DE2526596A1 - Methode zur behandlung von fluessigkeiten enthaltenden blutsubstanzen - Google Patents

Methode zur behandlung von fluessigkeiten enthaltenden blutsubstanzen

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DE2526596A1 DE19752526596 DE2526596A DE2526596A1 DE 2526596 A1 DE2526596 A1 DE 2526596A1 DE 19752526596 DE19752526596 DE 19752526596 DE 2526596 A DE2526596 A DE 2526596A DE 2526596 A1 DE2526596 A1 DE 2526596A1
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Description

Dr. F. Zumstein sen. - Or. E. Assmann - !Dr. R. Koenigsberger Dipl.-Phys. R. Holzbauer - Dipl.-lng. F. Klingseisen - Dr. F. Zumstein jun.
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8 MÜNCHEN 2.
BRÄUHAUSSTRASSE A
Case 3128
PAUL GÖRA1T SIGTARD LIiTDROOS, STOCKHOLM / SCHWEDEN
Methode zur Behandlung von Flüssigkeiten enthaltenden Blutsubstanzen
Die vorliegende Erfindung "bezieht sich auf eine Methode zur Behandlung von Flüssigkeiten enthaltenden Blutsubstanzen, besonders auf eine Methode, wie man aus solchen Flüssigkeiten das darin enthaltene Globin von Eisenprotoporfyrin oder des:sei£ Derivaten und/oder Spaltungsprodukten trennt.
Es ist bekannt, dass man im Labormassstab die Eisenkomponente und das Globin chromatographisch oder durch Extraktion voneinander trennt, wobei man Lösungsmittel wie Methylethylketon, Azeton und Dimethylformamid verwendet.
Das chromatographische Verfahren ist aber für den technischen Massstab weniger geeignet, und die Extraktion mit Lösungsmitteln ist für die Verwendung des gewonnenen Produktes als Futter oder Lebensmittel ungeeignet.
Durch die vorliegende Erfindung wird unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels mit dehydratisierenden Eigenschaften und unter Zusatz eines Mittels, das die Ionstärke vergrössert und/oder dehydratisierenden Effekt hat, wie Natriumchlorid, Natriumsulfat oder Ammoniumsulfat, Natriumbenzoat oder Polyglykol unter eventueller Beigabe eines pH-regulierenden Mittels wie anorganische Säuren (z.B. Salzsäure oder Schwefelsäure) oder organische Säuren (z.B. Essigsäure oder Zitronensäure) die Anwendung einer einfachen Prozesstechnik ermöglicht. Dadurch liefert die Erfindung eine technisch und Ökonomisch realisierbare Methode zur Trennung von Eisenkomponente
und Globin und gestattet die Verwendung des Globins für Futter und Lebensmittel.
Durch eine besondere Durchfuhrungsform der Methode wird gemäss der Erfindung zuerst ein Teil der Eisenkomponente, die beispielsweise als Aggregat in konzentrierten Lösungen oder an Protein-
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material adsorbiert vorliegt, vorzugsweise durch Zentrifugierung, abgespalten. Die Agglomeration kann durch Zusatz von Natriumchlorid gefördert werden. Aus der auf diese Art durch Zentrifugierung erhaltenehOberflüsslgkeit wird dann durch Zusatz von einem die Ionstärke vergrössernden und/oder dehydratisierenden Mittel das Globin ausgefällt, während die Eisenkomponente in gelöster und/oder feinzerteilter Form in der Flüssigkeitsphase zurückbehalten wird.
Das Milieu, das durch den hohen Gehalt an Lösungsmittel, wie beispielsweise Äthanol, und den niedrigen Gehalt an Wasser mit einer gewissen Ionstärke und einem niedrigen pH-Wert geschaffen wird, ist offenbar dafür geeignet, die feindispersen bzw. gelösten Formen der Eisenkomponente sowie ggf. Derivate und Zersetzungsprodukte von ihr in der Flüssigkeit zurückzubehalten, während sich das Globin abzentri· fugieren lässt.
