit 20 ml 2,5n Natronlauge und einmal mit 25 ml Wasser gewaschen,
über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem Öl eingeengt, das beim Kristallisieren
0,8 g Produkt ergibt. Nach dem Umkristallisieren aus n-Hexan erhält man 0,5 g 2-(3-tert.Butyl-5-methoxyphenyl)-oxazol[4,5-b]pyridin;
F. 119-121°C.
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Beispiel 5 Zusammensetzung eines Gels 0,1 mg Dinatriumäthylendiamintetraacetat
1,30 mg Wasser 300 mg Isopropanol
26 mg Hydroxypropylcellulose
Mit Propylenglykol aufgefüllt auf 1 g 1,09 mg 2-(2-Methyl-3-chlorphenyl)-oxazol[4,5-b]pyridin.
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B e i s p i e l 6 Zusammensetzung einer Salbe 50 mg Wollfettalkohole
B.P.
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150 mg Amerchol C 350 mg weisses Wachs; Schmelzpunkt 170-175°C Mit
Myristinsäureisopropylester auf 1 g aufgefüllt 1,09 mg 2-(2-Chlor-3-methylphenyl)-oxazol[4,5-b]pyridin
0,4 , wasserfreie Citronensäure 0,58 % wasserfreies Dinatriumphosphat Beispiel 7
Zusammensetzung einer Lösung 84,9 g Äthanol 12,0 g Propylenglykol 3,0 g Salicylsäuremethylester
0,1 g 2-(3,5-Ditert.butylphenyl)-oxazol[4,5-b]pyridin Beispiel 8 2-[3,5-Di-(tert.butyl)-phenyl]-oxazol[4,
5-b]pyridin Ein Gemisch aus 30 g Polyphosphorsäure, 5,0 g 3,5-Di-(tert.-butyl)-benzoesäure
und 2,1 g 2-Amino-3-hydroxypyridin wird unter Stickstoff und unter schnellem Rühren
40 Minuten auf 180°C erhitzt. Das Gemisch wird in 500 ml eines Gemisches aus Eis
und Wasser gegossen. Das Gemisch wird mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung
auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und gerührt, bis der Niederschlag feinteilig
geworden ist.
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Der iederschlig wird abfiltriert, zweimal mit je 100 ml Wasser gewaschen
und getrocknet. Das Rohprodukt wird in 200 ml
n-Hexan gelöst, mit
Entfärbungskohle behandelt, filtriert und auf 75 ml eingeengt. Beim Kühlen kristallisiert
das Produkt zu 3,5 g 2-E3,5-Di-(tert.butyl)-phenyl]-oxazol[4,5-b]-pyridin; F. 154-156°
C.
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B e i S p i e l 9 2-[3,5-Di-(isobutyl)-phenyl]-oxazol[4,5-b]pyridin
Stufe A: Herstellung von 2-[3,5-Di-(brommethyl)-phenyl]-oxazol [4 ,5-b]pyridin Ein
Gemisch aus 10 mMol 2-(3,5-Dimethylphenyl)-oxazol[4,5-b]-pyridin und 21 mMol N-Bromsuccinimid
in 50 ml Tetrachlorkohlenstoff wird 45 Minuten unter Rühren mit einer Sonnenlichtlampe
bestrahlt. Die unlöslichen Stoffe werden abfiltriert, und das Filtrat wird unter
Hindurchleiten von Stickstoff zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit 25 ml
Methanol verrührt. Das rohe 2-[D,5-Di-(brommethyl)-phenyl]-oxazol[4,5-b]-pyridin
wird gesammelt.
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Stufe B: Herstellung von 2-[3,5-Di-(2-methylallyl)-phenyl]-oxazol
[4, 5-b ]pyridin Ein Gemisch aus 5 mMol des nach Stufe A hergestellten Produkts
und 11,0 mMol Triphenylphosphin in 15 ml Dimethylformamid wird 3 Stunden unter Rühren
und unter Stickstoff auf Rückflusstemperatur erhitzt. Das Gemisch wird gekühlt und
das Phosphoniumsalz abfiltriert. Ein Gemisch aus 4 mMol des Phosphoniumsalzes, 100
ml Äthanol, 1 ml Aceton und 40 ml 0,3n äthanolischer Lithiumäthylatlösung wird 2
Stunden unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zusatz von 100 ml Wasser
wird das Gemisch im Eisbad gekühlt. Der Niederschlag wird abfiltriert und durch
Chromatographie an Kieselsäuregel unter Verwendung von 2-prozentigem Methanol in
Chloroform zum Eluieren gereinigt.
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Man erhält 2-LD,5-Di-(2-methylallyl)-phenyl]-oxazol[4,5-b]-pyridin.
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Stufe C: Herstellung von 2-[3,5-Di-(isobutyl)-phenyl]-oxazol [4, 5-b
]pyridin 3 mMol des in Stufe B hergestellten Produkts werden in 25 ml Methanol in
Gegenwart von 500 mg 5-prozentigem Palladium auf Kohlenstoff bei einem Wasserstoffdruck
von 3 at hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockne
eingedampft. Der Rückstand wird aus n-Hexan umkristallisiert.
