DE2502095B2

DE2502095B2 - Verfahren zur Reinigung von Urokinase

Info

Publication number: DE2502095B2
Application number: DE2502095A
Authority: DE
Inventors: Satoshi Katano Funakoshi; Yahiro Ikeda Uemura; Katuhiro Sakai Uriyu
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1974-01-22
Filing date: 1975-01-20
Publication date: 1978-06-29
Also published as: DE2502095A1; SE7500629L; FR2258396B1; CH611314A5; AU7688374A; IN139029B; AT341079B; FR2258396A1; SE434956B; AU474513B2; CA1028262A; ATA43475A; ES433961A1; DE2502095C3; GB1476092A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Urokinase, mit dem sich aus wäßrigen, rohen Urokinasdösungen, wie menschlichem Urin, hochgereinigte Urokinase in hohen Ausbeuten erhalten läßt.

Die im menschlichen Urin auftretende Urokinase katalysiert! die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin, welches zur Auflösung von Fibringerinnseln in der Lage ist. Gereinigte Urokinase wird klinisch in großem Umfang zur Therapie von peripheren arteriellen und venösen Thrombosen und Myokardinfarkten, die auf die Bildung von Fibringerinnseln in Blutgefäßen zurückzuführen sind, verwendet.

Zur Anreicherung und Reinigung von Urokinase aus menschlichem Urin wurden bisher verschiedene Absorptionsmaterialien, wie Schwermetallverbindüngen, Bariumsulfat, Kieselsäure und ihre Salze sowie Ionenaustauscher verwendet; vgl. US-PSen 3 542646 iund 2983 647. Die herkömmlichen Verfahren, bei denen die genannten Adsorptionsmittel in Kombination miteinander verwendet werden, sind nicht nur sehr langwierig, sondern ermöglichen auch nur geringe Ausbeuten.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches Verfahren zur Gewinnung von hochgereinigter Urokinase zur Verfugung zu stellen, das in guten Ausbeuten verläuft. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Die Erfindung betrifft somit die in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstände.

Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß wasserunlösliche Polysaccharide, die Agarose und Agaropectin als Hauptbestandteil enthalten, sich ausgezeichnet als selektive Adsorptionsmittel für Urokinase eignen.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können als Urokinasequellen menschlicher Urin oder Präparate, die nach den erfindungsgemäßen Verfahren oder nach einem herkömmlichen Verfahren teilweise gereinigt sind, verwendet werden. Wasserunlösliche Polysaccharide, die Agarose und Agaropectin als Hauptbestandteile enthalten, weisen einen Agaroseanteil von mindestens 50% auf. In der Praxis ist es zweckmäßig, billiges Agar bzw. handelsübliche Sepharosearten, die hauptsächlich aus Agarose bestehen und bisher als Molekularsiebe eingesetzt wurden, zu verwenden. Agar besteht zu etwa 70% aus Agarose und etwa 30% Agaropectin und ist bekanntlich sehr stabil und billig. Da Agar zu guten Ergebnissen bei der Reinigung von Urokinase führt, ist dessen Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren empfehlenswert. Pulverförmiges Agar wird als solches eingesetzt, während schwammiges Agar in Form von kleinen Stücken verwendet wird, um die Adsorptionsfähigkeit zu steigern.

Im erfindungsgemäßen Verfahren entfalten die eingesetzten Sepharosepräparate eine spezifische Adsorptionswirkung, die von der vorgenannten Molekularsiebwirkung vollkommen verschieden ist.

Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß Agar und Sepharosepräparate Urokinase bei einem schwach sauren bis neutralen pH-Wert selektiv adsorbieren. Urokinase wird bei einem pH-Wert von etwa 4,0 bis 7,0 vorzugsweise 5,0 bis 6,0 selektiv an den vorgenannten wasserunlöslichen Polysacchariden adsorbiert.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine wäßrige Urokinaselösung, wie menschlicher Urin, vorzugsweise mit puffernd wirkenden Salzen auf den vorgenannten pH-Bereich eingestellt und anschließend mit Agar, einem Sepharose-

präparat oder einem ähnlichen wasserunlöslichen Polysacchajrid, das Agarose und Agaropectin als Hauptbestandteile enthält und vorher beim gleichen pH-Wert vorzugsweise mit einer Pufferlösung vom vorgenannten pH-Wert äquilibriert worden ist, in Kontakt gebracht. Dies kann so durchgeführt werden, daß die Urokinaselösung über eine mit dem Polysaccharid beschickte Säule gegeben wird oder ein Gemisch aus dem Polysaccharid und der Urokinaselösung einfach gerührt wird. Die Salzkonzentration liegt dabei bei etwa 0,03 bis 0,15 m. Die Aufnahme der Urokinase bei derartig geringen Konzentrationen erleichtert die anschließende Elution mit einer höher konzentrierten Salzlösung.

Das Polysaccharid mit der adsorbierten Urokinase wird anschließend mit einer wäßrigen alkalischen Lösung oder einer wäßrigen, höher konzentrierten Lösung eines Neutralizes oder einer neutralen Aminosäure in Kontakt gebracht, wobei die Urokinase selektiv eluiert wird. Es können dabei wäßrige alkalische Lösungen mit einem pH-Wert von etwa 8,0 bis 11,0, vorzugsweise 8,0 bis 10,5 verwendet werden. Bevorzugt sind etwa 2- bis 4prozentige wäßrige Ammoniaklösungen oder wäßrige Alkalilösungen, deren Gehalt an einem anorganischen Salz, wie Ammoniumsulfat, Natriumphosphat oder Natriumchlorid, etwa 0,01 bis 0,15 m oder an einer Aminosäure, wie Glycin, Arginin oder Histidin, etwa 0,05 bis 2% (Gew./Vol.) beträgt. Als höherkonzentrierte wäßrige Salzlösung können 0,2 bis 2 m Lösungen eines anorganischen Salzes verwendet werden. Bevorzugt sind beispielsweise Natriumchloridlösungen mit einer Konzentration vo.i etwa 1 m, Ammoniumsulfatlösungen mit einer Konzentration von etwa 0,5 m und Lösungen von neutralen Aminosäuren mit einer Konzentration von etwa 5 bis 10% (Gew./Vol.).

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird der Reioigungs- und Anreicherungseffekt durch das Auswaschen von Verunreinigungen aus dem mit Urokinase beladenen Adsorptionsmittel verstärkt.

Als Waschlösung kann Wasser vom pH-Wert unter 7 verwendet werden. Im allgemeinen wird aber die gleiche neutrale oder schwach saure Lösung, die zur Adsorption der Urokinase eingesetzt wird, verwendet. Beispielsweise kann eine 0,05 m Natriumchlorid- oder Natriumphosphatlösung mit einem pH-Wert von 5,5 bis 6,5 verwendet werden. Es wurde festgestellt, daß die selektive Entfernung von Verunreinigungen noch weiter durch Zugabe von bestimmten Aminosäuren oder Salzen von Aminosäuren zur Waschflüssigkeit erhöht wird. In dieser Richtung wirkt beispielsweise eine Lösung eines anorganischen Salzes vom pH-Wert 5,5 bis 6,5, die 0,05 bis 0,1 m an Lysin, ε-Aminocapronsäure, Glycin, Serin, Cystein, Histidin oder Arginin ist. Unter diesen Aminosäuren wird Lysin besonders bevorzugt, da seine Wirkung bereits bei niedrigen Konzentrationen eintritt.

