WO2012004248A1 - MIKROBIOLOGISCHES VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON 11α-HYDROXY-DROSPIRENON - Google Patents

MIKROBIOLOGISCHES VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON 11α-HYDROXY-DROSPIRENON Download PDF

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WO2012004248A1
WO2012004248A1 PCT/EP2011/061286 EP2011061286W WO2012004248A1 WO 2012004248 A1 WO2012004248 A1 WO 2012004248A1 EP 2011061286 W EP2011061286 W EP 2011061286W WO 2012004248 A1 WO2012004248 A1 WO 2012004248A1
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microbiological process
drospirenone
solution
atcc
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PCT/EP2011/061286
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Thorsten Blume
Ludwig Zorn
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Bayer Pharma Aktiengesellschaft
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/06—Hydroxylating
    • C12P33/08—Hydroxylating at 11 position
    • C12P33/10—Hydroxylating at 11 position at 11 alpha-position
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention relates to the subject matter characterized in the claims, i. an improved microbiological process for the preparation of (6 ⁇ , 7 ⁇ , 15 ⁇ , 16 ⁇ -dimethylene-1,1 ⁇ -hydroxy-3-oxo-17-pregn-4-ene-21,17 ⁇ -carbolactone
  • Important derivatives of drospirenone employing 11a-hydroxy-drospirenone are 6 ⁇ , 7 ⁇ ; 15 ⁇ , 16 ⁇ -dimethylene-3-oxo-17-pregna-4,9 (11) -diene-21,17 ⁇ -carbolactone and the 6 ⁇ , 7 ⁇ , 15 ⁇ , 16 ⁇ -dimethylene-11 ⁇ -fluoro-3-oxo-17 -pregn-4-en-21, 17 ⁇ -carbolactone. These substances are disclosed in WO2009 / 14681 1. The substances described there show a higher progestational potency than the drospirenone, which can be used for a dose reduction. They thus represent important substances for the production of pharmaceutical agents for contraception.
  • a yield of only 27.6%, as reported by Nickisch et al. for the microbiological hydroxylation step (compound 6 in the publication of Nickisch compound of formula I), is in any case not satisfactory.
  • the object of the present invention is therefore to provide a synthesis for the preparation of the 1 1 a-hydroxy drospirenone, in which a better yield than in the described method is achieved. This object is achieved by the invention. It has been found that the conversion of drospirenone to 1 1 a-hydroxy-drospirenone in yields well above that of Nickisch et. al.
  • strains may be used as strain:
  • Metarhizium anisopliae IFO 5940 80 Among the strains mentioned are the Beauveria bassiana (ATCC 13144), Bacillus megaterium (ATCC 13368), Beauveria bassiana (ATCC 7159), Aspergillus nidulans (ATCC 1 1267), Beauveria bassiana (CBS 1 1025 ), Wojnowicia graminis (CBS 89168), Metarhizium anisopliae (IFO 5940) and Glomerella cingulata (NBRC / IFO No. 5257), the latter three being particularly preferred are. Glomerella cingulata (NBRC / IFO No. 5257) has proven to be particularly suitable.
  • DMF dimethylformamide
  • other water-miscible solvents e.g. dimethylacetamide (DMAc), dimethyl sulfoxide (DMSO) or N-methyl-2-pyrrolidone (NMP), with DMF being preferred.
  • DMAc dimethylacetamide
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • NMP N-methyl-2-pyrrolidone
  • the concentration of drospirenone dissolved in the organic solvent should be in the range of 50-300 grams per liter, the upper limit being determined by the solubility of the substance in the chosen solvent. This can also be done with supersaturated solutions, as they can be prepared by heating and subsequent cooling.
  • the concentration is preferably 160 g per liter of solvent.
  • the drop rate is in the range of 0.5 ml to 2 ml of drospirenone solution per hour and liter of fermentation solution, preferably at 1 ml / per liter and hour.
  • the temperature of the reaction medium should be in the range between 20 and 35 ° C, preferably at 25-30 ° C, more preferably at 27 ° C. These temperatures apply both to the preparation of the preculture and to the conversion of the drospirenone to the desired product, the 11a-hydroxy-drospirenone.