Bevorzugt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Abtrennung der. Eisenprotoporfyrins und seiner Derivate oder Zersetzungs- bzw. Spaltungsprodukte, der sogenannten Eisenkomponente, von Globin, aus einer Blutsubstanzen enthaltenden Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet iat, daß die Flüssigkeit gekühlt wird, vorzugsweise auf eine Temperatur von O0O bis -200C, der pH-Wert der Flüssigkeit auf einen Wert unter 4,5, vorzugsweise auf einen Viert von 2,5 bis 4,5 eingestellt wird, ein organisches Lösungsmittel mit dehydratisierenden Eigenschaften zu dieser Flüssigkeit gefügt wird, beispielsweise Äthanol oder Mischungen von Äthanol mit Glykol oder Glycerin in einer Menge, die mindestens 40 Vol.-J» bezogen auf die , gesamte Flüssigkeitsmenge, vorzugsweise mindestens 75 Vol.-# beträgt, wobei die vorstehend genannte Temperatur beibehalten wird, und daß die ausgefällte Eisenkomponente von dieser Flüssigkeit abgetrennt wird, vorzugsweise durch Zugabe von Salzen, wie Kaliumchlorid oder Natriumeitrat, wonach das Globin aus der Flüssigkeit ausgefällt wird.
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Bevorzugt wird das organische Lösungsmittel in zwei Stufen zugesetzt, wobei in der ersten Stufe eine geringe Menge des Lösungsmittels zugesetzt wird und man vorzugsweise Natriumchlorid oder eine andere Substanz, die die Agglomeration und/oder Absorption der Teilchen der Eisenkomponente auf dem Proteinmaterial, das vorzugsweise denaturiert ist, begünstigt, zusetzt, worauf das erhaltene Agglomerat, z.B. durch Zentrifugieren atigetrennt wird, und wobei anschließend weiteres organisches Lösungsmittel in der zweiten Stufe zur Abtrennung des Globins von dem restlichen Teil der Eisenkomponente, der dann in gelöster und/oder fein dispergierter Form vorliegt, zugefügt wird.
Die Erfindung soll im folgenden anhand einiger £usführuhgs-.beispiele näher beleuchtet werden.
BEISPIEL 1
In 5 g:Hämoglobinlösung mit einem Trockensubstanzgehalt von 15% und einem Anteil von ca. 33% Äthanol mit einer Temperatur von -80C-wurde unter Umrühren und Kühlung eine Mischung aus 1,1 ml 1 M Salzsäure und 5 ml Wasser eingetropft. Nach diesem Zusatz betrug die Temperatur -70C, und der pH-Wert war 2,5.
Dann wurden unter Kühlung bis zu -100C 80 ml 94%iges Äthanol tropfenweise zugesetzt. Das Globin wurde durch Zusatz von 0,3 ml Ammoniumsulfat in 20%iger Wasserlösung ausgefällt und mit 8000 χ g in 10 Minuten abzentrifugiert. Die Oberflüssigkeit war stark braun und die Paste grau. Die Paste wurde in 85%igem Äthanol von -100C und einem pH-Wert von 3,1 gewaschen und abzentrifugi-ert, wobei man ca. 2,4 g Paste mit einem Trockensubstanzgehalt von 23% gewann.
BEISPIEL 2
In eine Lösung aus 36 ml 94%igem Äthanol, 6 ml Wasser und 0,55 ml 1 M Salzsäure von -120C wurden unter Umrühren und Kühlung 2,5 g Hämoglobinlösung (Angaben wie in Beispiel 1) eingetropft. Nach dem Zusatz betrug die Temperatur -120C, und der pH-Wert war 3,0.
Danach wurden 45 ml 94%iges Äthanol zugegeben, und die Flüssigkeit wurde 10 Minuten lang mit 8000 χ g zentrifugiert,
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wobei weniger als o,1 g Paste gewonnen wurden.
Das Globin wurde durch Zusatz von 0,4 ml einer 20%igen Ammoniumsulfatlösung ausgefällt. Der pH-Wert wurde mittels Salzsäure auf 3,0 justiert. Der Niederschlag wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 abzentrifugiert, wobei sich 0,45 g Paste mit einem Trockensubstanzgehalt von 36% ergaben.
Aus der Oberfltissigkeit wurde ausserdem durch Zusatz von 0,4 ml Ammoniumsulfat Material ausgefällt, wobei man 0,40 g Paste mit einem Trockensubstanzgehalt von 42% erhielt.
Die Pasten sahen hellgrau aus. Die Oberfltissigkeit war stark bräunlich und ergab mit Trichloressigsäure keinen Niederschlag.
