DE2402452A1

DE2402452A1 - Enzymreaktionsverfahren durch zweiphasige wasser-/organische systeme

Info

Publication number: DE2402452A1
Application number: DE2402452A
Authority: DE
Original assignee: SnamProgetti SpA; ISF SpA
Current assignee: SnamProgetti SpA; ISF SpA
Priority date: 1973-01-26
Filing date: 1974-01-18
Publication date: 1974-08-01
Also published as: LU69227A1; JPS49108286A; NL7400882A; HU172074B; FR2215465A1; CH606431A5; DE2402452C2; AT330120B; AU6442674A; FR2215465B1; ZA74150B; CA1005771A; ATA63374A; NL175436C; IT978495B; SU504503A3; NL175436B; JPS5645593B2; BE810170A; US3926726A

Description

Case 2(o^LtlS'

Firma SNAM PROGETTI S.ρ.Α., Mailand und Firma I.S.F. Societä per Azioni, Trezzano sul Naviglio

Italien. ■ . _o . '"

Enzymreaktionsverfahren durch zweiphasige Wasser-/organische Systeme.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Enzymreaktionsverfahren durch zweiphasige Wasser-Zorganische Systeme.

Bekanntlich finden Enzymreaktionen im Wasser statt, da letzteres das bestmögliche Lösungsmittel für Enzyme ist und deren AufbaubestSndigkeit sicherstellt, von der die katalytische Wirksamkeit abhängt.

Das setzt bei all denjenigen Reaktionen gewisse Grenzen

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fest, bei denen Ausgangsstoffe.(Substrate des Enzymkatalysators) verwendet v;erden müssen, die wasserunlöslich sind und daher den Einsatz organischer Lösungsmittel benötigen. Bekanntlich üben letztere in den meisten Fällen eine die Enzyme denaturierende Wirkung aus, zunal wenn sie· wasservermischbar sind.

Andererseits taugen wasserunmischbare Lösungsmittel als Enzymlösungsmittel fast nie, sodaß Enzymreaktionen in homogener organischer Phase meist undurchführbar sind.

Das bringt eine wesentliche Einschränkung des Zustandekommens von Znzynumwandlungen aller schlecht wasserlöslicher Substrat mit sich, wovon einige (Steroide, Terpene,Lipidderivate, Lxophxlerzeugnisse mit pharmakologischer Wirkung u.a.m.) gebrauchsmäßig und wirtschaftlich von'großem Interesse sind. Man könnte daher an die Möglichkeit denken, eine bessere Di'spersion der Substrate durch Emulgieren' derselben in der wässrigen Phase des Enzyms zu erzielen; diesem Verfahren sind jedoch engere Grenzen gesetzt, sei es weil viele der_t gangbarsten Dispergiermittel eine Desäktivierung des Enzyms verursachen, sei es auch weil diese Technik bei Substraten mit höherem Schmelzpunkt als die Raumtemperatur nicht anwendbar .ist.. ' . .

V/ir .haben nun festgestellt, daß·.es. möglich ist, Enzymumwandlungen wasserunlöslicher Substrate bei guter Ausbeute vorzunehmen, ' indem solche zweiphasige Wasser - orga'-nische Systeme eingesetzt werden, deren organisches(wasserunmischbare) Lösungsmittel als gutes Lösungsmittel für das Substrat wirkt, so daß das Enzym in seinem natürlichen V/asserelement arbeitet und eine direkte denaturierende Wirkung des Lösungsmittels vermieden wird.

Die Aufgabe des organischen Lösungsmittels besteht nicht allein in der Lösbarmachung des Substrates, sondern auch in der Sicherstellunir einer gleichbleibenden Konzentration (die bei schlecht wasserlöslichen Stoffen praktisch der Sätti-rimc: gleicht) in der wässrigen i-'hase, in welcher sieb die Enzvr,-umwandlung vollzieht.

Zu dieser Aufgabe als "Speicher" kcmnt noch nine v/eitere.

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hinsichtlich der Reaktionsgeschwindigkeit äußerst wichtige Aufgabe hinzu, die in der fortgesetzten Extraktion der Reaktionsprodukte aus der wässrigen I^:hase seitens des v/asserunmischbaren Lösungsmittels besteht. Das gilt in den Fällen (die bei weitem überwiegen), wo die Enzymumwandlungserzeugnisse unlöslicher Substrate einen gegenüber der organischen Phase noch günstigen Verteilungskoeffizienten besitzen» Diese Extraktionswirkung der Reaktionsprodukte läßt sich z-Bo durch Emulgieren der Substrate nicht erzielen, und sie stellt ein vorteilhaftes Merkmal der hier beschriebenen Technik dar.

