DK150173B - Fremgangsmaade til separering af den saakaldte jernkomponent fra globin - Google Patents

Description

- i - 150173

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til separering af jernprotoporfyrin og/eller derivater eller spaltningsprodukter deraf, den såkaldte jernkomponent fra globin i væske indeholdende blodsubstanser.

5 Det er kendt under laboratorieforhold at separere jernkomponenten og globinet kromatografisk eller ved ekstraktion, hvorved man benytter et opløsningsmiddel såsom methyl-ethylketon, acetone eller dimethylformamid.

Den kromatografiske metode er mindre egnet i teknisk 10 skala, og ekstraktion med opløsningsmiddel er uegnet, hvis det opnåede produkt skal benyttes som dyrefoder.

Formålet med opfindelsen er at anvise en fremgangsmåde, som er såvel teknisk som økonomisk realiserbar til separering af jernkomponenten fra globinet, og som tillader an-15 vendelse af globinet til foderformål.

Dette opnås ifølge opfindelsen ved, at væsken nedkøles fortrinsvis til en temperatur mellem 0°C og -20°C, at pH-værdien justeres til mindre end 4,5, fortrinsvis til 2,5 - 4.5, at væsken tilsættes ethanol i en mængde svarende til 20 mindst 40, fortrinsvis 75 volumenprocent, af den samlede væskemængde, under opretholdelse af den ovennævnte temperatur, at udfældet jernkomponent fraskilles, eventuelt efter tilsætning af natriumchlorid, hvorefter globinet udfældes af opløsningen og fraskilles ved centrifugering.

25 Udfældningen af globinet kan eksempelvis ske ved tilsætning af en ammoniumsulfatopløsning eller et andet sædvanligt fældningsmiddel, eller ved at pH-værdien ændres til 7.5, som er det isoelektriske punkt for globin.

Det miljø, der skabes ved det høje indhold af ethanol, 30 og det lave indhold af vand med en vis ionstyrke og lavt pH, er tydeligvis egnet til at holde den findisperse henholdsvis opløste form af jernkomponenten og eventuelle derivater og spaltningsprodukter af denne tilbage i væsken, medens globinet lader sig fracentrifugere.

35 Opfindelsen skal i det følgende belyses nærmere ved hjælp af eksempler.

- 2 - 150173

Eksempel 1

Til 5 g hæmoglobinopløsning med et tørsubstansindhold på 15% og indeholdende ca. 33% ethanol ved en temperatur på -8°C dryppes under omrøring og køling en blanding af 5 1,1 ml 1M saltsyre og 5 ml vand. Efter tilsætningen var temperaturen -70C og pH = 2,5.

80 ml 94% ethanol tilsættes dråbevis under køling til -10°C. Globin udfældes ved tilsætning af 0,3 ml ammoniumsulfat i 20% vandopløsning og centrifugeres af ved 8000 g 10 i 10 minutter. Overvæsken er stærkt brun og pastaen grå.

Pastaen vaskes i 85% ethanol ved -10°C og pH = 3,1 og centrifugeres af. Herved opnås 24 g pasta med et tørsubstansindhold på 23%.

Eksempel 2 15 Til en opløsning af 36 ml 94% ethandi, 6 ml vand og 0,55 ml 1M saltsyre ved -12°C dryppes under omrøring og køling 2,5 g hæmoglobinopløsning (som den i eksempel 1 nævnte). Efter tilsætningen er temperaturen -12°C og pH = 3,0.

20 Herefter tilsættes 45 ml 94% ethanol, og væsken centri fugeres ved 8000 g i 10 minutter, hvorved der opnås en pastamængde mindre end 0,1 g.

Globinet udfældes ved tilsætning af 0,4 ml 20% ammo-niumsulfatopløsning. pH justeres til 3,0 ved hjælp af 25 saltsyre. Udfældningen afcentrifugeres på den i eksempel 1 angivne måde. Herved opnås 0,45 g pasta med et tørsubstansindhold på 36%.

Af overvæsken udfældes yderligere materiale ved tilsætning af 0,4 ml ammoniumsulfat, hvorved 0,40 g pasta med 30 et tørsubstansindhold på 42% opnås.

Pastaerne er lysegrå. Overvæsken er stærkt brunfarvet og giver ikke udfældning med trichloreddikesyre.

Eksempel 3

Til en opløsning af 20 ml 94% ethanol og 1,1 ml 1M 35 saltsyre ved en temperatur på -15°C dryppes under omrøring og køling 5 g hæmoglobinopløsning (som den i eksempel 1 angivne). Efter tilsætning er temperaturen stadig -15°C og pH = 2,9.

