DE2402452C2

DE2402452C2 - Durchführung von Enzymreaktionen

Info

Publication number: DE2402452C2
Application number: DE2402452A
Authority: DE
Inventors: Des Erfinders Auf Ne Verzicht
Original assignee: Anic SpA
Current assignee: Anic SpA
Priority date: 1973-01-26
Filing date: 1974-01-18
Publication date: 1983-05-11
Also published as: ZA74150B; HU172074B; NL175436C; NL7400882A; AU6442674A; CA1005771A; CH606431A5; GB1461841A; JPS5645593B2; AT330120B; SU504503A3; LU69227A1; DE2402452A1; JPS49108286A; ATA63374A; IT978495B; FR2215465A1; NL175436B; FR2215465B1; SE404184B

Description

15

Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren. Der Patentanspruch 2 nennt eine Ausgestaltung der Erfindung.

Bekanntlich finden Enzymreaktionen im Wasser statt, da letzteres das bestmögliche Lösungsmittel für Enzyme ist und deren Aufbaubeständigkeit sicherstellt, von der die katalytische Wirksamkeit abhängt

Das setzt bei all denjenigen Reaktionen gewisse Grenzen fest, bei denen Ausgangsstoffe (Substrate des Enzyms) verwendet werden müssen, die wasserunlöslich sind und daher den Einsatz organischer Lösungsmittel benötigen. Bekanntlich Oben letztere in den meisten Fällen eine die Enzyme denaturierende Wirkung aus, zumal wenn sie wasservermischbar sind.

Andererseits taugen wasserunmischbare Lösungsmittel als Enzymlösungsmittel fast nie, so daß Enzymreaktionen in homogener organischer Phase meist undurchführbar sind.

Das bringt eine wesentliche Einschränkung des Zustandekommens von Enzymumwandlungen aller schlecht wasserlöslicher Substrate mit sich, wovon einige (Steroide, Terpene, Lipidderivate, Liophilerzeugnisse mit pharmakologischer Wirkung u.a.m.) gebrauchsmäßig und wirtschaftlich von großem Interesse sind. Man könnte daher an die Möglichkeit denken, eine bessere Dispersion der Substrate durch Emulgieren derselben in der wäßrigen Phase des Enzyms zu erzielen; diesem Verfahren sind jedoch engere Grenzen gesetzt, sei es, weil viele der gangbarsten Dispergiermittel eine Desaktivierung des Enzyms verursachen, sei es, auch weil diese Technik bei Substraten mit höherem Schmelzpunkt als die Raumtemperatur nicht anwendbar ist.

Wir haben nun festgestellt, daß es möglich ist, Enzymumwandlungen wasserunlöslicher Substrate bei guter Ausbeute gemäß der Erfindung vorzunehmen; das dabei eingesetzte organische, wasserunmischbare Lösungsmittel wirkt als gutes Lösungsmittel für das Substrat, so daß das Enzym in seinem natürlichen Wasserelement arbeitet und eine direkte denaturierende Wirkung des Lösungsmittels vermieden wird.

Die Aufgabe des organischen Lösungsmittels besteht nicht allein in der Lösbarmachung des Substrats, sondern auch in der Sicherstellung einer gleichbleibenden Konzentration (die bei schlecht wasserlöslichen Stoffen praktisch der Sättigung gleicht) in der wäßrigen Phase, in welcher sich die Enzymumwandlung vollzieht

Zu dieser Aufgabe als »Speicher« kommt noch eine weitere, hinsichtlich der Reaktionsgeschwindigkeit äußerst wichtige Aufgabe hinzu, die in der fortgesetzten Extraktion der Reaktionsprodukte aus der wäßrigen Phase seitens des wasserunmischbaren Lösungsmittels besteht Das gilt in den Fällen (die ">ei weitem überwiegen), wo die Enzymumwandlungserzeugnisse unlöslicher Substrate einen gegenüber der organischen Phase noch günstigen Verteilungskoeffizienten besitzen. Diese Extraktionswirkung der Reaktionsprodukte läßt sich z. B. durch Emulgieren der Substrate nicht erzielen, und sie stellt eine vorteilhafte Eigenschaft der hier beschriebenen Technik dar.