Die Adsorptions-, Elutions- und Waschvorgänge des erfindungsgemäßen Verfahrens können auf übliche Weise durchgeführt werden. Vorzugsweise wird dabei die zu behandelnde wäßrige Lösung über eine mit einem Adsorptionsmittel beschickte Säule gegeben. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eluierte Urokinaselösung wird gegebenenfalls gegen Wasser oder eine isotone Lösung dialysiert und dann in entsprechender Reihenfolge eingeengt und steril filtriert, wodurch man zu physiologisch verträglichen Urokinasepräparaten gelangt. Diese Präparate kön

nen in gefriergetrocknetem Zustand gelagert werden und vor ihrer Verwendung zu Lösungen verarbeitet werden.

Die Reinheit der Urokinase wird durch Messung der enzymatischen Aktivität der eluierten Urokinaselösung gemäß dem von Ploug angegebenen Verfahren berechnet; vgl. Biochem. Biophys. Acta., Bd. 24 (1957), S. 278. Dabei erhält man Ploug-Einheiten pro mg Protein. Diese Einheiten werden im folgenden als »spezifische Aktivität« bezeichnet. Das Verhältnis der spezifischen Aktivitäten von gereinigter Urokinase und dem Ausgangsmaterial ergibt den erreichten Reinigungsfaktor. Die Ausbeute kann ebenfalls auf diese Weise unter Zugrundelegung der Gesamtenzymeinheiten berechnet werden. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man aus menschlichem Urin in einem Reinigungsschritt Urokinase mit einer spezifischen Aktivität von 7000 bis 10000 Einheiten/mg. Dementsprechend gelangt man aus teilweise gereinigten Urokinasepräparaten mit einer spezifischen Aktivität von 300 bis 500 Einheiten/mg zu hochgereinigten Urokinasepräparaten mit spezifischen Aktivitäten von 20000 bis 30000 Einheiten/mg und Reinigungsfaktoren von mehr als 30, wobei der Reinigungsfaktor von der Reinheit der als Ausgangslösung verwendeten Urokinaselösung abhängt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich leicht zur Injektion geeignete Präparate erhalten, wenn man nacheinander menschlichen Urin und gereinigte Urokinasepräparate einsetzt.

Die Agarose und Agaropectin als Hauptbestandteile enthaltenden wasserunlöslichen Polysaccharide, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, können ohne Verlust ihrer Adsorptionseigenschäften nach Waschen mit einer verdünnten und leicht alkalischen oder neutralen Lösung, wie 0,05 m Natriumchloridlösung vom pH-Wert 7,2 wiederverwendet werden.

Unter dem Ausdruck »%« (Gew./Vol.) sind Gewichtsteile des gelösten Stoffs in 100 Volumteilen Lösung zu verstehen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Die Urokinase-Einheiten werden gemäß Ploug bestimmt; vgl. Biochem. Biophys. Acta. Bd. 24 (1957), S. 278.

Beispiel 1

Eine Suspension von 10 g pulverförmigem Agar in 1000 ml kaltem Wasser wird 30 Minuten stehengelassen. Anschließend wird der Überstand abdekantiert und verworfen. Der Niederschlag wird in eine Säule der Abmessungen 3 X 15 cm gegeben. Über die Säule werden 200 ml einer 0,15 m Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 5,0 gegeben. Anschließend werden 50 ml einer teilweise gereinigten Urokinase aus frischein menschlichem Urin (550 Einheiten/mg, 250 Einheiten/ml) im vorgenannten Phosphatpuffer auf die Säule aufgesetzt. Die Urokinase wird dabei adsorbiert, während Verunreinigungen die Säule ohne Adsorption passieren. Sodann wird die Säule mit etwa 100 rnl Wasser gewaschen. Schließlich wird die Urokinase mit 100 ml einer 1 η Natriumchloridlösung eluiert. Die die Urokinase enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und über Nacht gegen eine isotone Kochsalzlösung dialysiert.

Die auf diese Weise erhaltene Urokinase weist eine spezifische Aktivität von 17000 Einheiten/mg auf. Der Reinigungsfaktor beträgt 31 und die Ausbeute 82%.

