DE2405353B2 - Verfahren zur isomerisierung von glucose zu fructose - Google Patents
Verfahren zur isomerisierung von glucose zu fructoseInfo
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Description
20
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isomerisierung von Glucose zu Fructose durch Einwirkung
immobilisierter Glucose-Isomerase auf eine Glucose enthaltende, schwach alkalisch gehaltene wäßrige
Lösung bei erhöhter Temperatur.
Fructose hat bekanntlich die doppelte Süßwirkung von Glucose; so kann daher zum Süßen unter
Halbierung der Kalorienzufuhr verwendet werden, jo Ihrer Herstellung kommt somit große Bedeutung zu.
Die Umwandlung kann durch Einwirkung von Enzymen erfolgen, die wegen ihrer spezifischen Wirkung ohne
Rücksicht auf ihre Herkunft als Glucose-Isomerase bezeichnet werden. J5
Die rationelle Herstellung auf enzymatischem Wege erfordert eine wiederholte Verwendung des vergleichsweise
teuren Enzyms. Die Glucose-Isomerase muß daher in fixierter oder immobilisierter Form'in oder auf
einem geeigneten, die Umsetzung nicht störenden oder erschwerenden Träger eingesetzt werden können.
Nach einem bekannten Verfahren soll die unter Einhaltung gewisser Bedingungen als möglich erkannte
Fixierung der Glucose-Isomerase in lebenden Zellen das Enzym immobilisieren und die wiederholte Verwendung
gestatten, ohne das Enzym aus den Zellen herauszulösen. Durch Wärmebehandlung der Zellen bei mäßig
erhöhter Temperatur (etwa 65° C) wurde das Enzym soweit fixiert, daß es mehrmals, z. B. siebenmal oder im
Durchlauf mehrere Tage, z.B. 15Tage, verwendet werden konnte, S.D. Pe rl ma η (Herausgeber), Fermentation
Advances, Academic Press, New York, 1969, S. 561 -589, vgl. insbesondere Seite 568 Mitte bis S. 570,
letzter Absatz.
In ähnlicher Weise wird nach der US-PS 36 94 314 intracellular fixierte Glucose-Isomerase eingesetzt. Die
Fixierung erfolgt hier in den Zellen bestimmter Mikroorganismen durch Behandlung zur Hemmung der
Extraktion des Enzyms durch die für die Umwandlung von Glucose in Fructose einzusetzenden Lösungen.
Hierdurch soll eine Enzymstabilität von mindestens 50Std. mit einer 54°/oigen Glucose-Fructose-Umwandlung
erzielt werden.
Da die Behandlung von Zellen lebender Organismen eine gewisse Aufwendigkeit der Herstellung, Lagerung
und Verwendung mit sich bringt, wurde auch bereits so vorgegangen, das Enzym an polymere Träger, insbesondere
basische Anionenaustauscher-Cellulosen zu binden, US-PS 37 08 397. Der erhaltene Enzymkomplex
soll hiernach soweit beständig sein, daß die Aktivitätsverluste nach jeder Umwandlung etwa 10—15%
betragen, aaO, Sp. 7, Z. 37-40.
Auch diese Immobilisierung durch Bindung an einen Träger erfordert organische Stoffe, die für den Einsatz
der Herstellung in größerem Umfang eine Reihe von Nachteilen mit sich bringen, wie z. B. die Anfälligkeit
durch Mikrobenbefall und dadurch bedingte Verluste, Schwierigkeiten in der Aufbewahrung bzw. Lagerung,
sowie eine gewisse Wärmeempfindlichkeit. Besonders nachteilig ist ferner die unzureichende Abmessungsbeständigkeit
infolge von Quellung. Die Abmessungen der Enzymkomplexe verändern sich hierbei in unkontrollierbarer
Weise, so daß der Durchsatz in den für die Massenherstellung erforderlichen Durchlaufkolonnen
schwankt. Diese können u. U. sogar verstopft werden.
Auch die Beständigkeit, insbesondere die Wärmebeständigkeit, sollte für eine rationelle Fertigung im Sinne
verlängerter Halbwertszeiten noch weiter verbessert werden. Das Gleiche gilt für die Dauer der Lagerungsbeständigkeit.
