DE2402452A1 - Enzymreaktionsverfahren durch zweiphasige wasser-/organische systeme - Google Patents
Enzymreaktionsverfahren durch zweiphasige wasser-/organische systemeInfo
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Description
Case 2(oLtlS'
Firma SNAM PROGETTI S.ρ.Α., Mailand und
Firma I.S.F. Societä per Azioni, Trezzano sul Naviglio
Italien. ■ . o . '"
Enzymreaktionsverfahren durch zweiphasige Wasser-/organische
Systeme.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Enzymreaktionsverfahren durch zweiphasige Wasser-Zorganische Systeme.
Bekanntlich finden Enzymreaktionen im Wasser statt, da letzteres
das bestmögliche Lösungsmittel für Enzyme ist und deren AufbaubestSndigkeit sicherstellt, von der die katalytische
Wirksamkeit abhängt.
Das setzt bei all denjenigen Reaktionen gewisse Grenzen
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fest, bei denen Ausgangsstoffe.(Substrate des Enzymkatalysators)
verwendet v;erden müssen, die wasserunlöslich sind und daher den Einsatz organischer Lösungsmittel benötigen.
Bekanntlich üben letztere in den meisten Fällen eine die Enzyme denaturierende Wirkung aus, zunal wenn sie· wasservermischbar
sind.
Andererseits taugen wasserunmischbare Lösungsmittel als Enzymlösungsmittel
fast nie, sodaß Enzymreaktionen in homogener organischer Phase meist undurchführbar sind.
Das bringt eine wesentliche Einschränkung des Zustandekommens von Znzynumwandlungen aller schlecht wasserlöslicher
Substrat mit sich, wovon einige (Steroide, Terpene,Lipidderivate,
Lxophxlerzeugnisse mit pharmakologischer Wirkung u.a.m.) gebrauchsmäßig und wirtschaftlich von'großem Interesse
sind. Man könnte daher an die Möglichkeit denken, eine bessere Di'spersion der Substrate durch Emulgieren' derselben
in der wässrigen Phase des Enzyms zu erzielen; diesem Verfahren sind jedoch engere Grenzen gesetzt, sei es weil viele
dert gangbarsten Dispergiermittel eine Desäktivierung des
Enzyms verursachen, sei es auch weil diese Technik bei Substraten mit höherem Schmelzpunkt als die Raumtemperatur
nicht anwendbar .ist.. ' . .
V/ir .haben nun festgestellt, daß·.es. möglich ist, Enzymumwandlungen
wasserunlöslicher Substrate bei guter Ausbeute vorzunehmen, ' indem solche zweiphasige Wasser - orga'-nische
Systeme eingesetzt werden, deren organisches(wasserunmischbare)
Lösungsmittel als gutes Lösungsmittel für das Substrat wirkt, so daß das Enzym in seinem natürlichen V/asserelement
arbeitet und eine direkte denaturierende Wirkung des Lösungsmittels vermieden wird.
Die Aufgabe des organischen Lösungsmittels besteht nicht allein in der Lösbarmachung des Substrates, sondern auch in
der Sicherstellunir einer gleichbleibenden Konzentration (die
bei schlecht wasserlöslichen Stoffen praktisch der Sätti-rimc:
gleicht) in der wässrigen i-'hase, in welcher sieb die Enzvr,-umwandlung
vollzieht.
Zu dieser Aufgabe als "Speicher" kcmnt noch nine v/eitere.
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hinsichtlich der Reaktionsgeschwindigkeit äußerst wichtige
Aufgabe hinzu, die in der fortgesetzten Extraktion der Reaktionsprodukte
aus der wässrigen I:hase seitens des v/asserunmischbaren
Lösungsmittels besteht. Das gilt in den Fällen (die bei weitem überwiegen), wo die Enzymumwandlungserzeugnisse
unlöslicher Substrate einen gegenüber der organischen Phase noch günstigen Verteilungskoeffizienten besitzen»
Diese Extraktionswirkung der Reaktionsprodukte läßt sich z-Bo durch Emulgieren der Substrate nicht erzielen, und sie
stellt ein vorteilhaftes Merkmal der hier beschriebenen Technik dar.
Die Bedeutung dieser Entziehung der Produkte ist in bestimmten Fällen besonders bemerkenswert und sie beschränkt sich
nicht auf eine Verlagerung des Reaktionsgleichgewichtes durch Massewirkung, sondern sie ist besonders in den zahlreichen
Fällen*wertvoll, wo eine Zunahme des Konzentrationsgrades der Reaktionsprodukte im wässrigen Element eine die
katalytische Wirkung des Enzyms hemmende Aktion ausübt.