BEISPIEL 3
In eine Lösung aus 20 ml 94%igem Äthanol und 1,1 ml 1 M Salzsäure mit einer Temperatur von -150C wurden unter Umrühren und Kühlung 5 g Hämoglobinlösung (Angaben wie in Beispiel 1) eingetropft. Nach dem Zusatz war die Temperatur -150C und der pH-Wert 2,9.
Die Mischung wurde 20 Minuten mit 27000 χ g zentrifugiert, wobei 0,9 g schwarze Paste mit einem Trockensubstanzgehalt von 8,3% gewonnen wurden.
Der kräftig braun gefärbten Oberflüssigkeit wurden unter Umrühren und Kühlung 50 ml 94%iges Äthanol bei einer Temperatur von -150C zugesetzt, und das Material wurde durch Zugabe von 10 ml Wasser und 1,2 ml 20%igem Ammoniumsulfat ausgefällt.
Der Niederschlag wurde mit 8000 χ g in 10 Minuten abzentrifugiert, die gewonnene Paste in 94%igem Äthanol mit einer Temperatur von -150C aufgeschlämmt und wie oben abzentrifugiert. Hierbei ergaben sich 1,6 g Paste mit einem Trockensubstanzgehalt von 37» In.trockenem Zustand war die Paste hellgrau.
Die Oberfltissigkeit des Niederschlags ergab mit Trichloressigsäure keinen Niederschlag.
BEISPIEL 4
In eine Lösung von 40 ml 94%igem Äthanol und 1,1 ml 1 M Salzsäure mit einer Temperatur von -150C wurden unter Umrühren und Kühlung tropfenweise 5 mg Hämoglobinlösung (Angaben wie in Beispiel 1 gegeben. Nach dem Zusatz betrug die Temperatur -150C, und der pH-Wert war 2,9.
In diese Mischung wurden 5 ml 20%iges Natriumchlorid einge-
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tropft, und die Flüssigkeit wurde mit 27000 χ g 20 Minuten lang zentrifugiert, wobei 1,4g schwarze Paste mit einem Trockensubstanzgehalt von 11 % gewonnen wurden.
Zu der Oberflüssiglceit wurden 12 ml Wasser und 1 ml 20%ige Ammoniumsulfatlösung gegeben, und dann wurde die Flüssigkeit mit 8000 χ g 10 Minuten lang zentrifugiert. Hierbei erhielt man 3,8 g graue Paste mit einem Trockensubstanzgehalt von 14,6%. BEISPIEL 5
Nach diesem Beispiel wurde eine Extraktion der Eisenkomponente aus einem Globinniederschlag vorgenommen.
In 5 g Hämoglobinlösung (mit Angaben wie in Beispiel 1) mit einer Temperatur von -80C wurde unter Umrühren und Kühlung eine Mischung aus 11 ml Wasser, 4 ml Äthanol und 1 ml 1 M Salzsäure mit einer Temperatur von -6°C eingetropft. Nach diesem Zusatz betrug die Temperatur -40C, und der pH-Wert war 2,9. Der pH-Wert wurde mittels 7 ml 0,1 M Natriumhydroxidlösung auf 3,9 Justiert. Der Niederschlag wurde durch Zusatz von 0,2 g Ammoniumsulfat erreicht, und die stark braun gefärbte Paste wurde mit ca. 300 χ g abzentrifugiert. Die lose Paste schlämmte man mehrere Male in kleinen Mengen 3A%igem Äthanol bei pH = 3 und einer Temperatur von -120C auf und zentrifugierte sie ab.
Hierbei gewann man 3,05 g graue Paste mit einem Trockensubstanzgehalt von 1B,8%.
BEISPIEL 6
Aus 5 g Hämoglobinlösung (mit Angaben wie in Beispiel 1) wurde das Hämoglobin durch Zusatz von 10 ml 94%igem Äthanol unter Umrühren und Kühlung bis auf eine Temperatur von -60C ausgefällt. Der Niederschlag wurde 5 Minuten lang mit 2000 χ g zentrifugiert, wobei man 6 g rote Paste gewann. Am Boden des Zentrifugenrohres hatte sich eine kleinere Menge schwarze Paste abgesetzt.