150173 - 3 -

Blandingen centrifugeres ved 27000 g i 20 minutter, hvorved der opnås en sort pasta på 0,9 g og med et tør-substansindhold på 83%.

Til den kraftigt brunfarvede overvæske tilsættes un-5 der omrøring og køling 50 ml 94% ethanol ved en temperatur på -15°C, og materialet udfældes ved tilsætning af 10 ml vand og 1,2 ml 20% ammoniumsulfat.

Udfældningen centrifugeres ved 8000 g i 10 minutter, og den opnåede pasta opslæmmes i 94% ethanol (ved -15°C) 10 og centrifugeres af som ovennævnt. Herved opnås 1,6 g pasta med et tørsubstansindhold på 37,6%. I tør tilstand er pastaen lysegrå.

Overvæsken fra udfældningen giver ikke udfældning med trichloreddikesyre.

15 Eksempel 4

Til en opløsning af 40 ml 94% ethanol og 1,1 ml 1M saltsyre ved -15°C dryppes under omrøring og køling 5 g hæmoglobinopløsning (som den i eksempel 1 angivne). Efter i tilsætningen er temperaturen stadig -15°C og pH = 2,9.

20 Til blandingen dryppes 5 ml 20% natriumchlorid, og væ sken centrifugeres ved 27000 g i 20 minutter, hvorved der opnås 1,4 g sort pasta med et tørsubstansindhold på 11%.

Til overvæsken sættes 12 ml vand og 1 ml 20% ammoniumsul fatopløsning, hvorefter væsken centrifugeres ved 8000 g 25 i 10 minutter. Herved opnås en grå pasta på 3,8 g og med et tørsubstansindhold på 14,6%.

Eksempel 5 I dette tilfælde udføres en ekstrahering af jernkomponenten af en globinudfældning.

30 Til 5 g hæmoglobinopløsning (som den i eksempel 1 an givne) ved -8°C dryppes under omrøring og køling en blanding af 11 ml vand, 4 ml ethanol og 1 ml 1M saltsyre med en temperatur på -6°C. Efter tilsætningen er temperaturen -4°C og pH = 2,9. pH-værdien justeres til 3,9 ved hjælp 35 af 7 ml 0,1 M natriumhydroxidopløsning. Fældning foretages ved tilsætning af 0,2 g ammoniumsulfat, og den stærkt brunfarvede pasta centrifugeres af ved ca. 300 g. Den løse - 4 - 150173 pasta slæmmes gentagne gange op i små mængder 94% ethanol ved pH = 3 og en temperatur på -12°C og centrifugeres af.

Herved opnås 3,05 g grå pasta med et tørsubstansind-hold på 18,8%.

5 Eksempel 6

Af 5 g hæmoglobinopløsning (som den i eksempel 1 angivne) udfældes hæmoglobinet ved tilsætning af 10 ml 94% ethanol under omrøring og køling til en temperatur på -6°C. Udfældningen centrifugeres af ved 2000 g i 5 minut-10 ter, hvorved der opnås 6 g rød pasta. I bunden af centrifugerøret afsættes en mindre mængde sort pasta.

Den røde pasta sættes til en opløsning af 70 ml 94% ethanol og 1,1 ml 1M saltsyre med en temperatur på -12°C under omrøring og køling. Efter tilsætningen er tempera-15 turen -12°C og pH = 2,9. Blandingen centrifugeres ved 27000 g i 10 minutter, hvorved der opnås en mindre mængde sort pasta.

Til overvæsken sættes 2,0 ml 40% ammoniumsulfatopløs-ning og 10 ml vand. Temperaturen er· -8°C og pH = 3,4.

20 Den grå udfældning centrifugeres af ved 8000 g i 10 minutter, hvorved der opnås 1,5 g grå pasta med et tørsub-stansindhold på 39,3%.

Eksempel 7

Til en opløsning af 20 ml -94% ethanol og 1,1 ml 1M 25 saltsyre dryppes ved -12°C under omrøring og køling 5 g hæmoglobinopløsning (som den i eksempel 1 angivne). Efter tilsætningen er pH = 2,9 og temperaturen -12°C. Blandingen, der er brun-sort, centrifugeres ved 27000 g i 10 minutter. Herved opnås 2,2 g sort pasta med et tørsubstans-30 indhold på 2,7% og en lysebrun overvæske, der senere antager en gellignende konsistens.

Til overvæsken dryppes under omrøring og køling 70 ml 94% kold ethanol og siden 0,8 ml 40% ammoniumsulfatopløs-ning og 8 ml vand. Efter tilsætningen er temperaturen 35 "6°C.

Ved centrifugering (8000 g i 10 minutter) af udfældningen opnås 1,7 g hvid pasta med et tørsubstansindhold på 36%.