Die Bedeutung dieser Entziehung der Produkte ist in bestimmten Fällen besonders bemerkenswert und sie beschränkt sich nicht auf eine Verlagerung des Reaktionsgleichgewichtes durch Massewirkung, sondern sie ist besonders in den zahlreichen Fällen*wertvoll, wo eine Zunahme des Konzentrationsgrades der Reaktionsprodukte im wässrigen Element eine die katalytische Wirkung des Enzyms hemmende Aktion ausübt.

Ohne daß dadurch eine Einschränkung des Schutzbereiches entsteht, kann die Erfindung bei ilnzyiareaktionen angewandt werden, bei welchen das Enzymsubstrat im V/asser unlöslich bzw. schwer löslich ist. Ein besonderes Anwendungsgebiet der Erfindung bilden Encyrnumwandlungen der--Steroide,, wie z.B. Oxydationen,' Hydroxyl!erungen, Dehydrierungen. Weitere Enzymreaktionen wie z.B. Umwandlung des Saiicylats in Pyrocatechin, Oxydation der Dihydroxyphenole, Oxydation aromatischer Kohlenwasserstoffe, lassen sich durch Anwendung des erfindungs.-gemäßen Verfahrens vorteilhaft durchführen. . '

Als brauchbare organische Lösungsmittel können folgende angeführt werden:Ester von Carbonsäuren mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen, Alkylather von Alkoholen mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen, aliphatisch^, aromatische" oder cycloaliphatische Kohlenwasserstoffe, Halogenide.

Beispiel 1
LAKKASE

gereinigtes Enzym aus Kulturflüssigkeit des Pilzes Poliporos

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versicolor.

.Reaktion

Substrat -i- O₂ Oxydationsprodukte des Substrates

Aktivitätstest

Bei einem typischen Verfahren werden 5 ml Äthylacetat, die 10 mg/ml östradiol (3,6x10 M) enthalten, mit gleichem Volumen Pufferacetat 0,1M, pH 5-4- emulgiert, welche Lakkase 0.060 mg/ml (10"⁶M) enthalten. Das Geraisch wird bei 25°C unter Rührung mit reinem Sauaerstof oder mi-fc in der gasförmigen Phase vorhandener Luft bebrütet. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden je 5 ml der organischen Phase entnommen und für die Analyse des Estradiol und etwaiger Produkte benutzt.

Ergebnisse

Nach vierstündigem Verbleiben unter den beschriebenen Versuchsbedinjungen ist die Hälfte des Estradiols in (zumindest 5) chrornatographisch erkennbare Produkte umgewandelt. Bei ähnlichen Versuchen, die in Abwesenheit des organischen Lösungsmittels durch Sättigung des die Lakkase enthaltenden ■ Pufferacetates mit Estradiol ausgeführt wurden, war es anhand der üblichen Arialysenverfahren nicht möglich die Reaktion nachzuweisen. Das -ist wahrscheinlich auf ...die', in der wässrigen 'Phase erzielbare, unausreichende Konzentration des Steroids zurückzuführen.

Verzeichnis der erprobten Substrate

Unter den erwähnten Versuchsbedingungen erfolgt die Umwandlung nachstehend aufgeführter Substrate mit annähernd gleicher Geschwindigkeit (^/p⁼ ^ Stunden) wie beim Estradiol: Estradiol, Estron, Estriol, Äquilin, Äquilenin, Diäthylstilbestrol.

Diich viele v/eitere, organische Lösungsmittel wurde das iithylacetat bei gleichen Ergebnissen ersetzt, z.B.: Trichloräthylen, Diäthyläther, Athylendichlorid.

Beispiel 2 HYPaOXrSTEROID - DaiTfnROGENASa (HoIJll)

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Enzymquelle

aus Zellen des Pseudomonas Testosteron (Sigma H 9004).

Reaktion

■Testosteron + NAD £ HASIIg 4-androsteron, 3,17-dion + KADH +

HSDH = Hydroxysteroid - Dehydrogenase NAD = Nicotinamid - Adenin - Dinukleotid

Versuchsbedingungen

3,1 ml Pufferphosphat, μ 0.2 pH 7-6, die 2.5 mg NAD⁺ und 0.05 Einheiten HoDH enthalten, wurden mit 3.2 ml eines 13 m

—?

Testosteron (1.4- χ 10 M) enthaltenden organischen Lösungsmittels bei 22⁰C emulgiert. Das Gemisch wird unter ständi-' ger Rührung gehalten (100 Stöße je Hinute) und die optische Dichte 'der wässrigen Phase bei 34-0 nm wird zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen.