Zu der roten Paste gab man unter Umrühren und Kühlung eine Lösung aus 70 ml 94%igem Äthanol und 1,1 ml 1 M Salzsäure mit einer Temperatur von -120C. Nach diesem Zusatz betrug der pH-Wert 2,9 und die Temperatur -120C. Die Mischung wurde mit 27000 χ g 10 Minuten lang zentrifugiert, wobei man eine kleinere Menge schwarze Paste erhielt.
Zur Oberflüssigkeit gab man 2,0 ml einer 40%igen Ammoniumsulfatlösung und 10 ml Wasser. Die Temperatur war -80C und der
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pH-Wert 3,4.
Der graue Niederschlag wurde 10 Minuten mit 8000 χ g zentrifugiert, wobei 1,5 g graue Paste mit einem Trockensubstanzgehalt von 39,3% gewonnen wurden.
BEISPIEL 7
Zu einer Lösung aus 20 ml 94%igem Äthanol und 1,1 ml 1 M Salzsäure mit einer Temperatur von -120C gab man tropfenweise unter Umrühren und Kühlung 5 g Hämoglobinlösung (mit Angaben wie in Beispiel 1). Nach der Zugabe betrug der pH-Wert 2,9,und die Temperatur war -120C, Diese schwarz-braune Mischung wurde mit 27000 χ g 10 Minuten lang zentrifugiert, wobei 2,2 g schwarze Paste mit einem Trockensubstanzgehalt von 2,7% und eine hellbraune Oberflüssigkeit, die später eine gelartige Konsistenz annahm, gewonnen wurden.
In die Oberflüssigkeit wurden unter Umrühren und Kühlung 70 ml 94%iges kaltes Äthanol und danach 0,8 ml 40%ige Ammoniumsulfatlösung und 8 ml Wasser eingetropft. Danach betrug die Temperatur -60C.
Der Niederschlag wurde 10 Minuten mit 8000 χ g zentrifugiert, wobei sich 1,7 g weisse Paste mit einer Trockensubstanz von 36% ergaben.
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Claims (2)

  1. Patentansprüche
    (J\ Verfahren zur Abtrennung des Eisenprotoporiyrins und seiner Derivate oder Zersetzungs- bzw. Spaltungsprodukte, der sogenannten Eisenkomponente, von Globin, aus einer Blutsubstanzen enthaltenden Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit gekühlt wird, vorzugsweise auf eine Temperatur von O0C bis -200C, der pH-Wert der Flüssigkeit auf einen Wert unter 4,5, vorzugsweise auf einen Wert von 2,5 bis 4,5 eingestellt wird, ein organisches Lösungsmittel mit dehydratisierenden Eigenschaften zu dieser Flüssigkeit gefügt wird, beispielsweise Äthanol oder Mischungen von Äthanol mit Glykol oder Glycerin in einer Menge, die mindestens 40 YoI.-fo bezogen auf die gesamte Flüssigkeitsmenge, vorzugsweise mindestens 75 Vol.-^ beträgt, wobei die vorstehend genannte Temperatur beibehalten wird, und daß die ausgefällte Eisenkomponente von dieser Flüssigkeit abgetrennt wird, vorzugsweise durch Zugabe von Salzen, wie Kaliumchlorid oder Natriumcitrat, wonach das Globin aus der Flüssigkeit ausgefällt wird.
  2. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel in zwei Stufen zugesetzt wird, wobei in der ersten Stufe eine geringe Menge des Lösungsmittels zugesetzt wird und man vorzugsweise Natriumchlorid oder eine andere Substanz,die IfAl
    IfAgglomeration und/oder Absorption der Teilchen der Eisenkomponente auf dem Proteinmaterial, das vorzugsweise denaturiert ist, begünstigt, zusetzt, worauf das erhaltene Agglomerat, z.B. durch. Zentrifugieren abgetrennt wird, und wobei anschließend weiteres organisches Lösungsmittel in der zweiten Stufe zur Abtrennung des Globins von dem restlichen Teil der Eisenkomponente, der"dann in gelöster und/oder fein dispergierter Form vorliegt, zugefügt wird.
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DE2526596A 1974-06-14 1975-06-13 Verfahren zur Abtrennung von Eisenverbindungen, die vom Hämoglobin stammen, von Globin in einer Blutsubstanzen enthaltenden Flüssigkeit Expired DE2526596C2 (de)

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