Die Erfindung hat demgegenüber ein Verfahren zur enzymatischen Umwandlung von Glucose zu Fructose
zur Aufgabe, welches die aufgezeigten Nachteile organischer Stoffe vermeidet, eine verbesserte Wärmebeständigkeit,
größere Halbwertszeiten der enzymatischen Aktivität und längere Lagerungsfähigkeit aufweist.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren der Erfindung dadurch gelöst, daß man in den Poren eines
Aluminiunioxidträgers mit Porendurchmessern von 100— 1000 Ä adsorbierte Glucose-Isomerase einsetzt.
Nach weiterer günstiger, insbesondere für den Einsatz in Durchlaufkolonnen in kontinuierlicher
Arbeitsweise geeigneter Ausgestaltung dieses Verfahrens werden Aluminiumoxidpartikel mit Korngrößen
von 0,074—4,76 mm als Träger für das Enzym verwendet. Ganz besonders günstig sind Aluminiumoxidträger mit Porendurchmessern von !40—220 Ä und
Korngrößen von 0,25—0,71 mm.
Im Zusammenhang nichtenzymatischer Glucoseumwandlungsverfahren wird bereits der Einsatz von
feinverteiltem alkalischem Aluminiumoxid vorgeschlagen, US-PS 34 31 253. Das Aluminiumoxid dient hier
nicht als Enzymträger, sondern soll die Nachteile der alkalischen Isomerisierungsverfahren teilweise beheben,
wie z. B. die Entstehung schwer trennbarer unerwünschter Nebenprodukte, Einfärbungen, Säuren,
usw. Die lange erforderliche Verweilzeit der Glucose schließt aber die kontinuierliche Herstellung im
Durchlauf aus, und die Umwandlungsrate bleibt im Vergleich zur Umwandlung durch Enzymeinwirkung
unbefriedigend.
Im Vergleich zu den bekannten, oben erörterten Verfahren der enzymatischen Umwandlung, insbesondere
z. B. dem Verfahren nach der US-PS 37 08 397 unter Verwendung an Celluloseträger gebundener
Glucose-Isomerase mit einer Beständigkeit im Sinne einer Halbwertzeit von etwa 20 Std. werden durch das
erfindungsgemäße Verfahren Halbwertzeiten von 17, 20, 40 und mehr Tagen erreicht. Selbst nach
beispielsweise 31 Tagen kontinuierlichem Betrieb konnten Aktivitätsausbeuten von 19,4% erzielt werden.
Es entfielen im übrigen die Gefahren des Mikrobenbefalls und der unerwünschten Quellung organischer
Träger und das Produkt war monatelang lagerfähig.
Der poröse Aluminiumoxidträger für die Glucose-
Isomerase muß eine durchschnittliche Porengröße von 100—1000 Ä besitzen, um eine maximale Enzymbeschickung
/u gewährleisten. Die untere Grenze von lOOÄ richtet sich nach der größten Abmessung des
annähernd 100 Ä betragenden Glucose-Isomerase-Mo- -,
leküls. Das Molekül muß in die Poren eindringen können und vor Adsorption auf den inneren Flächen des
porösen Trägers muß eine Massendiffusion des Enzyms tief in die Poren stattfinden. Da Glucose-Isomerase einlängliches
Molekül ist, müssen die Poren dieser größten ι ο Ausdehnung mindestens gleichkommen.
Die Notwendigkeit der oberen Grenze von lOOOÄ
ergibt sich aus mehreren Gesichtspunkten. Bei größerer Porenweite nimmt die verfügbare Adsorptionsfläche ab.
Außerdem bietet die Innenstruktur der Poren weniger r, Schutz gegen Ablösung des Enzyms, besonders unter
turbulenten Bedingungen, z. B. bei kontinuierlicher Arbeitsweise im Durchlauf. Die für die Enzymbesetzang
verfügbare Oberfläche des Trägers soll in der Regel größer als 5 qm/g sein. Die bevorzugte durchschnittliehe
Porengröße liegt etwa zwischen 140 und 220 Ä. Die physikalischen Eigenschaften des bevorzugten Trägers
sind weiter unten näher angegeben. Es kann u. U. notwendig sein, das poröse Aluminiumoxid auf eine mit
dem Umsetzungsgefäß vereinbare Korngröße zu zerkleinern.