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Man erhält 2-[3,5~Di-(isobutyl)-phenyl]-oxazol[4,5-bgpyridinO B e
i s p i e 1 10 2- ( 3-tert. Butyl-2-methoxyphenyl) -oxazol [4, 5-b ]pyridin Stufe
A: Herstellung von 3-tert.Butyl-2-methoxytoluol Ein Gemisch aus 0,12 Mol 2-tert.Butyl-6-methylphenol
und 12,0 ml 10,On Natronlauge wird 1 Stunde unter Rühren auf dem Dampfbad erhitzt.
Das Wasser wird im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wird anteilweise unter Rühren
zu 0,24 Mol Dimethylsulfat zugesetzt und das Gemisch 6 Stunden bei 950 C und 15
Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zusatz einer Lösung von 0,25 Mol Natriumcarbonat
in 100 ml Wasser rührt man noch weitere 5 Stunden. Das Gemisch wird dreimal mit
Je 100 ml Äther extrahiert und der Extrakt getrocknet und zur Trockne eingedampft.
So erhält man 3-tert.Butyl-2-methoxytoluol.
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Stufe B: Herstellung von 3-tert.Butyl-2-methoxybenzoesäure Ein Gemisch
aus 0,01 Mol 3-tert.Butyl-2-methoxytoluol, 0,01 Mol Kaliumpermanganat und 100 ml
In Natronlauge wird auf Rückflusstemperatur erhitzt und dann jede Stunde mit weiteren
0,01 Mol Kaliumpermanganat versetzt, bis insgesamt 0,05 Mol zugesetzt worden sind
(4 Stunden) Nach weiterem 2-stündigem Sieden am Rückflusskühler wird das nicht umgesetzte
Ausgangsmaterial mit Wasserdampf abdestilliert. Zu dem Rückstand wird Äthanol zugesetzt,
um das überschüssige Permanganat zu zersetzen, und das Gemisch wird heiss filtriert.
Durch Ansäuern des
Filtrats mit Schwefelsäure fällt das Produkt
aus. Das Produkt wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält
3-tert.Butyl-2-methoxybenzoesäure.
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Stufe C: Herstellung von 2-(3-tert.Butyl-2-methoxyphenyl)-oxazol [4,
5-b ]pyridin Wenn man bei dem Verfahren des Beispiels 1 die 2-Methyl-3-chlorbenzoesäure
durch eine äquivalente Menge 3-tert.Butyl-2-methoxybenzoesäure ersetzt, erhält man
2-(3-tert.Butyl-2-methoxyphenyl)-oxazol[4,5-b]pyridin.
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Pharmakologische Daten und Prüfmethoden Prostaglandinsynthetasehemmung
Gefrorene Schafssamenbläschen werden aufgetaut, von Fett und Bindegewebe entblösst,
zerkleinert und in 0,125-molarem Natriumäthylendiamintetraacetatpuffer (pH 8,3;
1 Teil Bindegewebe auf 2 Teile Puffer) in einer "Polytron Model PT 10 ST"-Homogenisiervorrichtung
bei einer Impulsfrequenz von 7300 Hz 30 Sekunden homogenisiert. Der homogenisierte
Ansatz wird 10 Minuten mit 1200 x g zentrifugiert und die überstehende Phase durch
Gaze abdekantiert. Das grobe Filtrat wird als Quelle für das Prostaglandinsynthetase-Enzymsystem
verwendet.
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Das Enzympräparat wird in Anteile zu je 1,0 ml zerlegt, die bei -20°
C gelagert werden. Wenn das gefrorene Material auf diese Weise gelagert und für
jede Analyse immer nur ein Reagensglas aufgetaut wird, behält es mindestens 3 Monate
seine volle enzymatische Aktivität. Für die Versuche werden die Anteile von je 1,0
ml mitO,125-molarem Natriumäthylendiamintetraacetatpuffer (pH 8,3) auf das 10fach
verdünnt.
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Das Reaktionsgemisch, ein von Wallach und Daniels (1971) angegebenes
Gemisch in abgeänderter Form, besteht aus 500 y Rinderserumalbumin (Pentex, Fraktion
V), 5 x 10 4-molarem Hydrochinon, 2 x 10 3-molarem reduziertem Glutathion, 3 x 10
5-molarer
Arachidonsäure, 0,05 Mikrocurie (1-14C)-Arachidonsäure,
dem zu untersuchenden Mittel in 0,01 ml Methanol und 0,5 ml (1,2 mg Protein) des
Enzympräparats in einem endgültigen Volumen von 1,0 ml Natriumäthylendiamintetraacetatpuffer
(pH 8,3). Die Inkubationen werden je 30 Minuten bei 37°C in einer Schüttelmaschine
nach Dubnoff durchgeführt. Routinemässig werden 40 96 der radioaktiv markierten
Arachidonsäure in PGE2 umgewandelt.