  • the nutrient solution may contain the usual and known to the expert adjuvants. Suitable compositions are e.g. in "Practical Fermentation Technology
  • a typical nutrient solution may be composed as follows: In addition to the above-described carbon and nitrogen components, the following salts may also be present, such as.
  • the preparation of the preculture is carried out by first placing in a suitable vessel, e.g. a 2-liter Erlenmeyer flask with tube, which is moved with a rotary shaker, a Vorzucht is generated.
  • a suitable vessel e.g. a 2-liter Erlenmeyer flask with tube, which is moved with a rotary shaker, a Vorzucht is generated.
  • a sterilized solution of the aforementioned composition containing an organic carbon and nitrogen component and one or more of the listed salts is used.
  • This nutrient solution is then treated with an appropriate amount of a DMSO ice culture of the chosen strain, e.g. of Glomerella cingulata (NBRC No. 5257) and shaken for a few days with tempering on a rotary shaker.
  • a DMSO ice culture of the chosen strain e.g. of Glomerella cingulata (NBRC No. 5257)
  • a foam brake is advantageously added.
  • those skilled in the known substances such as. B. viscous silicone oil or Synperonic ® , where they can be used as mechanical foam brakes.
  • suitable silicone oils are offered, for example, by Wacker Chemie GmbH under the name SILFOAM SH.
  • the hergesile preculture is then reacted in a pressurized commercial fermenter with drospirenone to 1 1 a-hydroxy drospirenone.
  • the reaction medium contains a higher concentration of the above carbon and nitrogen component, and the listed salts are no longer added separately.
  • the overpressure in the fermenter is usually 0.7 bar.
  • the Fermenter is aerated with air throughout the reaction, the air flow rate being between 0.05 to 1 l per minute per liter of fermentation volume, preferably 0.2 to 0.4 l per minute per liter of fermentation volume, and more preferably 0.2 I per minute per liter of fermentation volume.
  • the air flow rate in the production of preculture corresponds to the aforementioned.
  • the culture broth is harvested and worked up by first extracted with methyl isobutyl ketone or similar solvents for up to 30 hours, the organic phase is concentrated to dryness and the residue with methanol or another geeineten solvent of silicone oil (foam brake ) is released.
  • the desired product is then crystallized from acetone in the usual way. Crystallization also involves other solvents, e.g. Ethanol or 2-butanone in question.
  • the two culture broths are combined and extracted with 60 l of methyl isobutyl ketone for 21.5 hours.
  • the combined organic phases are concentrated to dryness.
  • the residue is largely dissolved in methanol to filter off the silicone oil. It is then crystallized from acetone and 82.2 g (65.6% of theory) of 1 1 a-hydroxy-drospirenone isolated.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand, d.h. ein verbessertes mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von (6β,7β;15β,16β-Dimethylen-11α-hydroxy-3-oxo-17-pregn-4-en-21,17β-carbolacton (Formel I).

Description

Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 11a-Hydroxy-Drospirenon
Die vorliegende Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ge- genstand, d.h. ein verbessertes mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von (6ß,7ß; 15ß, 16ß-Dimethylen-1 1 a-hydroxy-3-oxo-17-pregn-4-en-21 , 17ß-carbolacton
[nachfolgend als 11 a-Hydroxy-Drospirenon bezeichnet (Formel I)].
Formel I
Die Synthese der Substanz, die eine wichtige Vorstufe bei der Synthese von Derivaten
Figure imgf000002_0001
des Drospirenons ist, wird von Nickisch et al. im J. Med. Chem. 1985, 546-550 beschrieben. Dort wird vom dem 6ß,7 ß:15 ß,16 ß -Dim usgegangen
Figure imgf000002_0002
Formel II
welches unter Verwendung des Stammes Colletotrkum Phomoides (JFO 5257) zum entsprechenden hydroxylierten Produkt der oben genannten Formel I umgesetzt wird. Als Ausbeute für diesen Reaktionsschritt, geben Nickisch et al. nur 27,6% an. Es ist anzumerken, dass der für diesen Syntheseschritt eingesetzte Stamm auch unter der Bezeichnung Glomerella cingulata (NBRC No. 5257) bekannt ist.