Beispiel 2

Eine Suspension von 5 g Agarpulver in 250 ml heißem Wasser wird durch 20minütiges mäßiges Erhitzen in eine Lösung verwandelt. Nach ticm Abfiltrieren unlöslicher Bestandteile unter Verwendung von Filterpapier wird das Filtrat in einem anderen Gefäß abgekühlt und sodann bei — 30° C vollständig eingefroren. Das gefrorene Agar wird allmählich in warmem Wasser geschmolzen, wodurch man poröses, schwammiges Agar erhält, das in Stücke von 0,1 bis 1 cm³ geschnitten wird.

Menschlicher Urin wird auf den pH-Wert 9,0 eingestellt und von unlöslichen Bestandteilen abzentrifugiert. Anschließend wird das vorgenannte schwammige Agar in 1000 ml des geklärten Urins gegeben. Der pH-Wert des Gemisches wird mit der entsprechenden Menge Salzsäure auf 6,0 eingestellt. Anschließend wird 1 Stunde bei Raumtemperatur mäßig gerührt. Dabei wird die im Urin enthaltene Urokinase am schwammigen Agar adsorbiert. Während dieser Zeit wird das schwammige Agar gelegentlich zusammengedrückt, um die Absorption der Urokinase zu fördern. Mit Hilfe von Gaze wird sodann das schwammige Agar abfiltriert. Anschließend wird mit etwa 500 ml einer 0,05 m Natriumchloridlösung vom pH-Wert 5,0, die 0,1 m an Lysin ist, und sodann mit etwa 1000 ml kaltem destilliertem Wasser gewaschen. Hierauf wird die adsorbierte Urokinase mit 200 ml einer 0,5 m Ammoniumsulfatlösungeluiert. Das Eluat wird aufgefangen und gegen 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 dialysiert. Man erhält 200 ml dialysierte Urokinaselösung. Die spezifische Aktivität der auf diese Weise erhaltenen Urokinase beträgt 9000 Einheiten/mg.

Beispiel 3

Das in Beispiel 2 verwendete schwammige Agar wird in eine Säule der Abmessungen 3 X 15 cm gefüllt, mit etwa 1000 ml einer 0,05 m Natriumchloridlösung vom pH-Wert 7,2 und sodann mit etwa 100 ml 0,03 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 gewaschen. Anschließend wird eine Lösung von 55 mg roher, aus menschlichem Urin gewonnener Urokinase (spezifische Aktivität 370 Einheiten/mg) in 20 ml kaltem Wasser auf die Säule aufgesetzt, wobei die Urokinase am Agar adsorbiert wird. Sodann wird die Säule mit etwa 500 ml 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 mit einem Gehalt an 0,05 m ε-Aminocapronsäure und hierauf mit 500 ml 0,1 m Phosphatpuffer gewaschen. Schließlich wird die Urokinase mit 0,1 m Natriumphosphatlösung vom pH-Wert 9,0 eluiert, und die die Urokinase enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. Man erhält auf diese Weise Urokinase mit einer spezifischen Aktivität von 24 000 Einheiten/mg. Der Reinigungsfaktor beträgt 65 und die Ausbeute 82%.