Die Bedeutung dieser Entziehung der Produkte ist in bestimmten Fällen besonders bemerkenswert und sie beschränkt sich nicht auf eine Verlagerung des Reaktionsgleichgewichts durch Massenwirkung, sondern sie ist besonders in den zahlreichen Fällen wertvoll, wo eine Zunahme des Konzentrationsgrades der Reaktionsprodukte im wäßrigen Element eine die katalytische Wirkung des Enzyms hemmende Aktion ausübt

Die Erfindung kann bei Enzymreaktionen angewandt werden, bei welchen das Enzymsubstrat im Wasser unlöslich bzw. schwer löslich ist Ein besonderes Anwendungsgebiet der Erfindung bilden Enzymumwandlungen der Steroide, wie z. B. Oxydationen, Hydroxylierungen, Dehydrierungen. Weitere Enzymreaktionen wie z. B. Umwandlung des Salicylate in Pyrocatechin, Oxydation der Dihydroxyphenole, Oxydation aromatischer Kohlenwasserstoffe, lassen sich durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorteilhaft durchführen.

Als brauchbare organische Lösungsmittel können folgende angeführt werden: Ester von Carbonsäuren mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen, Alkyläther von Alkoholen mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen, aliphatische, aromatische oder cycloaliphatische kohlenwasserstoffe, Halogenide.

Beispiel 1

LAKKASE Enzymquelle:

gereinigtes Enzym aus Kulturflüssigkeit des Pilzes Poliponis versicolor.

Reaktion:

Substrat + O₂

Oxydationsprodukte des Substrates + Η,Ο. Aktivitätstest

Gemisch wird bei 25° C unter Rührung mit reinem Sauerstoff oder mit in der gasförmigen Phase Bei einem typischen Verfahren werden 5 ml Äthylace- 63 vorhandener Luft bebrütet. Zu verschiedenen Zeitpunktat, die 10 mg östradiol (3,6 χ 10"² M)/ml enthalten, mit ten werden je 5 ml der organischen Phase entnommen gleichem Volumen Pufieracetat 0.1 M, pH 5.4 emulgiert, und für die Analyse des östradiol und etwaiger welche Lakkase 0,060 mg/ml (10"⁶M) enthalten. Das Oxydationsprodukte benutzt.

Ergebnisse

Nach vierstündigem Verbleiben unter den beschriebenen Versuchsbedingungen ist die Hälfte des östradiols in (zumindest 5) chromatographisch erkennbare s Produkte umgewandelt Bei ähnlichen Versuchen, die in Abwesenheit des organischen Lösungsmittels durch Sättigung des die Lakkase enthaltenden Pufferacetats mit östradiol ausgeführt wurden, war es anhand der üblichen Analysenverfahren nicht möglich, die Reaktion nachzuweisen. Das ist wahrscheinlich auf die in der ^ wäßrigen Phase erzielbare, unausreichende Konzentration des Steroids zurückzuführen.

Verzeichnis der erprobten Substrate

Unter den erwähnten Versuchsbedingungen erfolgt die Umwandlung nachstehend aufgeführter Substrate mit annähernd gleicher Geschwindigkeit (t\n=4 Stunden) wie beim östradiol: Östradiol, östron, östriol, Äquilin, Äquilenin, Diäthylstilböstrol.

Durch viele weitere wasserunmischbare, organische Lösungsmittel wurde das Äthylacetat bei gleichen Ergebnissen ersetzt, z. B.: Trichloräthylen, Diäthyläther, Äthylendichlorid.

Betspiel 2

HYDROXYSTEROID - DEHYDROGENASE (HBDH) Enzymquelle:

aus Zellen des Pseudomonas Testosteron (Sigma H 9004).

Reaktion:

+ HASDH
Testosteron + NAD ^£ 7 4-androsicrön, 3,17-dion + NADH τ H⁺;

HSDH = Hydroxysteroid - Dehydrogenase,
NAD = Nicotinamid - Adenin - Dinukleotid.

Versuchsbedingungen organischen Lösungsmittels bei 22° C emuigiert Das Gemisch wird unter ständiger Rührung gehalten (100

3,2 ml Pufferphosphat, μ OA pH 7,6, die 2,5 mg NAD+ Stöße je Minute) und die optische Dichte der wäßrigen und 0.05 Einheiten HSDH enthalten, wurden mit 3,2 ml jo Phase bei 340 nm wird zu verschiedenen Zeitpunkten eines 13 mg Testosteron (1,4 χ 10-²M) enthaltenden gemessen.