Wichtige Derivate des Drospirenons, bei denen das 1 1 a-Hydroxy-Drospirenon zum Ein- satz kommt, sind das 6ß,7ß; 15ß,16ß-Dimethylen-3-oxo-17-pregna-4,9(11 )-dien-21 ,17ß- carbolacton und das 6ß,7ß;15ß,16ß-Dimethylen-11 ß-fluor-3-oxo-17-pregn-4-en-21 ,17ß- carbolacton. Diese Substanzen werden in der WO2009/14681 1 offenbart. Die dort beschriebenen Substanzen zeigen eine höhere gestagene Potenz als das Drospirenon, was zu einer Dosisreduktion genutzt werden kann. Sie stellen somit wichtige Stoffe für die Herstellung von pharmazeutischen Mitteln für die Kontrazeption dar.
Es ist festzustellen, dass die Synthese der in der WO2009/14681 1 genannten Substanzen, wie auch die der meisten anderen synthetisch hergestellten Hormone, im allgemeinen aufwendig ist. So durchlaufen Hormonsynthesen immer eine große Anzahl von Re- aktionsschritten. Ausbeuteverluste, wie sie mit jedem Schritt einhergehen, potenzieren sich über die Vielzahl der Stufen, so dass am Ende einer Synthesekette in der Regel nur wenige Prozent vom gewünschten Produkt, bezogen auf die im ersten Syntheseschritt eingesetzte Substanzmenge, erhalten werden. Bei der Synthese von Hormonen kommen darüber hinaus häufig mikrobiologische Verfahrensschritte zum Einsatz, da diese oft die einzige Möglichkeit darstellen, eine bestimmte Funktionalisierung mit der gewünschten Konfiguration am Kohlenstoffatom zu realisieren. Diese Verfahrenschritte stellen somit Schlüsselschritte da, bei denen es besonders wichtig ist, eine gute Ausbeute zu erreichen.
Eine Ausbeute von nur 27,6%, wie sie von Nickisch et al. für den mikrobiologischen Hyd- roxylierungsschritt angegeben wird (Verbindung 6 in der Publikation von Nickisch = Verbindung der Formel I), ist in jedem Fall als nicht befriedigend anzusehen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, eine Synthese zur Herstellung des 1 1 a-Hydroxy-Drospirenons bereitzustellen, bei der eine bessere Ausbeute als bei den beschriebenen Verfahren erreicht wird. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Es wurde gefunden, dass die Umsetzung von Drospirenon zum 1 1 a-Hydroxy-Drospirenon in Ausbeuten, die deutlich über dem von Nickisch et. al. angebenenen Wert, bis hin zu 80%iger Ausbeute gelingt, indem man ein Glucose-Monohydrat (Kohlenstoffkomponente) und Maisquellwasser (Stick- Stoffkomponente) enthaltendes wässriges Medium für die Umsetzung einsetzt, das mit einer Vorkultur des Stammes Glomerella cingulata (NBRC No. 5257) beimpft ist, langsam und kontinuierlich mit einer Dropirenon Lösung versetzt und das gewünschte Produkt aus der erhaltenen Kulturbrühe mit Methyl-iso-butylketon oder einem anderen nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie z.B. Essigsäureethylester oder Chloroform ex- trahiert.
Als Stamm können alternativ auch die folgenden Stämme zur Anwendung kommen:
Stamm Herkunft Ausbeute 1 1<;-Hydroxy-DRSP
Annahpn in °/n
Rhizopus stolonifer ATCC 15441 31
Glomerella cingulata ATCC 12097 34
Beauveria bassiana IFO 5838 38
Beauveria bassiana IFO 4848 38
Aspergillus ochraceus ATCC 46504 40
Glomerella cingulata IFO 6470 42
Beauveria bassiana CBS 12736 44
Aspergillus ochraceus NRRL 405 45
Aspergillus ochraceus CBS 13252 45
Aspergillus niger ATCC 11394 46
Beauveria bassiana ATCC 13144 53
Bacillus megaterium ATCC 13368 54
Beauveria bassiana ATCC 7159 54
Aspergillus nidulans ATCC 11267 56
Beauveria bassiana CBS 1 1025 58
Wojnowicia graminis CBS 89168 67
Glomerella cingulata IFO 5257 68
Metarhizium anisopliae IFO 5940 80 Unter den genannten Stämmen sind der Beauveria bassiana (ATCC 13144), der Bacillus megaterium (ATCC 13368), der Beauveria bassiana (ATCC 7159), der Aspergillus nidulans (ATCC 1 1267), der Beauveria bassiana (CBS 1 1025), der Wojnowicia graminis (CBS 89168), der Metarhizium anisopliae (IFO 5940) und der Glomerella cingulata (NBRC / IFO No. 5257) bevorzugt, wobei die drei letztgenannten besonders bevorzugt sind. Als ganz besonders geeignet hat sich der Glomerella cingulata (NBRC / IFO No. 5257) erwiesen.