Ohne daß dadurch eine Einschränkung des Schutzbereiches entsteht, kann die Erfindung bei ilnzyiareaktionen angewandt werden,
bei welchen das Enzymsubstrat im V/asser unlöslich bzw. schwer löslich ist. Ein besonderes Anwendungsgebiet der Erfindung
bilden Encyrnumwandlungen der--Steroide,, wie z.B. Oxydationen,'
Hydroxyl!erungen, Dehydrierungen. Weitere Enzymreaktionen
wie z.B. Umwandlung des Saiicylats in Pyrocatechin,
Oxydation der Dihydroxyphenole, Oxydation aromatischer Kohlenwasserstoffe,
lassen sich durch Anwendung des erfindungs.-gemäßen
Verfahrens vorteilhaft durchführen. . '
Als brauchbare organische Lösungsmittel können folgende angeführt werden:Ester von Carbonsäuren mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen,
Alkylather von Alkoholen mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen,
aliphatisch^, aromatische" oder cycloaliphatische Kohlenwasserstoffe, Halogenide.
Beispiel 1
LAKKASE
LAKKASE
gereinigtes Enzym aus Kulturflüssigkeit des Pilzes Poliporos
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versicolor.
.Reaktion
Substrat -i- O2 Oxydationsprodukte des Substrates
Bei einem typischen Verfahren werden 5 ml Äthylacetat, die
10 mg/ml östradiol (3,6x10 M) enthalten, mit gleichem Volumen Pufferacetat 0,1M, pH 5-4- emulgiert, welche Lakkase
0.060 mg/ml (10"6M) enthalten. Das Geraisch wird bei 25°C unter
Rührung mit reinem Sauaerstof oder mi-fc in der gasförmigen
Phase vorhandener Luft bebrütet. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden je 5 ml der organischen Phase entnommen und für
die Analyse des Estradiol und etwaiger Produkte benutzt.
Nach vierstündigem Verbleiben unter den beschriebenen Versuchsbedinjungen
ist die Hälfte des Estradiols in (zumindest 5) chrornatographisch erkennbare Produkte umgewandelt. Bei
ähnlichen Versuchen, die in Abwesenheit des organischen Lösungsmittels durch Sättigung des die Lakkase enthaltenden ■
Pufferacetates mit Estradiol ausgeführt wurden, war es anhand
der üblichen Arialysenverfahren nicht möglich die Reaktion
nachzuweisen. Das -ist wahrscheinlich auf ...die', in der wässrigen
'Phase erzielbare, unausreichende Konzentration des Steroids zurückzuführen.
Unter den erwähnten Versuchsbedingungen erfolgt die Umwandlung nachstehend aufgeführter Substrate mit annähernd gleicher
Geschwindigkeit (^/p= ^ Stunden) wie beim Estradiol:
Estradiol, Estron, Estriol, Äquilin, Äquilenin, Diäthylstilbestrol.
Diich viele v/eitere, organische Lösungsmittel wurde das
iithylacetat bei gleichen Ergebnissen ersetzt, z.B.: Trichloräthylen, Diäthyläther, Athylendichlorid.
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aus Zellen des Pseudomonas Testosteron (Sigma H 9004).
Reaktion
■Testosteron + NAD £ HASIIg 4-androsteron, 3,17-dion + KADH +
HSDH = Hydroxysteroid - Dehydrogenase NAD = Nicotinamid - Adenin - Dinukleotid
3,1 ml Pufferphosphat, μ 0.2 pH 7-6, die 2.5 mg NAD+ und
0.05 Einheiten HoDH enthalten, wurden mit 3.2 ml eines 13 m
—?
Testosteron (1.4- χ 10 M) enthaltenden organischen Lösungsmittels
bei 220C emulgiert. Das Gemisch wird unter ständi-'
ger Rührung gehalten (100 Stöße je Hinute) und die optische Dichte 'der wässrigen Phase bei 34-0 nm wird zu verschiedenen
Zeitpunkten gemessen.
Versuchsdaten . .
Organisches Lösungsmittel
Athylacetat
Butylace.tat -
Äthyläther· ··. .'-..- ' .·■
Butanol
O.D. = optische Dichte " - .
In- Abwesenheit des organischen Lösungsmittels ist die Gesamtzunahme
der optischen Dichte bei 34-0 nm durch die Wasserlöslichkeit
des Testosterone eingeschränkt (die gesättigte Lösung enthält 25 - 30/ig Testosteron / ml). Ohne organ!-■
sches Lösungsmittel übersteigt sie daher nie einen V/ert von etwa 0.3· · .