Bei Verwendung einer Durchlaufkolonne ist die bevorzugte Partikelgröße des Trägers etwa 0,074 —
4,76 mm. Größere Partikel brauchen eine sehr lange Zeit zur Enzymdiffusion, eine größere Verweildauer des
Substrats, erschweren die Substratdiffusion und machen den Umwandlungsprozeß weitgehend unwirtschaftlich.
Kleinere Partikel sind schwierig in der Handhabung, führen zu dichter Packung in der Kolonne und damit
einem sehr starken, verstärkte Auslegung der Ausrüstung erfordernden Druckabfall. Ein besonders bevorzugter
Bereich liegt zwischen etwa 0,25—0,71 mm.
Das poröse Aluminiumoxid wird auf die gewünschte Korngröße gemahlen und klassiert, sodann mit einem
geeigneten Puffer oder Salz hydratisiert. Hydratation bei einem pH von 7 wird für den Aluminiumoxidträger
bevorzugt. Der Puffer wird dann entfernt, das Aluminiumoxid aber vor der Adsorption naß gehalten.
Nunmehr wird die Glucose-Isomerase in Lösungsform zu dem nassen Träger gegeben, und zwar mit einer die 4r>
optimale Adsorption bzw. Beschickung gewährleistenden Konzentration pro Gewichtseinheit Träger. Die
Adsorption wird durch Rühren, Umlauf, Umdrehen, Anwendung eines fluiden Betts oder andere bekannte,
die Massendiffusion des Enzyms durch die Poren fördernde Weise verbessert. Die zur Adsorption
erforderliche Zeitdauer hängt von der Partikelgröße des Trägers, der Größe des Enzyms im Verhältnis zur
durchschnittlichen Porengröße und weiteren Faktoren wie Temperatur und pH-Wert ab. Die Mindestzeitdauer
beträgt etwa '/2 Std. Für die Adsorption von Glucose-Isomerase
in den Poren von Aluminiumoxid mit einer durchschnittlichen Porengröße von etwa 175 Ä erzielt
man in IV2 bis 5 oder 6 Std. die maximale Adsorption.
Sie geht im Bereich von pri 6,9—9 gut vonstatten, t>o
bevorzugt wird der Bereich 7,1 —8,5.
Nach der Adsorption wird loses Enzym mit Wasser, Salzlösung (z. B. 0,5 M NaCl) oder anderen geeigneten,
den Träger oder das gebundene Enzym nicht beeinträchtigenden Mitteln entfernt.
Bei der Verwendung wird das Enzympräparat beispielsweise in eine Kolonne gegeben oder in ein
kontinuierlich gerührtes Umsetzungsgefäß, ein fluides Bett oder anderes für die Einleitung der Substratlösung
geeignetes Gefäß gebracht. In den Beispielen weiter unten wurde das Präparat in Kolonnen mit kontinuierlichem
Durchlauf von glucosehaltigen Lösungen gegeben. Die Kolonnen können mit einem wassergekühlten
Mantel umgeben sein, um die optimale Umsetzungstemperatur oder eine die Enzymlebensdauer möglichst weit
verlängernde Temperatur aufrechtzuerhalten. Eine Behandlungstemperatur von 50—70°, vorzugsweise
60°, sichert nicht nur eine rationelle Glucoseumwandlung zu Fructose, sondern gewährleistet auch eine lange
enzymatische Halbwertzeit. Vorzugsweise enthält die Substratlösung wenigstens etwa 45 Gew.-% Glucose.
Der Inkubations-pH-Wert und das Puffersystem hängen vom Enzym und den Umsetzungsbedingungen
ab. Für die erfin.dungsgemäßen Präparate geht die Umsetzung bei einem pH-Wert von 7,2—8,2 gut
vonstatten. Besonders günstig sind 7,4—7,8 pH. Die Art des im Einzelfall verwendeten Puffers richtet sich
weitgehend nach dem Säuregehalt der Substratlösung, und der inneren Beschaffenheit der Poren.
Wird z. B. eine glucosehaltige Lösung (z. B. 50% Glucose) mit dem Glucose-Isomerasepräparat inkubiert,
so können, wie aus P e r 1 m a η, aaO., S. 566 und 568 bekannt, kleine Mengen von Cobalt- und
Magnesiumionen dem Substrat vor Zusatz zum Enzympräparat beigegeben werden, wodurch sich aber
infolge der Säurewirkung dieser Ionen der Säuregehalt ändert. Geeignete Puffer sind hier z. B. Sulfitsalze, die
gleichzeitig auch die Beständigkeit des Präparats verbessern. Die Auswahl der in Frage kommenden
Puffer liegt im Einzelfall im Bereich des fachmännischen Könnens.