Anstelle von Dimethylformamid (DMF) können als Lösungsmittel für das Drospirenon auch andere mit Wasser mischbare Lösungsmittel, wie z.B. das Dimethylacetamid (DMAc), Dimethylsulfoxid (DMSO) od e r N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) zum Einsatz kommen, wobei DMF bevorzugt ist.
Die Konzentration des im organischen Lösungsmittel gelösten Drospirenons sollte im Bereich von 50-300 Gramm pro Liter liegen, wobei die obere Grenze durch die Löslichkeit der Substanz im gewählten Lösungsmittel bestimmt ist. Hierbei kann auch mit übersättigten Lösungen gearbeitet werden, wie sie durch Erwärmung und anschließende Abkühlung hergestellt werden können. Die Konzentration beträgt vorzugsweise 160 g pro Liter Lösungsmittel. Die Tropfgeschwindigkeit liegt im Bereich von 0,5 ml bis 2 ml Drospirenon Lösung pro Stunde und Liter Fermentationslösung, vorzugsweise bei 1 ml / pro Liter und Stunde.
Alternativ lassen sich auch Suspensionen des Substrates als mikronisiertes Produkt zudosieren (wie beschrieben in z. B. Steroids, 2008, 73, 1 12; oder Klaus Kieslich "Microbial Transformations of Non-Steroid Cyclic Compounds", Seite 6, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1976). Die Temperatur des Reaktionsmediums sollte im Bereich zwischen 20 und 35 °C, vorzugsweise bei 25-30 °C, besonders bevorzugt bei 27°C liegen. Diese Temperaturen gelten sowohl für die Herstellung der Vorkultur als auch für die Umsetzung des Drospirenons zum gewünschten Produkt, dem 1 1a-Hydroxy-Drospirenon.
Die Nährlösung kann die dem Fachmann bekannten und üblichen Hilfstoffe enthalten. Geeignete Zusammensetzungen werden z.B. in„Practical Fermentation Technology
(2008); Wiley Verlag; Kapitel 5; Editors: McNeil, Harvey ISBN 978-0470-014349" oder in L. E. Casida, Jr.„Industrial Microbiology", Chapter 7, John Wiley and Sons, Inc., New York-London-Sydney, 1964; Steroids 1998, 63, 484; Steroids 2007, 72, 713; Steroids 2009, 74, 233; J. Am. Chem. Soc. 1959, 81 ,4750; beschrieben. Eine typische Nährlösung kann sich wie folgt zusammensetzen: Neben der oben beschriebenen Kohlenstoff- und Stickstoffkomponente können auch noch folgende Salze enthalten sein, wie z. B. Natriumnitrat (0, 1-0,4% vorzugsweise 0,2%), Kaliumdihydrogenphosphat (0,05-0,2% vorzugsweise 0,1 %) Dikaliumhydrogenphosphat (0, 1-0,4% vorzugsweise 0,2%), Kaliumchlorid (0,02-0, 1 % vorzugsweise 0,05%), Magnesiumsulfat Heptahydrat (0,02-0,1 % vorzugsweise 0,05%) und Eisen(ll)sulfat Heptahydrat (0,001-0,004 % vorzugsweise 0,002%). Der Anfangs pH- Wert der Lösung wird dabei auf 6,0 - 6,5 eingestellt.