Versuchsdaten . .

Organisches Lösungsmittel

Athylacetat

Butylace.tat -

Äthyläther· ··. .'-..- ' .·■ Butanol

O.D. = optische Dichte " - .

In^- Abwesenheit des organischen Lösungsmittels ist die Gesamtzunahme der optischen Dichte bei 34-0 nm durch die Wasserlöslichkeit des Testosterone eingeschränkt (die gesättigte Lösung enthält 25 - 30/ig Testosteron / ml). Ohne organ!-■ sches Lösungsmittel übersteigt sie daher nie einen V/ert von etwa 0.3· · .

Beispiel 3 . . -■

HYDROXYSTEROID - DEHYDROGENASE + LAOTI - DEHYDROGENASE

Enzymquellen ■ '

HYDROXIBTEROID - DEHYDROGENASE (HSDH) aus Zellen von Pseudonomas Testosteron; Lacti - Dehydrogenase (LDH) (Boehringer)o

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0.	D. 340 nm	0.	D. 340 nm
. .nach	2 Stunden	nach.	22 Stunden
	Λ Λ		3.4
-	,1.3 .	·■-	3,2.·
	1.2·, -		2.5' · ■ ··'■
	0.55		i.9' '

Reaktionen

1. Testosteron + NAD A_n£_rOsteron $.17 - dion + NADH + H⁺

2. Pyruvat + NADH + H Lactat + NAD⁺

K = (Andr) (KADH) (H⁺) _{= 26χ10} -9 ¹

¹ (Test) (NAD)

₌ _{= 0}.4x10¹²

^ (Pyr) (NADH) (H⁺)

Die Gleichgewichtskonstante für die verbundenen Reaktionen 1 und 2 ist:

(Andr) (Lact)

K = K.xK- = = 1.07x10 .

' ^ (Test) (Pyr)

Dem Gleichgewicht nach erscheint die Reaktion von der Konzentration von (H⁺) und NAD⁺ oder NADH unbeeinflußt.

Verfahren

Eei einem Musterversuch werden die beiden Enzyme LDH und HSDH 3ml einer den oxydierten Kofaktor und den Na-Pyruvat enthaltenden Pufferlösung zugesetzt. Der wässrigen Lösung wird ein gleich großes Volumen an organischer, den Steroid enthaltender Phase· beigemischt und "die- Reaktion beginnt ' beim/Emulgieren der beiden. Phasen. Die Reaktion .wird .unter. Rührung des Behälters in einer Schwingvorrichtung" bei 90 Schwingungen in der Minute fortgesetzt.

Der Verlauf der einzelnen Reaktionen wurde durch Bestimmung der in der organischen Phase vorkommenden Mengen an umgewandeltem bζv/. nicht umgewandeltem Steroid verfolgt.

Zu bestimmten Zeitpunkten werden die Phasen verrührt, ein genau gemessenes Volumen der organischen Phase wird entnommen sowie Testosteron und Androstendion per TGL durch EIution mit dem Äthylacetat-Benzol- n-Hexan-System (100 : SO % 60) getrennt.

Die Steroide werden vom Träger mit CHGl^ extrahiert (24 h bei Raumtemperatur) und nach Verdunsten des CHGl^ bei 240 nrn in ETOH spektrophotometrisch analysiert.

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Experimenteller Teil

Uinwandlungsversuche sind vorgenommen worden, bei welchen die Konzentrationsverhältnisse nahe der Hemmgrenze des LDH (0.2 molar Pyruvat) lagen.

Der Zweck war, zu erweisen, daß es möglich ist, aus kleinen Volumen und niedrigen Mengen HAD hohe Mengen umgewandelten Disteroids zu gewinnen, eine restlose Umsetzung und daher einen hohen Reinheitsgrad des Produktes zu erzielen.

Nachdem rohes H3DH verwendet-wurde, das die Isomerase A enthält, Bind diese Versuche bei verschiedenen pH-Wer ten vorgenommen worden.

Wässrige Phase

1.5 "ml Pufferphosphat 0.4 mol
15 Na- Pyruvat (1 ml H₂O)
1500 J^KAD (0.5 ml H₂O) 1.5

LDH = 1.6 Einheiten
HSDE =0.16 Einheiten

Organische Phase

3 ml Butylacetat
50 mg Testosteron

pH Umsetzuns;s-# nach ' Sr>uren von' Steroid-

3M-5¹ 22h 45h 72h isomer

vorhanden vorhanden vorhanden nicht vorhanden

.Gs wird angenommen^ daß es sich bei den Spuren des' Steroids das in den TLG and Sf-Platten größer als l\ Androstendicn erscheint, um Δ ^ Androstendion handelt.