In den folgenden Beispielen I —X wurden Präparate
aus verschiedenen Glucose-lsomerasequellen hergestellt und die langfristige Beständigkeit und Halbwertzeil
bestimmt. Die Präparate wurden unter den für Glucose-Isomerase in abschnittsweisen Umsetzungen
üblichen Bedingungen geprüft. Die angegebenen Werte sind in internationalen Glucose-Isomeraseeinheiten
ausgedrückt (IGIE), in denen eine Einheit die zur Umwandlung von 1 μΜοΙ Glucose in Fructose pro Min.
bei 60° und pH 6,85 nötige Enzymmenge darstellt.
Die folgenden Beispiele zeigen eine im Vergleich zu den aufgezeigten bekannten Verfahren der enzymatischen
Glucose-Fructose Umwandlung überraschend große Lagerbeständigkeit und Beständigkeit im Sinne
langer Halbwertszeiten und lange Brauchbarkeit bei langwährendem kontinuierlichen Betrieb. So war die
Enzymaktivität im Beispiel I noch nach 106 Tagen Lagerung kaum vermindert. Nach 31 Tagen kontinuierlichem
Kolonnenbetrieb war eine gute Aktivitätsausbeute und eine Halbwertzeit von 42 Tagen festzustellen,
Beispiel II. Weitere Versuche nach den Beispielen IH-X ergaben zum Teil noch höhere Halbwertzeiten von 47
und 49 Tagen.
Erhebliche Verbesserungen konnten auch gegenüber den mit porösen Glasträgern gekopelten Glucose-Isomerasepräparaten
nach der US-PS 37 83 101 (Beispiel XI) erzielt werden.
Schließlich konnte durch das Beispiel XII auch nachgewiesen werden, daß die erfindungsgemäß erzielten
Verbesserungen ein überraschender Effekt der vorgeschlagenen in den 100—1000 Ä großen Poren des
Aluminiumoxidträgers adsorbierten Glucose-Isomerase sind. Wie ein Vergleich der Beispiele I —X mit den
Ergebnissen der bekannten enzymatischen Verfahren zeigt, wird dies weder durch das Enzym als Solches,
noch, wie das Beispiel XII zeigt, durch Aluminiumoxidpartikel
als Solche erreicht. Das vorgeschlagene Verfahren zeitigt also synergistisch eine echt überraschende
und überragende Wirkung.
Poröser Aluminiumoxidträger der Beispiele
Porengröße, Durchschnitt (A) 175
Porengröße, Minimum (A) 140
Porengröße, Maximum (A) 220
Oberfläche in qm/g 100
Porenvolumen in ccm/g 0,6
Porösität 62,5%
Partikelgröße in mm 0,25—0,71
Die Porengrößenverteilung wurde in bekannter Weise gemessen; sie entsprach weitgehend der
durchschnittlichen Porengröße (d. h. 90% innerhalb ±26% 175 A).
Ein aus 444 IGiEJg bestehendes, aus Streplomyces-Organismen
gewonnenes rohes Glucose-Isomerasepräparat wurde in einer Menge von 5 g 28,7 ml 0,1 M
Magnesiumazetatlösung in einem 25 ml Becher zugesetzt. Die Aufschlämmung wurde 25 Min. bei Zimmertemperatur
gerührt und dann durch Filterpapier filtriert. Der Rückstand wurde mit 14,3 ml 0,1 M Magnesiumazetat,
dann mit 14 ml 0,5 M NaHCO3 und zuletzt mit 4,3 ml 0,5 M NaHCO3 versetzt und die Lösung unmittelbar auf
dem ursprünglichen Enzymfilter aufgefangen. Ihr Gesamtvolumen (Filtrat) betrug 50 ml.