Die Herstellung der Vorkultur erfolgt, indem zunächst in einem geeigneten Gefäß, wie z.B. einem 2-l-Erlenmeyerkolben mit Tubus, der mit einem Rotationsschüttler bewegt wird, eine Vorzucht erzeugt wird.
Als Nährlösung für die Vorzucht, wird eine sterilisierte Lösung der zuvor genannten Zusammensetzung, enthaltend eine organsiche Kohlenstoff- und Stickstoffkomponente und ein oder mehrere der aufgeführten Salze, verwendet. Diese Nährlösung wird dann mit einer entsprechende Menge einer DMSO-Eiskultur des gewählten Stammes, wie z.B. des Glomerella cingulata (NBRC No. 5257) beimpft und einige Tage unter Temperierung auf einem Rotationsschüttler geschüttelt.
Die Vorzucht wird anschließend in einen Fermenter überführt (beimpfen), der mit dem gleichen Medium / Hilfstoffen beschickt ist, wie es für die Vorzucht verwendet wurde und wird dort unter Rühren und Belüftung 12 - 72 Stunden, vorzugsweise 24 Stunden inkubiert. Zu r Vermeid ung von Schaum bild ung wird vorteilhafterweise eine Schaumbremse beigefügt. Als solche kommen dem Fachmann bekannten Substanzen, wie z. B . dickflüssiges Silikonöl oder Synperonic® infrage, wo be i e be nso g ut mechanische Schaumbremsen zum Einsatz kommen können. Entsprechend geeignete Silikonöle werden z.B. von der Wacker Chemie GmbH unter dem Namen SILFOAM SH angeboten.
Die so hergesteile Vorkultur wird anschließend in einem unter Überdruck stehenden handelsüblichen Fermenter mit Drospirenon zum 1 1 a-Hydroxy-Drospirenon umgesetzt. Hierbei enthält das Umsetzungsmedium eine höhere Konzentration an der obigen Kohlenstoff- und Stickstoffkomponente und die aufgeführten Salze werden nicht mehr extra hinzugefügt. Der Überdruck im Fermenter beträgt üblicherweise 0,7 bar. Der Fermenter wird während der gesamten Reaktion m it Luft belüftet, wobei der Luftdurchsatz zwischen 0,05 bis 1 I pro Minute pro Liter Fermentationsvolumen, vorzugsweise bei 0,2 bis 0,4 I pro Minute pro Liter Fermentationsvolumen, und ganz besonders bei 0,2 I pro Minute pro Liter Fermentationsvolumen liegt. Der Luftdurchsatz bei der Herstellung der Vorkultur entspricht dem zuvor genannten.
Nach abgeschlossener Reaktion wird die Kulturbrühe geerntet und aufgearbeit, indem zunächst mit Methly-iso-butylketon oder vergleichbaren Lösungsmitteln bis zu 30 Stunden extrahiert wird, die organische Phase bis zur Trockene eingeengt wird und der Rückstand mit Methanol oder einem anderen geeineten Lösungsmittel vom Silikonöl (Schaumbremse) befreit wird. Das gewünschte Produkt wird dann in üblicher Weise aus Aceton kristallisiert. Zur Kristallisation kommen auch andere Lösungsmittel, wie z.B. Ethanol oder 2-Butanon in Frage.
Das nachfolgende Beispiel dient der näheren Erläuterung der Erfindung:
BEISPIEL 1
Repräsentative Herstellung: A) Herstellung einer Glomerella cingulata Vorkultur:
Ein 2-l-Erlenmeyerkolben, der 1 I einer 30 Minuten bei 121 °C im Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 3% Glucose-Monohydrat, 1 % Maisquellwasser, 0.2% Natriumnitrat, 0.1 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0.2% Dikaliumhydrogenphosphat, 0.05% Kaliumchlorid, 0.05% Magnesiumsulfat Heptahydrat und 0.002% Eisen(ll)sulfat Heptahydrat (auf pH 6.0 eingestellt) enthält, wird mit einer 2 ml DMSO-Eiskultur des Stammes Glomerella cingulata (NBRC No. 5257) beimpft und 72 Stunden bei 27 °C auf einem Rotationsschüttler mit 165 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Mit dieser Vorzucht wird ein 20-l- Fermenter beimpft, der mit 19 I sterilem Medium der gleichen Endzusammensetzung, wie für die Vorkultur beschrieben, beschickt ist. Außerdem werden vor dem Sterilisieren noch 1.0 ml Silikonöl und 1.0 ml Synperonic® zur Schaumbekämpfung zugegeben. Dieser Fermenter wird 24 Stunden bei 0.7 bar Überdruck, einer Temperatur von 27 °C, einer Belüftung von 8 I pro Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 350 Umdrehungen pro Minute inkubiert.
