DE2456586B2 - Verwendung von bestimmten Mikroorganismenstämmen zur Gewinnung von Cholesterinoxidase, welche Cholesterin mit O2 zu Cholestenon + H2 O2 oxidiert - Google Patents
Verwendung von bestimmten Mikroorganismenstämmen zur Gewinnung von Cholesterinoxidase, welche Cholesterin mit O2 zu Cholestenon + H2 O2 oxidiertInfo
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Description
katalysiert, gemäß Patent 22 24133.4, dadurch
gekennzeichnet, daß Organismen verwendet werden, die zuerst auf einem peptonhaltigen
Mineralsalzmedium, und danach auf wenigstens einem Sterin der allgemeinen Formel I
HO
in der Ri und R2 Wasserstoffatome oder zusammen
eine Doppelbindung, R3 und R* Wasserstoffatome
oder zusammen eine Doppelbindung und Rs ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 3
Kohlenstoffatomen bedeuten, gezüchtet wurden, wobei in dieser Stufe jeweils als einzige Kohlenstoffquelle entweder wenigstens ein Sterin der Formel I,
ausgenommen Cholesterin, oder wenigstens ein Sterin der allgemeinen Formel I im Gemisch mit
induktionsaktiven oder induktionsinaktiven Sterinen eingesetzt wird.
2. Verwendung eines Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, der auf einem Sterin gemäß Anspruch 1
als einziger Kohlenstoffquelle gezüchtet wurde, indem dem auf einem peptonhaltigen Mineralsalzmedium gewachsenen Mikroorganismus eine Emulsion, die durch Naßvermahlung einer wäßrigen
Suspension eines Sterins gemäß Anspruch I und anschließende Hitzesterilisation hergestellt wurde,
zugesetzt wird, sobald die logarithmische Wachstumsphase erreicht ist.
3. Verwendung eines Mikroorganismus gemäß Anspruch 2, dem je Liter Kulturbrühe Sitosterin
und/oder Stigmasterin und/oder 3-/?-Cholestanol in einer Menge von insgesamt 1 bis 30 g je Liter
Kulturbrühe zugesetzt wurde.
Gegenstand des deutschen Patents 22 24 133.4 ist die Verwendung von Nocardia erythropolis ATCC 17895,
Nocardia erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811 zur Gewinnung von Cholesterinoxidase.
Vorzugsweise wird dabei Cholesterin als einzige Kohlenstoffquelle für die Züchtung der genannten
Mikroorganismen verwendet. Überraschenderweise wurde nunmehr gefunden, daß bessere Ergebnisse
erzielt werden können, wenn die genannter) Mikroorganismen auf anderen Sterinen anstelle von Cholesterin
gezüchtet werden.
Der Gegenstand der Erfindung ist in den Ansprüchen definiert
Die drei ATCC-Stämme wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) nachhinterlegt
und erhielten die aus der Erfindungsdefinition ersichtlichen Hinterlegungsnummern.
Spezielle Beispiele für erfindungsgemäß einsetzbare
ίο Sterine sind Sitosterin, Cholestanol und Stigmasterin.
Sitosterin mit seiner Äthylseitenkette am C24-Kohlenstoffatom ist dem Cholesterin sogar überlegen, während
Stigmasterin und Cholestanol im allgemeinen nicht die hohe Wirksamkeit von Sitosterin erreichen.
Sterine sind, auch wenn sie eine cholesterinähnliche
Struktur haben, im allgemeinen induktionsinaktiv und eignen sich daher nicht zur Gewinnung von choiesterinoxidase-reichen Mikroorganismen. So erwcr-jen sich
z. B. Ergosterin, 47-Dehydrocholesterin, 44-ChoIesten-
3/?-ol und d4-Cholesten-3/?-on als induktionsinaktiv und
somit unbrauchbar zur Züchtung der genannten cholesterinoxidase-reichen Mikroorganismen. Es war
daher nicht vorhersehbar, daß mit der oben angegebenen besonderen Gruppe von Sterinen eine sehr gute
Induktion der Cholesterinoxidasebildung erreicht werden kann.