500 mg poröse Aluminiumoxidkörper wurden in eine 50 ml Kugelflasche gegeben und 10 ml der Glucose-Isomeraselösung
zugesetzt. Die Flasche wurde an einem Rotationsverdampfer befestigt, ein Vakuum angelegt
und die Flasche in einem auf 30—45° gehaltenen Bad 25 Min. rotiert. Weitere 10 ml Glucose-Isomeraselösung
wurden in die Flasche gegeben und die Verdampfung unter denselben Bedingungen während der nächsten 35
Min. fortgesetzt. Zusatz und Verdampfung wurden unter gleichen Bedingungen 4 Std. fortgesetzt. Das
gleiche Verfahren wurde zweimal mit getrennten 10 ml Glucose-Isomeraselösungen wiederholt. Ein abschließender
Teil von 7 ml Glucose-Isomerase wurde dann eingeführt und die Verdampfung bei 45° für weitere 70
Min. fortgesetzt. Die Flasche wurde dann übers Wochenende in einen kalten Raum gebracht. Insgesamt
wurden 47 ml Glucose-Isomeraselösung dem Aluminiumoxid zugesetzt.
50 ml Puffer (0,01 M Natriummaleat, pH 6,8-6,9, enthaltend 0,001 M Cobaltchlorid und 0,005 M Magnesiumsulfat)
wurden zugesetzt und die gesamte Probe 1 Std. bei Zimmertemperatur extrahiert. Der Extrakt in
einer Menge von 50 ml wurde aufbewahrt. Das Präparat wurde mit 200 ml Wasser und anschließend 10 ml 0,5 M
Natriumchlorid und zuletzt über einem Glasfrittentrichter
mit Wasser gereinigt. Das Präparat wurde dann in einen 50-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und im Puffer
bei Zimmertemperatur gelagert. Während eines Zeitraums von 106 Tagen wurden wiederholt Proben zur
Prüfung entnommen.
Ergebnisse
Enzymextraktprüfung (50 ml) - 39,8 IG I E/ml. (Enzymaktivitätsausbeute im Extrakt — 90%).
Durchschnittswert der Präparate — 130 IGlE pro 500 mg Probe (Enzymaktivitätsausbeute — 6%).
Durchschnittliche Beschickung — 260 IGIE/g.
Durchschnittswert der Präparate — 130 IGlE pro 500 mg Probe (Enzymaktivitätsausbeute — 6%).
Durchschnittliche Beschickung — 260 IGIE/g.
Zur Prüfung der Liigerbeständigkcit während des
Zeitraums von 106 Tagen wurden 21 periodische Proben entnommen, von denen 16 eine Aktivität von
100-150IGIE pro 500 mg oder 200-300 IGlF./g zeigten.
Beispiel Il
Zur Prüfung der langfristigen Stabilität und Halbwertzeit des Enzympräparats wurde eine weitere Probe
ίο für eine Durchlaufkolonne mit Glucoselösungsdurchsatz
entsprechend industriellen Einsatzbedingungen bereitet. Die obigen Aluminiumoxidkörper (175 A
durchschnittliche Porengröße, 0,25—0,71 mm Partikelgröße) wurden folgendermaßen vorbehandelt:
11g poröses Aluminiumoxid wurden in einen 100 ml
Zylinder gegeben, 100 ml 0,05 M Magnesiumazetal, 0,1 M Cobaltazetat, pH 7,5 zugesetzt, der Zylinder
verstöpselt, behutsam durch Umdrehen gemischt und in ein 60° warmes Bad gelegt. Nach 15 Min. wurde der
2» Zylinder umgedreht und die Flüssigkeit abgegossen.
100 m) frisches Magnesium-Cobaltazetat wurden zugesetzt,
der Zylinder umgedreht und bei Zimmertemperatur 2 Std. stehen gelassen.
Eine rohe Glucose-Isomeraselösung aus der gleichen Quelle wie zuvor, enthaltend 590 IGIE pro ml in 0,6 M gesättigtem Ammoniumsulfat wurde für die Umsetzung wie folgt gereinigt:
Eine rohe Glucose-Isomeraselösung aus der gleichen Quelle wie zuvor, enthaltend 590 IGIE pro ml in 0,6 M gesättigtem Ammoniumsulfat wurde für die Umsetzung wie folgt gereinigt:
Einer 40 ml Glucose-Isomeraselösung in einem Becherglas wurden zur Enzymausfällung weitere 1,4 g
Ammoniumsulfat zugesetzt und die Ausfällung bei Zimmertemperatur 20 Min. lang gerührt. Die Probe
wurde dann bei 2° 30 Min. mit 16 000UpM zentrifugiert,
die überstehende Flüssigkeit abgegossen und weggeworfen. 12 ml der oben beschriebenen Magnesium-Cobaltazetatlösung
wurden der Ausfällung zugesetzt und gerührt. Sodann wurden 3 ml 0,5 M Natriumbicarbonat
zugesetzt und zur Auflösung des Enzyms gerührt. Die Lösung wurde nun in ein 60° warmes Bad
gesetzt und 15 Min. belassen, anschließend 15 Min. bei 2° mit 16 000 UpM zentrifugiert. Die klare, überstehende
Enzymlösung wurde abgegossen und die Ausfällung weggeworfen. Die Enzymlösung in einer Menge von
28 ml hatte einen pH-Wert von 7,5. Falls während der Reinigung keine Aktivität verloren ging, enthielt die
Lösung 23 600 IGIE.