B) Umsetzung der Vorkultur mit Drospirenon Aus diesem 20-l-Fermenter werden 2.5 I Vorkultur entnommen, um einen 50-l-Fermenter zu beimpfen, der mit 47.5 I sterilem Medium aus 5% Glucose-Monohydrat und 2% Maisquellwasser ( auf pH 6.0 - 6.5 eingestellt ) beschickt ist. Vor dem Sterilisieren werden 2.5 ml Silikonöl und 2.5 ml Synperonic® zugegeben. Nach einer Anwachsphase von 8 Stunden bei 0.7 bar Überdruck, einer Temperatur von 27 °C, einer Belüftung von 10 I pro Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 350 Umdrehungen pro Minute wird eine Lösung aus 40.0 g Drospirenon in 250 ml DMF kontinuierlich mit 50 ml pro Stunde hinzu gegeben. Es wird weitergerührt und belüftet. Nach 26 Stunden wird die Kulturbrühe geerntet.
Aus dem 20-l-Fermenter werden 5.0 I Vorkultur entnommen, um einen 100-l-Fermenter zu beimpfen, der mit 95.0 I sterilem Medium aus 5% Glucose-Monohydrat und 2% Maisquellwasser ( auf pH 6.0 - 6.5 eingestellt ) beschickt ist. Vor dem Sterilisieren werden 5.0 ml Siliconöl und 5.0 ml Synperonic® zugegeben. Nach einer Anwachsphase von 8 Stunden bei 0.7 bar Überdruck, einer Temperatur von 27 °C, einer Belüftung von 20 I pro Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 350 Umdrehungen pro Minute wird eine Lösung aus 80.0 g Drospirenon in 500 ml DMF kontinuierlich mit 125 ml pro Stunde hin- zu gegeben. Es wird weitergerührt und belüftet. Nach 25 Stunden wird die Kulturbrühe geerntet.
Hierbei ist anzumerken, das die Aufteilung der Vorkultur auf 2 unterschiedliche Fermenter Gefäße mit 50 bzw. 100 I Volumen lediglich aufgrund der mangelnden Verfügbarkeit eines Fermenters mit großem Volumen (150 I) erforderlich war. C) Isolierung und Reinigung
Die beiden Kulturbrühen werden vereinigt und mit 60 I Methyl-iso-butylketon 21 ,5 Stunden extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird weitgehend in Methanol gelöst, um das Siliconöl abzufiltrieren. Anschließend wird aus Aceton kristallisiert und 82.2 g (65,6% d. Th.) 1 1 a-Hydroxy- Drospirenon isoliert.
Für das Produkt wurden auf einen 600 MHz NMR Gerät in CDCI3 die folgenden Daten gemessen:
d =6.04 (s, 1 H); 3.88 (m, 1 H); 2.52-2.70 (m, 3H); 2.37-2.46 (m, 2H), 2.28 (m, 1 H); 2.06- 2.18 (m, 3H); 1.86 (dd, 1 H); 1.79 (ddd, 1 H); 1 .59-1.69 (m, 2H); 1.51 (m, 1 H); 1.38-1.47 (m, 3H); 1.22-1.31 (m, 3H); 1.21 (s, 3H); 0.99 (s, 3H); 0.81 (dd, 1 H); 0.55 (dd, 1 H)

Claims

Patentansprüche
1. Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 1 1 a-Hydroxy-Drospirenon, dadurch gekennzeichnet, dass
(a) eine Fermentationslösung, die den Stamm Glomerella cingulata (NBRC No. 5257), Beauveria bassiana (ATCC 13144), Bacillus megaterium (ATCC 13368), Beauveria bassiana (ATCC 7159), Aspergillus nidulans (ATCC
1 1267), Beauveria bassiana (CBS 1 1025), Wojnowicia graminis (CBS 89168) oder den Stamm Metarhizium anisopliae (IFO 5940) enthält, der in einem Nährmedium aus Glucose-Monohydrat und Maisquellewasser, das bei der Herstellung der Vorkultur zusätzlich noch verschiedene Hilfsstoffe enthält, angezogen wird und diese mit
(b) einer Dropirenon Lösung oder Drospirenon Mikrosuspension langsam und kontinuierlich versetzt wird und
(c) die erhaltene Kulturbrühe anschließend mit Methyl-iso-butylketon, Essigsäureethylester oder Chloroform extrahiert wird.