Beispiel 4

Eine Suspension von 100 ml Sepharose in kaltem Wasser wird 1 Stunde stehengelassen. Anschließend wird der Überstand zusammen mit noch suspendierter feiner Sepharose abdekantiert. Der Niederschlag wird in eine Säule der Abmessungen 3 x 15 cm gefüllt. Diese Säule wird mit 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 äquilibriert. Anschließend werden 3 Liter frischer Urin von erwachsenen männlichen Personen mit 0,5 η Salzsäure auf den pH-Wert 6,0 eingestellt und sodann über die Säule gegeben. Dabei wird die Urokinase selektiv adsorbiert, während der Hauptanteil der Verunreinigungen die Säule passiert. Die nuf ά^α,τ Säule verbliebenen Verunreinigungen lassen sich durch Waschen mit 200 ml 0,05 m Natriumchloridlösung mit einem Gehalt an 0,05 m Lysin-hydrochlorid im wesentlichen entfernen. Anschließend wird die Urokinase mit 100 ml 2prozentiger Ammoniaklösung vom pH-Wert 10,5 eluiert. Die erhaltenen Urokinase-Fraktionen werden gefriergetrocknet. Man erhält 0,5 mg Urokinase mit einer spezifischen Aktivität von 9400 Einheiten/mg.

Beispiel 5

is 700 ml Sepharose werden mit 2000 ml kaltem destilliertem Wasser gewaschen. 30 Liter frischer Urin wird von männlichen erwachsenen Personen gesammelt und mit 10 Liter kaltem Wasser (praktisch neutral) verdünnt. Der verdünnte Urin wird mit der Sepharose vermischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, wobei die Urokinase an der Sepharose adsorbiert wird. Nach dem Abfiltrieren der Sepharose mit Hilfe von Filterpapier wird sie mit 1000 ml kaltem destilliertem Wasser und anschließend mit 1000 ml 0,1 m Naltriumchloridlösung vom pH-Wert 6, die 0,1 m an Glycin ist, gewaschen.

Sodann werden 500 ml 0,01 m Natriumphosphatlösung vom pH-Wert 10 zugegeben. Nach 20- bis 30minütigem Stehen bei Raumtemperatur wird die von der Sepharose in die Lösung desorbierte Urokinase durch Vakuumfiltration abgetrennt. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wird mit Salzsäure auf 7,2 eingestellt. Nach dem Gefriertrocknen erhält man etwa 5 mg Urokinase mit einer spezifischen Aktivität von 8700 Einheiten/mg.

Beispiel 6

Die Gesamtmenge der in Beispiel 5 verwendeten Sepharose wird in eine Säule gefüllt, durch Waschen

ίο mit einer 0,05 m Natriumchloridlösung regeneriert und anschließend mit 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6 äquilibriert. Sodann werden 1000 ml einer Urokinaselösung vom pH-Wert 6 mit 4 g roher Urokinase (spezifische Aktivität 430 Einheiten/mg) über die Säule gegeben. Dabei wird die Urokinase spezifisch an der Sepharose adsorbiert, während der Hauptteil der Verunreinigungen die Säule passiert. Sodann wird die Säule mit 500 ml einer 0,05 m Natriumphosphatlösung vom pH-Wert 6 und anschließend mit 1400 ml einer 0,05 m Natriumchloridlösung vom pH-Wert 6, die 0,05 m an Lysin-hydrochlorid ist, gewaschen, wobei die Verunreinigungen praktisch vollständig entfernt werden.

Schließlich wird die Urokinase mit etwa 1500 ml einer 0,01 m Natriumchloridlösung, die mit 1 η Natriumhydroxid auf den pH-Wert 9,5 eingestellt ist, eluiert. Die auf diese Weise erhaltene Urokinase weist eine spezifische Aktivität von 32000 Einheiten/mg auf. Der Reinigungsfaktor beträgt 74, bezogen auf die als Ausgangsmaterial eingesetzte rohe Urokinase. Die Ausbeute beträgt 96%.

Beispiel 7

Beispiel 2 wird wiederholt mit der Abänderung, daß 30 Liter Urin verwendet werden. Man erhält 1000 ml einer dialysierten Urokinaselösung mit einer spezifischen Aktivität von 7800 Einheiten/mg.

Diese Lösung wird gemäß Beispiel 6 weiter behan-

delt. Etwa 1500 ml der erhaltenen Lösung werden gegen isotone Natriumchloridlösung dialysiert. Sodann wird gefriergetrocknet. Man erhält 3,5 mg Urokinase mit einer spezifischen Aktivität von 37000 Einheiten/mg.

