DE2456586A1 - Verwendung von bestimmten mikroorganismen-staemmen zur gewinnung von cholesterinoxydase, welche cholesterin mit o tief 2 zu cholestenon + h tief 2 o tief 2 oxidiert - Google Patents

Verwendung von bestimmten mikroorganismen-staemmen zur gewinnung von cholesterinoxydase, welche cholesterin mit o tief 2 zu cholestenon + h tief 2 o tief 2 oxidiert

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DE2456586A1 DE19742456586 DE2456586A DE2456586A1 DE 2456586 A1 DE2456586 A1 DE 2456586A1 DE 19742456586 DE19742456586 DE 19742456586 DE 2456586 A DE2456586 A DE 2456586A DE 2456586 A1 DE2456586 A1 DE 2456586A1
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Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. f. Weokmann,
Dipl.-Ing. H.Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
8 MÜNCHEN 86, DEN
POSTFACH 860 820
MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22
BOEHRINGER MANNHEIM GMBH, 68 Mannheim 31, Sandhofer Str. 11 2-132
Verwendung von bestimmten Mikroorganismen-Stämmen zur Gewinnung von Cholesterinoxydase, welche Cholesterin mit Op zu
Cholestenon + HpO2 oxidiert
Zusatz zu Patent (Patentanmeldung P 22 24 133.4-41)
Gegenstand des deutschen Patents (Patentanmeldung
P 22 24 133.4-41) ist die Verwendung von Nocardia erythropolis ATCC 17895, Nocardia erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811 und Proactinomycetes erytrhopolis NCIB 9158 (NBC 9158) zur Gewinnung von Cholesterinoxydase.
Vorzugsweise wird dabei Cholesterin als Kohlenstoffquelle für die Züchtung der genannten Mikroorganismen verwendet. Überraschenderweise wurde nunmehr gefunden, daß ebensogute und teilweise sogar überlegen Ergebnisse erzielt werden, wenn die genannten Mikroorganismen auf anderen Sterinen anstelle von Cholesterin gezüchtet werden.
Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung von Nocardia erythropolis ATCC 17895, Nocardia erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811 und Proactinomycetes
609825/0783
2 A 5 6 5 8
erythropolis NCIB 9158 (NBC 9158) zur Gewinnung von Cholesterinoxydase, welche die Oxidation von Cholesterin
gemäß der Reaktionsgleichung Cholesterin + Op P"
Cholestenon + HpO2 katalysiert, gemäß Patent (deutsche
Patentanmeldung P 22 24 133.4-41), die dadurch gekennzeichnet ist, daß Organismen verwendet werden, die zuerst auf einem peptonhaltigen Mineralsalzmedium und danach auf wenigstens einer Verbindung der allgemeinen Formel I
(D
in der R-1 und R? Wasserstoffatome oder zusammen eine Doppelbindung, R^ und Rr Wasserstoffatome oder zusammen eine Doppelbindung und R1- ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1-3 Kohlenstoffatomen bedeuten, als jeweils einzige Kohlenstoffquelle gezüchtet werden.
Spezielle Beispiele für erfindungsgemäß einsetzbare Sterine sind Sitosterin, Cholestanol und Stigmasterin. Sitosterin mit seiner Äthylseitenkette am Cp^-Kohlenstoffatom (vgl. Fig. 1) ist dem Cholesterin sogar überlegen, während Stigmasterin und Cholestanol (vgl. Fig. 1) im allgemeinen nicht die hohe Wirksamkeit von Sitosterin erreichen.
Sterine sind, auch wenn sie eine cholesterinähnliche Struktur haben,im allgemeinen induktionsinaktiv und eignen sich daher nicht zur Gewinnung von Cholesterin-Oxydase-reichen Mikroorganismen. So erwiesen sich z.B. Ergosterin, A7-Dehydro-
8 0 9 8 2 5/0783
cholesterin, A4-Cholesten-3ß-ol und A4-Cbolesten-3ß-on (vgl. Fig. 2) als induktionsinaktiv und somit unbrauchbar zur Züchtung der genannten Cholesterinoxydase-reichen Mikroorganismen. Es war daher nicht vorhersehbar, daß mit der oben angegebenen besonderen Gruppe von Sterinen eine sehr gute Induktion der Cholesterinoxydasebildung erreicht werden kann.