Die Magnesium-Cobaltazetatlösung wurde nach Umdrehen von den porösen Aluminiumoxidkörpern
abgegossen. 28 ml Enzymlösung wurden dem porösen Aluminiumoxid im Zylinder zugegeben, der Zylinder
verstöpselt, durch Umdrehen gemischt und in ein 60° warmes Bad gesetzt. Das Enzym wurde während 2 Std.
30 Min. bei 60° umsetzen gelassen und während dieses Zeitraums der Zylinder alle 15 Min. umgedreht. Nach
Entnahme aus dem Bad wurde die Umsetzung bei Zimmertemperatur unter Umdrehen über Nach bei
Zimmertemperatur fortgesetzt. Die Enzymlösung in einer Menge von 28,5 ml mit pH 7,1 wurde abgegossen
und aufbewahrt. Das Präparat wurde zuerst mit 60 ml dest. Wasser, dann mit 40 ml 0,5 M Natriumchlorid und
schließlich mit 40 m! Magnesium-Cobaltazetatlösung behandelt. Drei Proben von insgesamt 1 g wurden zur
Prüfung entnommen, die restlichen 10 g in eine thermostatisch auf 60° gehaltene Kolonne überführt. In
die Kolonne wurde eine 50% Glucose und 0,005 M Magnesiumsulfat enthaltende, mit Natriumsulfit auf
7,7—8 gepufferte Lösung eingespeist. Während der ersten 26 Std. wurde der Speiselösung 0,001 M
Cobaltchlorid zugesetzt, nach 26 Std. aber weggelassen,
so du 13 der einzige Aktivator ;uis Magnesiumkmen
bestand. Der Anfangsdurchsatz war annähernd 190 ml/ Std. Durch Verringerung des Durchsatzes in periodischen
Abständen wurde die Fructoseunnvandlung zwischen 80 und 85% der theoretischen gehalten. Die
gesamte Laufzeit der Kolonne betrug etwa 31 Tage. Die Kolonne wurde dann durch Abbrechen der Zufuhr
ausgetrocknet und '5 Std. trocken stehen gelassen. Die
annähernde Halbwertzcit wurde durch Berechnung der gesammelten Produktmenge und der Umsetzung des
Produkts mit 42 Tagen bestimmt. Die Prüfung des Produkts vor dem Gebrauch zeigte eine Beschickung
von 381 IGIE pro g, was einer Aktivitätsausbeute von 17,8% der gesamten, dem Träger ausgesetzten IGIP!
ausmacht. Eine Prüfung der 28,5 ml Enzymlösung zeigte 161 IGIE pro ml, also eine Aktivitätsausbeute von etwa
19,4%. Der pH-Wert der Kolonne wurde durch entsprechende Einstellung der Zufuhr auf 7,4 — 7,8
gelialtcn. Die gesamte Kolonnenbeschickung war 3810
KiIE.