Aus den Tabellenangaben geht hervor, daß man nach 72 Stunden Reaktion mit pH zwischen 7·5 und 8.8 die volle Umsetzung erzielt, daß aber das Reaktionsprodukt erst bei pH 3.8

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6.8	14 .	50	84	93
7.3	18	58	90	■95
7-5	•20	62	92	100
8.8	30	70	96	100

chromatographisch rein ist.

Beispiel 4 LIfASE

Veränderliche Mengen Lipase (Koch-Light cat.1503 L) wurden in 5 ml Na-Halat- Puffer 0,1 M, pH 6,5 aufgelöst.

Im ersten Fall wurden 5 ml Enzymlösung mit 2,5 ml Olivenöl geschlagen, in 2,5 ml Dichloroäthan gelöst und eine Stunde lang bei 37 C unter Rührung bebrütet.

Im zweiten Fall wurden 5 ml Enzymlösung mit 2,5 ml Olivenöl geschlagen und eine Stunde lang bei 37°C unter Rührung bebrütet. - ·

Daraufhin wurden 30 ml eines Gemisches gleicher Anteile von Aceton und Äthanol zugesetzt um die Emulsion zu brechen, und die durch Enzymkatalyse frei gewordenen Fettsäuren mit Natron 0,05 M titriert.

Die Versuchsdaten lauten:

Versuch Versuch

mit Lösungsmittel - - ohne Emulsion

ohne Lösungsmittel

Lipase Ai Mol freigewordene Fettsäure in 1h bei 37 C

280 400

• 14,4	o₇
28,8	206
43,2	310
57,6	439
Beispiel	5
ALKOHOL	- DEHTDEOGENASE

Enzymquelle: Hefe (Boehringer 154 18 EAAD)
Reaktion

Butanol + NAD⁺ ——> Butyraldehyd + NADH + H⁺

1. Versuch: mit Butanol ohne Lösungsmittel

Das Reaktionsgemisch besteht aus 10 ml Puffer-Pyrophosphat 0,1 M, pH 9, in denen folgende Stoffe gelöst sind:

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Semi-carbazid ilCl Glycin Glutathion,reduziert NAD

2402A52

12,5 ng 16,7 mg 3 mg 30 mg

Das Gemisch wird mit 5 ml Butanol unter Rühren bei 20
bebrütet.

o.

2. Versuch: Butanol mit Benzol zugesetzt

Das Gemisch des ersten Versuches wird mit einem Gemisch aus 5 ml Butanol und 5 ml Benzol unter Rühren bei 20⁰O
bebrütet.

Versuchsangaben

	- 1. Versuch	Optische Dichte bei
	0,190	340 nm ·
Zeit (Minuten)	3,85	2. Versuch
0	4,95	0,190
■ 5	7,65	3,80
10	9,4	5,30
30	10,3 · '	9,60
60	11,4	12,6
145		15,0
180	• 12,2 ■■■;'·"·	16,3
.300 ■■· ■ · ·■ ··- .	17,5· .;
1320· · ' '.	·.."- 20,4 . . -

Bei Anwesenheit des Butanols allein wurde eine Entaktivierung des Enzyms festgestellt,.die die Tatsache erklärt, daß die Reaktion beim ersten Versuch nach fünf Stunden nur mäßig vor sich geht. ' "

Bei den Arbeitsbedingungen des zweiten Versuches wurde durch gaschromatographische Analyse festgestellt, daß die Konzentration des n-Butanols in der wässrigen Phase - wegen des weniger günstigen Verteilungskoeffizienten - um 3$, also bedeutend niedriger war als beim Versuch ohne .aromatisches Lösungsmittel.

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Claims

2402A52 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Durchführung von Enzymreaktionen, bei welchen das oubotrat in der das Enzym enthaltenden Flüssigkeit schlecht löslich ist, dadurch gekennzeichnet , daß die Reaktion in Anwesenheit eines wasserunnrischbaren, mit dem Substrat jedoch mischbaren organischen Lösungsmittel erfolgt.

2. Verfahren zur Durchführung von Enzymreaktionen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Lösungsmittel aus der Reihe der Ester von Carbonsäuren mit 2 bis Λ0 Kohlenstoffatomen, der Alkyläther, der Alkohole mit 4- bis S.0 Kohlenstoffatomen, der. aliphatischen, aromatischen und zykloaliphatischen Kohlenwasserstoffe sowie der Halogenide gewählt wurde.

3- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch ge-,_: kennzeichnet, daß das Substrat dem organischen Lösungsmittel als Lösung zugesetzt wird.

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