Versuchsdaten	O. D. 340 nm	O. D. 340 nm
Organische··	nach	nach
Lösungsmittel	2 Stunden	22 Stunden
	1.4	3.4
Äthylacetat	1.3	3.2
Butylacetat	1.2	2.5
Äthyläther	0.55	1.9
Butanol
O. D. = optische Dichte.

In Abwesenheit des organischen Lösungsmittels ist die Gesamtzunahme der optischen Dichte bei 340 nm durch die Wasserlöslichkeit des Testosterons eingeschränkt (die gesättigte Lösung enthält 25-30μg Testosteron/ml). Ohne organisches Lösungsmittel übersteigt sie daher nie einen Wert von etwa 0,3.

Beispiel 3

HYDROXYSTEROID - DEHYDROGENASE + LACTI - DEHYDROGENASE Enzymquellen:

HYDROXYSTEROID - DEHYDROGENASE (HSDH) aus Zellen von Pseudomonas Testosteron; Lacti - Dehydrogenase (LDH) (Boehringer).

Reaktionen:

1. Testosteron + NAD <■ ₇ Androsteron 3,17-dion + NADH + H⁺.

2. Pyruvat + NADH + H

Lactat + NAD

_K _ (Andr) (NADH) (H+) ^

*' (TeSt)(NAD) ^26X1°

(LaCt)(NAD-)
² (PyD(NADH)(H⁺) °'^{4 10} '

5 6

Die Glfciohgswichtstanstante für die verbundenen Reaktionen 1 und 2 igt;

Dem Gleichgewicht nach erscheint die Reaktion von der Konzentration von (H⁺) und NAD¹* oder NADH unbeeinflußt

Verfahren

10

Bei einem Musterversuch werden die beiden Enzyme LDH und HSDH 3 mi einer den oxydierten Kofaktor und das Na-Pyruvat enthaltenden Pufferlösung zugesetzt Der wäßrigen Lösung wird ein gleich großes Volumen an organischer, das Steroid enthaltende Phase beigemischt und die Reaktion beginnt beim Emulgieren der beiden Phasen. Die Reaktion wird unter Rührung des Behälters in einer Schwingvorrichtung bei 90 Schwingungen in der Minute fortgesetzt

Der Verlauf der einzelnen Reaktionen wurde durch Bestimmung der in der organischen Phase vorkommenden Mengen an umgewandeltem bzw. nicht umgewandeltem Steroid verfolgt

Zu bestimmten Zeitpunkten werden die Phasen verrührt, ein genau gemessenes Volumen der organisehen Phase wird entnommen sowie Testosteron und Androstendion per TCL durch Elution mit dem Äthylacetat-Benzol-n-Hexan-System (100:80:60) getrennt

Die Steroide werden vom Träger mit CHCI3 extrahiert (24 h bei Raumtemperatur) und nach Verdunsten des CHCl₃ bei 240 nm in ETOH spektrophotometrisch analysiert

Experimenteller Teil

Umwandlungsversuche sind vorgenommen worden, bei welchen die Konzentrationsverhältnisse nahe der Hemmgrenze des LDH (0,2 molar Pyruvat) lagen.

Der Zweck war, zu erweisen, daß es möglich ist, aus kleinen Volumen und niedrigen Mengen HAD hohe Mengen umgewandelten Disteroids zu gewinnen, eine restlose Umsetzung und daher einen hohen Reinheitsgrad des Produktes zu erzielen.

Nachdem rohes HSDH verwendet wurde, das die Isomerase Δ*-Δ⁵ enthält, sind diese Versuche bei verschiedenen pH-Werten vorgenommen worden.