Beispiele 111 - X
Zur Bestimmung des Einflusses verschiedener Puffersyslcmc auf die Halbwertszeit der Präparate wurden
Versuche in acht Kolonnen durchgeführt. In jedem FaI
wurde die Flueose-Isomerase auf dem oben beschriebenen porösen Aluminiumoxidträger adsorbiert. Das
Enzym stammte aus zwei verschiedenen Quellen. In den ■j Beispielen III und IV stammte es wie in den vorigen
beiden Beispielen von Strcpiomyces-Organismcn (als Quelle A bezeichnet). In den Beispielen V bis X stammte
es von einem anderen Streptomyces-Organismus (Quelle B). Das Adsorptionsverfahren entsprach im
in wesentlichen dem Beispiel II, 10 g des Präparats wurden
in jede Kolonne gegeben. Eine 50%ige Glucose-Isomeraselösung
mit dem jeweils angegebenen Puffersystem wurde durch jede Kolonne geleitet, wobei der
Durchsatz periodisch verändert wurde, um eine
π Umsetzung von 84%) der theoretischen (theoretisch
Endprodukt mit 50 — 50 Glucose-Fructosclösung) zu erzielen. Alle Substratlösungen und die Kolonnen
wurden durch Thcrmostalc auf 60" gehalten und dei
pH-Wert auf konstant 7,8 eingestellt. Die Enzymbeschickung jeder Kolonne ist in IGIE/g in Mittelwerten
mit oberen und unteren 95%igen Wahrscheinlichkeils· grenzei angegeben. Der Beschickungsgrad bezeichnet
das prozentuale Verhältnis auf der gesamten Trägermenge adsorbierter IGIE zur Anfangszahl IGIE bein"
2-, Adsorptionsverfahren.
Beispiel | Knzym- | Beschickung IGIE/g | obere | Beschickungs- | Subsiiatziisätzc (M) | Anfangs- | Halbwcrt |
qucllc | Grenze | grad in % | dii rchsatz | in Tagen | |||
untere mittlere | in ml/Std. | ||||||
Grenze Grenze | |||||||
554
573
591
76,5
IV A 510 563 616 70,8
V B 164 206 248 36,5
Vl B 17b 192 209 32,3
VII B 179 204 229 39,9
VIII B 372 407 441 49,2
IX B 268 398 528
X B 372 407 441 49,2
0,004 MgSO-i
0,001 CoCb
0,004
0,001 CoCb
0,004
0.005 MgCb
0,001 CoCb
0,004
0,001 CoCb
0,004
0,005 MgCb
0,001 CoCb
0,004 N a .'SO 3
0,001 CoCb
0,004 N a .'SO 3
0,005 MgCb
0,001 CoCb
0,004NHiHCOi
0,001 CoCb
0,004NHiHCOi
0,005 MgCb
0,004NHiHCOi
NoCo+ -t
0,004NHiHCOi
NoCo+ -t
0,005 MgSO4
0,001 CoCb
0,004 Na2.SOj
0,001 CoCb
0,004 Na2.SOj
0,005 MgCb
0.004NHiHCOi
NoCo''
0.004NHiHCOi
NoCo''
0.005 MgSOi
0,001 CoCIj
0.004 NaiHPOi
0.001 NajPOi
0,001 CoCIj
0.004 NaiHPOi
0.001 NajPOi
122
112
45
38
48
74
74
36
49,0
23
47,0
17.0
18,0
38,0
23,0
20,0
Beispiel Xl
Die I lalbwertzeilen der Präparate nach den Beispielen
Il - X übertreffen noch chemisch an einen porösen (Ilasträger gekoppelte Gliiiose-Isomerascpräparate hr>
null.·! entsprechenden Bedingungen. Die chemisch gekoppelte Glucose-Isomerase wurde nach dem Verlies
IIS PS J7KJI01 hergestellt. Der Träger
bestand aus mit Zirkonoxid überzogenem porösen Glas an das das Enzym aus der Quelle A chemisch gekoppel
wurde. Das Material wurde in einem abschnittsweise! Umsctztingsgefäß unter gewöhnlichen Bedingungei
geprüft und besaß eine Aktivität von 1068 K 1117g. Dii
Prüflösung bestand aus 2 M Glucose enthaltend 0.02 IV MgSOi und 0,001 M CoCI...
Kine 10.2 g Trockengewicht dieses chemisch gekoppelten
Kn/ympräparats enthaltende Kolonne wurde 18 Tage lang bei 60 gefahren. Kine 50"/nige Glueoselösimg
wurde mit einem konstanten Durchsalz von 124—I Jl inl/Sld. durch die Kolonne geleitet. Die
Aktivität in tier Kolonne wurde auf Grund einer die in
bekannter Weise gemessene Umwandlungsraie (% Fructose) und den Durchsatz, der .Speiselösung in
Beziehung setzenden empirischen Kormel errechnet. Der Fructoseprozentsatz wurde mit einem automatischen
Bendix Polarimeter in zwölf zeitlichen Abständen von 3 bis 431 Std. gentessen und zeigte eine Aktivitätsabnahme von 934 — 473 IG I E/g. Die geschützte
Halbwertzeit wurde mit 16,6 Tagen mit 95% Wahrscheinlichkeit 14,8—18,8 Tagen ermittelt. Während der
ersten 24 Std. bestand die .Speiselösung aus 50 Gew.-% Glucoselösung, enthaltend 0,005 M MgSO4, 0,004 M
Nü.SOi und 0,001 M CoCI» mil einem pH-Wcn von 7.8.