Die erfindungsgemäß verwendbaren, induktionsaktiven Sterine können in reiner Form als Rohsterine oder als Gemische mit anderen induktionsaktiven oder auch -inaktiven Sterinen eingesetzt werden. Derartige Gemische sind z.B. Rohsteringemische, wie sie aus pflanzlichem Material, z.B. aus Maiskeimextrakten gewonnen werden können. So kann durch Destillation von bestimmten Maisextrakten und Gewinnung der Destillationsrückstände ein Rohsteringemisch erhalten werden, das zu etwa 50 - 70 Gew.-% aus Sterinen besteht.
Die Züchtung der genannten Mikroorganismen erfolgt analog der im Hauptpatent beschriebenen Verfahrensweise:
Als Nährboden hat sich eire wässrige Lösung mit einem Gehalt von etwa 0,1 bis 2 Gew.-% Pepton, 0,01 bis 0,2 Gew.-% K2HPO^, 0,05 bis 1 Gew.-% NH^l^PO^, 0,05 bis 0,1 Gew.-% Magnesiumsulf atheptahydrat, die Eisenchlorid und Calciumchlorid in Spuren enthielt und einen pH-Wert zwischen 6 und 9 aufwies, bewährt. Die anfängliche Zugabe an erfindungsgemäß verwendbarem Sterin liegt zweckmäßig zwischen 0,01 und 0,2 %.
Die WeiterZüchtung erfolgt in einer Hauptkultur, indem man die Mikroorganismen auf einem peptonhaltigen Mineralsalzmedium wachsen läßt und stetzt- vorzugsweise sobald die logarithmische Wachstumsphase erreicht ist - eine wässrige Emulsion zu, die durch Naßvermahlung einer wässrigen Suspension des induktionsaktiven Sterins bzw. Steringemisches und anschließende Hitzesterilisation hergestellt worden ist. Dabei wurde die Emulsion der Kulturbrühe vorzugsweise in einer solchen Menge zugesetzt, daß insgesamt 1 bis 30 g eines erfindungsgemäß einsetzbaren Sterins bzw. 1 bis 50. g eines erfindungsgemäß einsetzbaren Rohsteringemisches im Verlauf des Wachstums zugegeben wurden.
fi 0 9 8 2 5 / Π 7 R ^
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung eines Mikroorganismus, der auf einem Sterin der allgemeinen Formel I, in der R1 bis Rc- die vorgenannten Bedeutungen haben, als einzige Kohlenstoffquelle gezüchtet wurde, indem dem auf einem peptonhaltigen Mineralsalzmedium gewachsenen Mikroorganismus eine Emulsion, die durch Naßvermahlung einer wässrigen Suspension eines Sterins der allgemeinen Formel I, in der R^ bis R2 die vorgenannten Bedeutungen haben, und anschließende Hitzesterilisation hergestellt wurde, zugesetzt wird, sobald die logarithmische Wachstumsphase erreicht ist, zur Gewinnung von Cholesterinoxydase.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
15 1 eines Nährbodens, bestehend aus 0,5 Gew.-% Pepton aus Casein (tryptisch), 0,05 Gew.-% K2HPO4, 0,2 Gew.-% NH4H2PO4, 0,02 Gew.