Wäßrige Phase:

1,5 ml F¹Ufferphosphat 0,4 mol 15 Na-PyruvatflmlHzO) 1500 γ NAD (0,5 ml H₂O) 1,5 mg LDH = 1,6 Einheiten HSDH = 0,16 Einheiten Organische Phase:
3 ml Butylacetat
30 mg Testosteron

pH	Umsetzungs-%	nach	46h	72 h	Spuren von
	3 h 45'	22 h	84	93	Steroktisomer
6.8	14	50	90	95	vorhanden
7.3	18	58	92	100	vorhanden
7.5	20	62	96	100	vorhanden
8.8	30	70		nicht vorhanden

Es wird angenommen, daß es sich bei den Spuren des Steroids, das in den TLC and Rf-Platten größer als Δ* Androstendion erscheint um Δ⁵ Androstendion handelt

Aus den Tabellenangaben gefct hervor, daß man nach 72 Stunden Reaktion mit pH zwischen 7,5 und 8,8 die volle Umsetzung erzielt, daß aber das Reaktionsprodukt erst bei pH 8,8 chromatographisch rein ist so

Beispiel 4 LIPASE

Veränderliche Mengen Lipase (Koch-Light cat ·λ 1503 L) wurden in 5 ml Na-Malat-Puffer 0,1 M, pH 6,5 aufgelöst

Im ersten Fall wurden 5 ml Enzymlösung mit 2,5 ml Olivenöl geschlagen, in 2,5 ml Dichloräthan gelöst und eine Stunde lang bei 37°C unter Ruht ung bebrütet to

Im zweiten Fall wurden 5 ml Enzymlösung mit 2,5 ml Olivenöl geschlagen und eine Stunde lang bei 37⁰C unter Rührung bebrütet

Daraufhin wurden 30 ml eines Gemisches gleicher Anteile von Aceton und Äthanol zugesetzt um die bs Emulsion zu brechen, und die durch Enzymkatalyse freigewordenen Fettsäuren mit Natron 0,05 M titriert

Die Versuchsdate? lauten:

Lipase

Versuch

mit Lösung*- ohne Emulsion mittel ohne Lösungsmittel

μ Mol freigewordeiK FetUiure in 1 h bei 37-C

97
206
310
439

280 400

Beispiel 5 ALKOHOL-DEHYDROGENASE

Enzymquelle:

Hefe(Borhringer 154 18 EAAD) Reaktion:

Butanol + NAD⁺-* Butyraldehyd + NADH + H ⁺

I.Versuch
mit Butanol ohne Lösungsmittel

Das Reaktion>gemisch besteht aus 10 ml Puffer-Pyrophosphat 0,1 M, pH 9, in denen folgende Stoffe gelöst sind:

7 8

Semi-carbazid HCI 12,5 mg 2. Versuch

5!^yci". , . 16,7 mg Butanol mit zugesetztem Benzol
Glutathion, reduziert 3 mg

NAD 30 mg Das Gemisch des ersten Versuches wird mit einem

5 Gemisch aus 5 ml Butanol und 5 ml Benzol unter Rühren

Das Gemisch wird mit 5 ml Butanol unter Rühren bei bei 20° C bebrütet
2O⁰C bebrütet

Venuchsangftben Zeil (Minuten) Optisch« Dichte bei 340 nm

1. Verweh 2. Venu· h

0	0,190	0,190
5	3,85	3,80
10	4,95	5^0
30	7,65	9,60
60	Qi	η.*-
145	103	15,0
180	11,4	163
300	11,7	17,5
1320	12,2	20,4

Bei Anwesenheit des Butanols allein wurde eine 25 j stellt, daß die Konzentration des n-ButanoIs in der

Entaktivierung des Enzyms festgestellt, die die Tatsache wäßrigen Phase - wegen des weniger günstigen

erklärt, daß die Reaktion beim ersten Versuch nach fünf Verteilungskoeffizienten — um 3%, also bedeutend

Stunden nur mäßig vor sich geht niedriger var als beim Versuch ohne aromatisches

Bei den Arbeitsbedingungen des zweiten Versuchs Lösungsmittel,

wurde durch gaschromatographische Analyse festge- 30

Claims

Patentansprüche;

1, Verfahren zur Durchführung von Enzymreaktionen, be! welchen das Substrat in der das Enzym enthaltenden Flüssigkeit schlecht löslich ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in Anwesenheit eines wasserunmischbaren, mit dem Substrat jedoch mischbaren organischen Lösungsmittel erfolgt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat dem organischen Lösungsmittel als Lösung zugesetzt wird.

10