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Jede Reaktion wird durch Zusatz von 0,4 ml Citronensäure (O,Zi-molar)
unterbrochen, und es werden 5 r PGE2, PGF2a und Arachidonsäure zugesetzt. Dann extrahiert
man zweimal mit je 2 ml Äthylacetat. Die vereinigte organische Phase wird mit 1
ml Wasser gewaschen und das Äthylacetat unter Stickstoff zur Trockne abgedampft.
Der Rückstand wird in Benzol gelöst und die Lösung auf einen 1 cm x 20 cm grossen
Streifen auf einer Kieselsäuregel G-Platte (Analtech) aufgegeben und in Andersen's
(1969) FVI-Lösungsmittelsystem, bestehend aus 90 Teilen Äthylacetat, 10 Teilen Aceton
und 1 Teil Essigsäure, chromatographiert. Nach der Einwirkung von Joddampf, um die
Prostaglandine sichtbar zu machen, wird die PGF2-Zone (Rf = 0,40) von der Dünnschichtchromatographieplatte
abgeschabt und zu einer aus 70 Teile Toluol und 30 Teilen Äthanol bestehenden Szintillationslösung
zugesetzt, die 3 g 2,5-Diphenyloxazol und 50 mg p-Bis-[2-(4-methyl-5-phenyloxazolyl]-benzol
je Liter enthält. In jeder Zone wird die Radioaktivität mit einem Packard Tri-Carb-Flüssigkeits-Szintillationsspektrometer
bestimmt.
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Prüfung auf durch Carrageenin induzierte Rattenpfotenentzündung Gruppen
von je 6 männlichen Ratten (Sprague Dawley-Stamm), 150 + 15 g) erhalten oral die
zu untersuchenden Verbindungen, und eine Stunde später wird den Ratten 0,1 ml einer
1-prozentigen Suspension von Carrageenin in die plantare Fläche der
rechten
Hinterpfote injiziert. Das Volumen des Fusses wird sofort und wiederum 3 Stunden
danach durch Verdrängung von Quecksilber gemessen und automatisch registriert. Der
Unterschied zwischen dem anfänglichen Volumen und dem Endvolumen ergibt die Grösse
des erzeugten Ödems. Die untersuchten Verbindungen werden in Suspension oder in
Lösung in 0,5-prozentigem Methocel (Methylcelluloseprodukt) appliziert, während
die Kontrolltiere nur Methocel erhalten.
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T a b e 1 1 e II Pharmakologische Ergebnisse
| Ödem PGE-Synthetasehemmung |
| n R 30 mg/kg 10 /ml 1 /ml 0,5 |
| b O . . ~ . |
| 7 2-Fluorphenyl 64 90 33 |
| n 3-Chlorphenyl 32 87 23 |
| p 2-C |
| hlorphenyl 38 86 36 |
| > 3-Methoxyphenyl 14 90 76 |
| 2-Methoxyphenyl 9 73 32 |
| P 2-Methylphenyl 0 89 20 |
| = 4-Chlor-2-fluorphenyl 19 72 34 |
| o 2,5-Difluorphenyl 18 80 14 |
| 2,6-Difluorphenyl 66 D 0 |
| < 3-Äthoxyphenyl 14 97 41 |
| a, |
| ç 3-Methylphenyl 19 28 |
| w 3,5-Dimethoxyphenyl 7 68 35 7 |
| 2,3-Dimethylphenyl 0 28 |
| ca |
| H |
- Fortsetzung der Tabelle II siehe Seite 15
Tabelle II (Fortsetzung)
| Ödem PGE:-Synthetasehemmung |
| R 30 mg/kg 10 /ml 1 /ml 0,5 0,2 |
| 1 2-Chlor-3-methyl- |
| phenyl 97 |
| 3, 5-Dimethylphenyl 15 46 |
| 3-tert.Butyl-5- |
| methylphenyl 95 |
| 3,5-Di-(tert.butyl)- |
| 1 phenyl 96 |
| bO |
| Q 2-Me thyl-3-methoxy- |
| phenyl 95 |
| q~ 6-Methyl-2-methyl-3- |
| chlorphenyl 94 |
| 3-Jodphenyl 84 |
| ro |
| :r 2-Chlor-3-methoxy- |
| E phenyl 88 |
| a> |
| 3-Fluor-2-methyl- |
| phenyl 40 |
| w) |
| g: 3-Chlor-5-methyl- |
| phenyl 86 |
| , 3-tert.Butylphenyl 98 95 |
| o 2-Methyl-3-chlor- |
| phenyl 0 - 92 83 |
| 3-Chlor-2,5-di- |
| methylphenyl 95 83 75 |
| 1 2-Chlor-5-tert butyl- |
| phenyl 99 |
| 1 3-tert.Butyl-5- |
| methoxyphenyl 95 |