2. Mikrobiologisches Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Stamm Glomerella cingulata (NBRC No. 5257), Wojnowicia graminis (CBS 89168) oder Metarhizium anisopliae (IFO 5940) eingesetzt wird.
3. Mikrobiologisches Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Stamm Glomerella cingulata (NBRC No. 5257) eingesetzt wird.
4. Mikrobiologisches Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturlösung Glucose-Monohydrat in einer Konzentration von 3-5%, Maisquellwasser in einer Konzentration von 1-2% enthält.
5. Mikrobiologisches Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Lösungsmittel für das Drospirenon Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid (DMAc), Dimethylsulfoxid (DMSO) oder N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) zum Einsatz kommt.
6. Mikrobiologisches Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Lösungsmittel für das Drospirenon Dimethylformamid eingesetzt wird.
7. Mikrobiologisches Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Anfangs-pH-Wert des Fermentationsmediums auf 6,0 bis 6,5 eingestellt ist.
8. Mikrobiologisches Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fermentationsmedium sowie die Vorkultur als weitere Hilfstoffe 0,1 - 0,4% Natriumnitrat, 0,05 - 0,2% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1 - 0.4% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,02 - 0, 1 % Kaliumchlorid, 0,02 - 0, 1 % Magnesiumsulfat Heptahydrat und/oder 0,001 - 0,004% Eisen(ll)sulfat Heptahydrat enthält.
9. Mikrobiologisches Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Sterilisieren 5,0 ml Silikonöl und 5,0 ml Synperonic® pro 100 Liter Fermenterlösung zur Schaumbekämpfung zugegeben werden.
10. Mikrobiologisches Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Drospirenon Lösung 160g / 1 beträgt und die Tropfgeschwindigkeit, mit der die Lösung zugegeben wird, 0,5 ml bis 2 ml pro Stunde und Liter Fermentationslösung beträgt.
1 1 . Mikrobiologisches Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmedium eine Temperatur von 20-35 °C hat.
12. Mikrobiologisches Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmedium eine Temperatur von 25-30 °C hat
13. Mikrobiologisches Verfahren nach Anspruch einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmedium eine Temperatur von 27 °C hat.
14. Mikrobiologisches Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass während der gesamten Reaktionsdauer mit einer Menge von 0,05 - 1 I Luft pro Minute und pro Liter Fermentationsvolumen belüftet wird.
15. Mikrobiologisches Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturbrühe mit Methyl-iso-butylketon, Es- sigsäureethylester oder Chloroform 20-30 Stunden extrahiert wird und die erhaltenen organischen Phasen bis zur Trockene eingeengt werden.
16. Mikrobiologisches Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Rückstand mit Methanol gewaschen und anschließend aus Aceton, Ethanol oder 2-Butanon kristallisiert wird.
17. Verwendung von nach einem der Ansprüche 1 - 16 hergestellten
1 1 a-Hydroxy-Drospirenon zur Synthese von 6ß,7ß, 15ß, 16ß-Dimethylen-3- oxo-17-pregna-4,9(1 1 )-dien-21 , 17ß-carbolacton.
18. Verwendung von nach einem der Ansprüche 1 - 16 hergestellten
1 1 a-Hydroxy-Drospirenon zur Synthese von 6ß,7ß; 15ß, 16ß -Dimethylen-1 1 ß - fluor-3-oxo-17-pregn-4-en-21 , 17ß-carbolacton.
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