Der technische Fortschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem Verfahren der DT-OS 2 143816 ergibt sich aus dem· Vergleich der Ergebnisse, insbesondere der eingesetzten Produkte und der erhaltenen spezifischen Aktivitäten der gereinigten Urokinase. Wird Urokinase aus menschlichem Urin isoliert (vgl. Beispiel 2, 4 und 5 des crfindungsgemiißen Verfahrens und Beispiel 1 des Verfahrens der DT-OS), so liegt die mit dem erl'indungsgemäßen Verfahren erhaltene spezifische Aktivität der Uroki nase in einem Bereich von 8700 bis 9400 E/mg, wäh rend mit dem Verfahren der DT-OS lediglich ein Aktivität von 4000 E/mg erreicht wird. Bei Verwen dung einer angereicherten, rohen Urokinase (vgl Beispiel 1, 3, 6 und 7 des erfindungsgemäßen Verfah rens und Beispiel 2 und 3 des Verfahrens der DT-OS wird je nach Behandlungsmethode im erfindungsge mäßen Verfahren eine Aktivität von 17 000 bis 37 ()()( E/mg, im Verfahren der DT-OS eine Aktivität voi 10 000 bis 13 000 (Anreicherungsfaktor des Beispiel! 2:3,25) erhalten. Der im erfindungsgemäßen Verfuh ren erhaltene Anreicherungsfaktor liegt dagegen ii einem Bereich von 4,7 bis 74,4.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Reinigung von Urokinase durch Adsorption de·' Urokinase an einem wasserunlöslichen Adsorptionsmittel und Elution der adsorbierten Urokinase, dadurch gekennzeichnet, daß man

(A) bei einem schwach sauren bis neutralen pH-Wert, wobei die Salzkonzentration bei etwa 0,03 bis 0,15 m liegt, aus einer Verunreinigungen enthaltenden wäßrigen Urokinaselösung die Urokinase an einem Agarose und Agaropectin als Hauptbestandteile enthaltenden wasserunlöslichen Polysaccharid adsorbiert und anschließend die adsorbierte Urokinase mit einer wäßrigen alkalischen Lösung oder einer konzentrierten wäßrigen Salzlösung eluiert, oder

(B) daß man das nach (A) erhaltene Agarose und Agaropectin als Hauptbestandteile enthaltende wasserunlösliche Polysaccharid, an dem die Urokinase adsorbiert ist, mit Wasser oder einer wäßrigen Natriumchlorid- oder Natriumphosphatlösung vom pH-Wert 5,5 bis 6,5 und einer Konzentration von 0,03 bis 0,15 m wäscht und anschließend die adsorbierte Urokinase mit einer wäßrigen alkalischen Lösung oder einer konzentrierten wäßrigen Salzlösung eluiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Elution eine wäßrige alkalische Lösung mit einem pH-Wert von 8,0 bis 11,0 verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Elution eine wäßrige alkalische Lösung verwendet, die Ammoniumsulfat, Natriumphosphat oder Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 0,01 bis 0,15 m enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Elution eine wäßrige alkalische Lösung verwendet, die Glycin, Arginin oder Histidin in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 2% (Gew./Vol.) enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Elution eine wäßrige alkalische Lösung verwendet, die etwa 2 bis 4% (Gew./Vol.) einer wäßrigen Ammoniaklösung enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Elution als konzentrierte wäßrige Salzlösung eine 1 m wäßrige Natriumchloridlösung, eine 0,5 m wäßrige Ammoniumsulfatlösung oder eine etwa 5- bis lOprozentige (Gew./Vol.) Lösung einer neutralen Aminosäure verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Waschlösung verwendet, die zusätzlich 0,05 bis 0,1 m an Lysin, ε-Aminocapronsäure, Glycin, Serin oder Cystein ist.