Beispiel 3 . . -■
Enzymquellen ■ '
HYDROXIBTEROID - DEHYDROGENASE (HSDH) aus Zellen von Pseudonomas
Testosteron; Lacti - Dehydrogenase (LDH) (Boehringer)o
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0. | D. 340 nm | 0. | D. 340 nm |
. .nach | 2 Stunden | nach. | 22 Stunden |
Λ Λ | 3.4 | ||
- | ,1.3 . | ·■- | 3,2.· |
1.2·, - | 2.5' · ■ ··'■ | ||
0.55 | i.9' ' |
1. Testosteron + NAD An£rOsteron $.17 - dion +
NADH + H+
2. Pyruvat + NADH + H Lactat + NAD+
K = (Andr) (KADH) (H+) = 26χ10 -9
1
1 (Test) (NAD)
= = 0.4x1012
^ (Pyr) (NADH) (H+)
Die Gleichgewichtskonstante für die verbundenen Reaktionen 1 und 2 ist:
(Andr) (Lact)
K = K.xK- = = 1.07x10 .
' ^ (Test) (Pyr)
Dem Gleichgewicht nach erscheint die Reaktion von der
Konzentration von (H+) und NAD+ oder NADH unbeeinflußt.
Verfahren
Eei einem Musterversuch werden die beiden Enzyme LDH und
HSDH 3ml einer den oxydierten Kofaktor und den Na-Pyruvat
enthaltenden Pufferlösung zugesetzt. Der wässrigen Lösung wird ein gleich großes Volumen an organischer, den Steroid
enthaltender Phase· beigemischt und "die- Reaktion beginnt '
beim/Emulgieren der beiden. Phasen. Die Reaktion .wird .unter.
Rührung des Behälters in einer Schwingvorrichtung" bei 90
Schwingungen in der Minute fortgesetzt.
Der Verlauf der einzelnen Reaktionen wurde durch Bestimmung
der in der organischen Phase vorkommenden Mengen an umgewandeltem
bζv/. nicht umgewandeltem Steroid verfolgt.
Zu bestimmten Zeitpunkten werden die Phasen verrührt, ein genau gemessenes Volumen der organischen Phase wird entnommen
sowie Testosteron und Androstendion per TGL durch EIution
mit dem Äthylacetat-Benzol- n-Hexan-System (100 : SO % 60) getrennt.
Die Steroide werden vom Träger mit CHGl^ extrahiert (24 h
bei Raumtemperatur) und nach Verdunsten des CHGl^ bei 240 nrn
in ETOH spektrophotometrisch analysiert.
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Uinwandlungsversuche sind vorgenommen worden, bei welchen
die Konzentrationsverhältnisse nahe der Hemmgrenze des LDH (0.2 molar Pyruvat) lagen.
Der Zweck war, zu erweisen, daß es möglich ist, aus kleinen Volumen und niedrigen Mengen HAD hohe Mengen umgewandelten
Disteroids zu gewinnen, eine restlose Umsetzung und daher einen hohen Reinheitsgrad des Produktes zu erzielen.
Nachdem rohes H3DH verwendet-wurde, das die Isomerase
A enthält, Bind diese Versuche bei verschiedenen pH-Wer ten vorgenommen worden.
1.5 "ml Pufferphosphat 0.4 mol
15 Na- Pyruvat (1 ml H2O)
1500 J^KAD (0.5 ml H2O) 1.5
15 Na- Pyruvat (1 ml H2O)
1500 J^KAD (0.5 ml H2O) 1.5
LDH = 1.6 Einheiten
HSDE =0.16 Einheiten
HSDE =0.16 Einheiten
Organische Phase
3 ml Butylacetat
50 mg Testosteron
50 mg Testosteron
pH Umsetzuns;s-# nach ' Sr>uren von' Steroid-
3M-51 22h 45h 72h isomer
vorhanden vorhanden vorhanden nicht vorhanden
.Gs wird angenommen^ daß es sich bei den Spuren des' Steroids
das in den TLG and Sf-Platten größer als l\ Androstendicn
erscheint, um Δ ^ Androstendion handelt.