-% Magnesiumsulfatheptahydrat, Eisenchlorid und Calciumchlorid in Spuren in Leitungswasser und durch KOH auf pH 7,5 eingestellt, werden in einem Rührerfermenter mit 500 ml einer gut bewachsenen Vorkultur von Nocardia erythropolis ATCC 4277 beimpft und kräftig belüftet. Hierbei werden gleich von Beginn an 0,05 % Sitosterin zugesetzt. Mit Beginn der logarithmischen Wachstumsphase, erkennbar an der auftretenden Trübungszunähme, wird schubweise durch Naßvermahlung bereitete, sterilisierte Sitosterin-Hefeextraktsuspension im Verlauf der weiteren Züchtung zugegeben, so daß innerhalb von 20 Stunden insgesamt eine Menge von 50 g Sitosterin in den Kolben eingebracht wird. 5 Stunden nach der letzten Zugabe wird die Zellmasse durch Zentrifugation abgeerntet. Man erhält 53,3 g Bakterientrockenmasse. Nach Aufschluß mit Ultraschall ergeben sich 3 E/g Cholesterinoxydase. Dabei entspricht 1 E der Bildung von 1 /uMol H202/min = Oxydation von 1 /uMol Cholesterin/min unter folgenden Testbedingungen:
2,31 ml Phosphat-Puffer (0,05 M, pH 7,0) enthaltend 1 mg/ml 2,2t-Azino-di-/"~äthyl-benzthiazolinsulfonsäure(6>]7>Ammonsalz
0,05 ml Cholesterinlösung, enthaltend 3,7 mg Cholesterin/ml
ff > - .
in t-Butanol
ic ff.
0,6 ml t-Butanol, 0,02 ml Peroxydase entsprechend 9E, 0,02 ml Bakterienextrakt
Beispiel
Der Versuch wird gemäß Beispiel 1 wiederholt, jedoch wird anstelle der wässrigen Sitosterin-Hefeextraktemulsion eine wässrige 3ß-Cholestanol-Hefeextraktemulsion eingesetzt. Es werden 52,5 g Bakterientrockenmasse erhalten.
Beispiel 3
Der Versuch wird gemäß Beispiel 1 wiederholt, jedoch wird anstelle der wässrigen Sitosterin-Hefeextraktemulsion eine wässrige Stigmasterin-Hefeextraktemulsion eingesetzt. Es werden 52,5 g Bakterientrockenmasse erhalten.
6O9825/O7B3

Claims (3)

  1. Patentansprüche
    Verwendung von Nocardia erythropolis ATCC 17895, Nocardia erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811 und Proactinomycetes erythropolis NCIB 9158 (NBC 9158) zur Gewinnung von Cholesterinoxydase, welche die Oxidation von Cholesterin gemäß der Reaktionsgleichung Cholesterin + 0.
    Cholestenon +
    katalysiert, gemäß Patent (deutsche Patentanmeldung
    P 22 24 133.4-41), dadurch gekennzeichnet, daß Organismen verwendet werden, die zuerst auf einem peptonhaltigen Mineralsalzmedium und danach auf wenigstens einer Verbindung der allgemeinen Formel I
    (D
    Wasserstoffatome oder zusammen eine
    und Rr Wasserstoffatome oder zusammen
    in der R1 und
    Doppelbindung,
    eine Doppelbindung und R,- ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1-3 Kohlenstoffatomen bedeuten, als jeweils einzige Kohlenstoffquelle gezüchtet werden.
  2. 2. Verwendung eines Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, der auf einem Sterin gemäß Anspruch 1 als einziger Kohlenstoff quelle gezüchtet wurde, inden dem auf einem peptonhaltigen Mineralsalzmedium gewachsenen Mikroorganismus eine Emulsion, die durch Naßvermahlung einer wässrigen Suspension eines Sterins gemäß Anspruch 1 und anschließende Hitzesterilisation hergestellt wurde,zügesetzt wird, sobald
    die logarithmische Wachstumsphase erreicht ist.
    609825 /078 3
  3. 3. Verwendung eines Mikroorganismus gemäß Anspruch 2, dem je 1 Kulturbrühe Sitosterin und/oder Stigmasterin und/oder 3ß-Cholestanol in einer Menge von insgesamt 1-30 g je 1 Kulturbrühe zugesetzt wurde.
    fiCI-9 8? ζ / Π 7
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