Während der restlichen Laufzeit wurde die Spciselösung ohne CoCl·, im übrigen aber mit der gleichen
Zusammensetzung eingeleitet.
Der Vergleich zeigt höhere Werte für auf porösen Aluniiniunioxidkörpern adsorbierte Glucose-Isomerase.
Außer einer längeren Halbwertzeit unter gleichen Bedingungen ist das Präparat infolge geringerer Kosten
des Trägcrniaterials und einer kleineren Anzahl von Vcrfahrensschritien auch wirtschaftlicher in der Herstellung.
Beispiel XII
Im Hinblick auf die aus der US-PS 34 31253
bekannten Möglichkeit der Glucose-Fruetoseumwandlung
allein mit basischen Aluniiniumoxidgranulat wurde der Einfluß des porösen Aluminiumoxids beim Vorgehen
nach den Beispielen H-X untersucht. Es wurde eine 11 g poröses Aluminiumoxid, mit 0,05 M Magnesiumazetat
und 0,01 M Cobaltazetat enthaltende Kolonne unter Wiederholung der in den Beispielen angegebene!
Voradsorptionsbehandlung gefahren.
Das behandelte, poröse Aluminiumoxid wurde in eim thermostatisch auf b0" gehaltene Kolonne gegeben unc
eine Lösung von 0,005 M MgSO1, 0,004 M Na..SO
0,001 M CoCl. und 50Gew.-% Glucose bei pH 7,8 mi
einem konstanten Durchsatz von etwa 45 ml/Std. el ure I
die Kolonne geleitet. (Ein 277 IGIE/g enthaltendes adsorbiertes Glucose-Isomerasepräparat ergab 841M
der theoretischen Umwandlung von Glucose zi Fructose unter sonst gleichen Bedingungen). Eine Probi
des Ablaufs der nur Aluminiumoxid enthaltende! Kolonne wurde täglich gesammelt und zur Bestimmung
der prozentualen Umwandlung mit einem Polarimetei gemessen, wobei das Instrument mit der Speiselösun^
auf Null eingestellt wurde. Der pH-Wert des Produkt; wurde ebenfalls gemessen. Die Ergebnisse waren wit
folgt:
Tag | Durchsatz | Fructose, | Produkt |
lheoret. | |||
(ml/Std.) | (%) | (pH) | |
r> I. | 43,8 | 4,8 | 5,4 |
2. | 47,0 | 0,0 | 6,4 |
3. | 47,0 | 0,0 | 7,5 |
4. | 47,0 | 0,0 | 7,5 |
Zur Bestimmung der prozentualen Umwandlung infolge der Erhitzung der Speiselösung wurde eine
weitere Kolonne ohne Aluminiumoxid oder Enzympräparat bei 60" mit einem Durchsatz, von 45 ml/Std
gefahren. Die Umwandlung wurde mit 0,5% und der Produkt-pH-Weri mit 7.45 gemessen. Somit ist das
Aluminiumoxid für die Glucose-Fructoseumwandlung nicht als konsaiiv zu werten.
Claims (3)
1. Verfahren zur Isomerisierung von Glucose zu Fructose durch Einwirkung immobilisierter Glucose-Isomerase
auf eine Glucose enthaltende, schwach alkalisch gehaltene wäßrige Lösung bei erhöhter
Temperatur, dadurch gekennzeichnet, daß man in den Poren eines Aluminiumoxidträgers
mit Porendurchmessern von 100- !000 Ä adsorbier- in te Glucose-Isomerase einsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Aluminiumoxidträger Korngrößen
von 0,074—4,76 mm aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Aluminiumoxidträger Porendurchmesser
von 140—220 Ä und Korngrößen von 0,25—0,71 mm aufweist.
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