Die erfindungsgemäß verwendbaren, induktionsaktiven Sterine können in reiner Form als Rohsterine oder
als Gemische mit anderen induktionsaktiven oder auch
ω -inaktiven Sterinen eingesetzt werden. Derartige
Gemische sind z. B. Rohsteringemische, wie sie aus pflanzlichem Material, z. B. aus Maiskeimextrakten,
gewonnen werden können. So kann durch Destillation von bestimmten Maisextrakten und Gewinnung der
j-, Destillationsrückstände ein Rohsteringemisch erhalten
werden, das zu etwa 50 bis 70 Gew.-% aus Sterinen besteht.
Die Züchtung der genannten Mikroorganismen erfolgt analog der im Hauptpatent beschriebenen
-to Verfahrensweise.
Als Nährboden hat sich eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt von etwa 0,1 bis 2 Gew.-% Pepton, 0,01 bis
0,2Gew.-% K2HPO4,0,05 bis 1 Gew.-% NH4H2PO4,0,05
bis 0,1 Gew.-%Magnesiumsulfatheptahydrat, die
Eisenchlorid und Calciumchlorid in Spuren enthielt und
einen pH-Wert zwischen 6 und 9 aufwies, bewährt. Die anfängliche Zugabe an erfindungsgemäß verwendbarem Sterin liegt zweckmäßig zwischen 0,01 und 0,2%.
Die Weiterzüchtung erfolgt in einer Hauptkiiltur,
indem man die Mikroorganismen auf eLiem peptonhaltigen Mineralsalzmedium wachsen läßt und setzt —
vorzugsweise sobald die logarithmische Wachtumsphase erreicht ist — eine wäßrige Emulsion zu, die durch
Naßvermahlung einer wäßrigen Suspension des induk
tionsaktiven Sterins bzw. Steringemisches und anschlie
ßende Hitzesterilisation hergestellt worden ist. Dabei wurde die Emulsion der Kulturbrühe vorzugsweise in
einer solchen Menge zugesetzt, daß insgesamt 1 bis 30 g eines erfindungsgemäß einsetzbaren Sterins bzw. 1 bis
mi 50 g eines erfindungsgemäß einsetzbaren Rohsteringemisches im Verlauf des Wachstums zugegeben wurden.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung eines Mikroorganismus, der auf einem Sterin der
allgemeinen Formel I1 in der Ri bis Rs die vorgenannten
b5 Bedeutungen haben, als einzige Kohlenstoffquelle
gezüchtet wurde, indem dem auf einem peptonhaltigen Mineralsalzmedium gewachsenen Mikroorganismus
eine Emulsion, die durch Naßvermahlung einer wäßri-
gen Suspension eines Sterins der allgemeinen Formel I, in der Ri bis Rs die vorgenannten Bedeutungen haben,
und anschließende Hitzesterilisation hergestellt wurde, zugesetzt wird, sobald die logarithmische Wachstumsphase erreicht ist, zur Gewinnung von Cholesterinoxidase,
wobei Cholesterin ausgenommen ist.
Die folgenden Beispiele erläutert die Erfindung weiter.
15 I eines Nährbodens, bestehend aus 0,5 Gew.-C
Pepton aus Casein (tryptisch), 0,05 Gew.-% K2HPO4,0,2 Gew.-% NHhH2PO4, 0,02 Gew.- Magnesiumsulfatheptahydrat. Eisenchlorid und Calciumchlorid in Spuren in Leitungswasser und durch KOH auf pH 7,5 eingestellt, werden in einem Rührerfennenter mit 500 ml einer gut bewachsenen Vorkultur von Nocardia erytrhopolis ATCC 4277 (=DSM 763) beimpft und kräftig belüftet. Hierbei werden gleich von Beginn an 0,05% Sitosterin zugesetzt Mit Beginn der logarithmischen Wachstumsphase, erkennbar a»i der auftretenden Trübungszunahme, wird schubweise durch Naßvermahlung bereitete, sterilisierte Sitosterin-heffeextraktsuspension im Verlauf der weiteren Züchtung zugegeben, so daß innerhalb von 20 Stunden insgesamt eine Menge von 50 g Sitosterin in den Kolben eingebracht wird. 5 Stunden nach der letzten Zugabe wird die z.ellmasse durch Zentrifugation abgeerntet Man erhält 533 g Bakterientrockenmasse. Nach Aufschluß mit Ultraschall ergeben sich 3 E/g Cholesterinoxidase. Dabei entspricht 1 E der Bildung von 1 μΜο! H2O2/min=Oxidation von 1 μΜοΙ Cholesterin/min unter tolgenden Testbedingungen:
Pepton aus Casein (tryptisch), 0,05 Gew.-% K2HPO4,0,2 Gew.-% NHhH2PO4, 0,02 Gew.- Magnesiumsulfatheptahydrat. Eisenchlorid und Calciumchlorid in Spuren in Leitungswasser und durch KOH auf pH 7,5 eingestellt, werden in einem Rührerfennenter mit 500 ml einer gut bewachsenen Vorkultur von Nocardia erytrhopolis ATCC 4277 (=DSM 763) beimpft und kräftig belüftet. Hierbei werden gleich von Beginn an 0,05% Sitosterin zugesetzt Mit Beginn der logarithmischen Wachstumsphase, erkennbar a»i der auftretenden Trübungszunahme, wird schubweise durch Naßvermahlung bereitete, sterilisierte Sitosterin-heffeextraktsuspension im Verlauf der weiteren Züchtung zugegeben, so daß innerhalb von 20 Stunden insgesamt eine Menge von 50 g Sitosterin in den Kolben eingebracht wird. 5 Stunden nach der letzten Zugabe wird die z.ellmasse durch Zentrifugation abgeerntet Man erhält 533 g Bakterientrockenmasse. Nach Aufschluß mit Ultraschall ergeben sich 3 E/g Cholesterinoxidase. Dabei entspricht 1 E der Bildung von 1 μΜο! H2O2/min=Oxidation von 1 μΜοΙ Cholesterin/min unter tolgenden Testbedingungen:
2,31 ml Phosphat-puffer (0.05 M, pH 7,0) enthaltend 1 mg/ml 2,2'-Aziiio-di-{athyl-be."zthiazolinsulfonsäure
(6)]-ammonsaIz.
0,05 ml Cholesterinlösung, enthaltend 3,7 mg Cholesterin/ml
in t-Butanol,
0,6 ml t-Butanol, 0,02 ml Peroxidase entsprechend 9 E,
0,02 ml Bakterienextrakt
Der Versuch wird gemäß Beispiel 1 wiederholt, jedoch wird anstelle der wäßrigen Sitosterin-hefeextraktemulsion
eine wäßrige Sß-Cholestanol-hefeextraktemulsion
eingesetzt Es werden 52,5 g Baterientrockenmasse erhalten.
Der Versuch wird gemäß Beispiel 1 wiederholt, jedoch wird anstelle der wäßrigen Sitosterin-hefeextraktemulsion
eine wäßrige Stigmasterin-hefeextraktemulsion eingesetzt Es werden 52,5 g Bakterienlrokkenmasse
erhalten.
Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch wird mit einer gut bewachsenen Vorkultur von Nocardia erythropolis
ATCC 17895 ( = DSM 772) angeimpft, statt des dort genannten Organismus. Es werden 2080 U/l erhalten.
Beispiel 4 wird wiederholt, jedoch wird anstelle der wäßrigen Sitosterin-hefeextraktemulsion eine wäßrige
3-0-Cholestanol-hefeextrt'ktemulsion eingesetzt. Auf
diese Art werden 440 U/l erhalten.
Beispiel 4 wird wiederholt, jedoch wird mit einer gut bewachsenen Vorkultur von Nocardia formica ATCC
14811 ( = DSM 773) angeimpft, statt des in Beispiel 4
verwendeten Organismus. Es werden 1016 U/l erhalten.
Beispiel 6 wird wiederholt, jedoch wird anstelle der dort verwendeten wäßrigen Sitosterin-hefeextraktemulsion
eine wäßrige 3-/?-Cholestano! hefeextraktemulsion
eingesetzt. Es werden 440 U/L erhalten.
Claims (1)
1. Verwendung von Nocardia erythropolis ATCC 17895 ( = DSM 772), Nocardia erythropolis ATCC
4277 (=DSM 763) und Nocardia formica ATCC 14811 ( = DSM 773) zur Gewinnung von Cholesterinoxidase, welche die Oxidation von Cholesterin
gemäß der Reaktionsgleichung
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