Aus den Tabellenangaben geht hervor, daß man nach 72 Stunden Reaktion mit pH zwischen 7·5 und 8.8 die volle Umsetzung
erzielt, daß aber das Reaktionsprodukt erst bei pH 3.8
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6.8 | 14 . | 50 | 84 | 93 |
7.3 | 18 | 58 | 90 | ■95 |
7-5 | •20 | 62 | 92 | 100 |
8.8 | 30 | 70 | 96 | 100 |
chromatographisch rein ist.
Beispiel 4 LIfASE
Veränderliche Mengen Lipase (Koch-Light cat.1503 L) wurden
in 5 ml Na-Halat- Puffer 0,1 M, pH 6,5 aufgelöst.
Im ersten Fall wurden 5 ml Enzymlösung mit 2,5 ml Olivenöl geschlagen, in 2,5 ml Dichloroäthan gelöst und eine Stunde
lang bei 37 C unter Rührung bebrütet.
Im zweiten Fall wurden 5 ml Enzymlösung mit 2,5 ml Olivenöl
geschlagen und eine Stunde lang bei 37°C unter Rührung bebrütet.
- ·
Daraufhin wurden 30 ml eines Gemisches gleicher Anteile von
Aceton und Äthanol zugesetzt um die Emulsion zu brechen, und die durch Enzymkatalyse frei gewordenen Fettsäuren mit Natron
0,05 M titriert.
Die Versuchsdaten lauten:
Versuch Versuch
mit Lösungsmittel - - ohne Emulsion
ohne Lösungsmittel
Lipase Ai Mol freigewordene Fettsäure in 1h bei 37 C
280 400
• 14,4 | o7 |
28,8 | 206 |
43,2 | 310 |
57,6 | 439 |
Beispiel | 5 |
ALKOHOL | - DEHTDEOGENASE |
Enzymquelle: Hefe (Boehringer 154 18 EAAD)
Reaktion
Reaktion
Butanol + NAD+ ——>
Butyraldehyd + NADH + H+
1. Versuch: mit Butanol ohne Lösungsmittel
Das Reaktionsgemisch besteht aus 10 ml Puffer-Pyrophosphat
0,1 M, pH 9, in denen folgende Stoffe gelöst sind:
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Semi-carbazid ilCl
Glycin Glutathion,reduziert NAD
2402A52
12,5 ng 16,7 mg 3 mg 30 mg
Das Gemisch wird mit 5 ml Butanol unter Rühren bei 20
bebrütet.
bebrütet.
o.
2. Versuch: Butanol mit Benzol zugesetzt
Das Gemisch des ersten Versuches wird mit einem Gemisch aus 5 ml Butanol und 5 ml Benzol unter Rühren bei 200O
bebrütet.
bebrütet.
Versuchsangaben
- 1. Versuch | Optische Dichte bei | |
0,190 | 340 nm · | |
Zeit (Minuten) | 3,85 | 2. Versuch |
0 | 4,95 | 0,190 |
■ 5 | 7,65 | 3,80 |
10 | 9,4 | 5,30 |
30 | 10,3 · ' | 9,60 |
60 | 11,4 | 12,6 |
145 | 15,0 | |
180 | • 12,2 ■■■;'·"· | 16,3 |
.300 ■■· ■ · ·■ ··- . | 17,5· .; | |
1320· · ' '. | ·.."- 20,4 . . - | |
Bei Anwesenheit des Butanols allein wurde eine Entaktivierung des Enzyms festgestellt,.die die Tatsache erklärt, daß die
Reaktion beim ersten Versuch nach fünf Stunden nur mäßig vor sich geht. ' "
Bei den Arbeitsbedingungen des zweiten Versuches wurde durch gaschromatographische Analyse festgestellt, daß die Konzentration
des n-Butanols in der wässrigen Phase - wegen des weniger günstigen Verteilungskoeffizienten - um 3$, also
bedeutend niedriger war als beim Versuch ohne .aromatisches
Lösungsmittel.
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Claims (2)
1. Verfahren zur Durchführung von Enzymreaktionen, bei welchen
das oubotrat in der das Enzym enthaltenden Flüssigkeit
schlecht löslich ist, dadurch gekennzeichnet , daß die Reaktion in Anwesenheit eines
wasserunnrischbaren, mit dem Substrat jedoch mischbaren organischen
Lösungsmittel erfolgt.
2. Verfahren zur Durchführung von Enzymreaktionen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet ,
daß das Lösungsmittel aus der Reihe der Ester von Carbonsäuren mit 2 bis Λ0 Kohlenstoffatomen, der Alkyläther,
der Alkohole mit 4- bis S.0 Kohlenstoffatomen, der. aliphatischen,
aromatischen und zykloaliphatischen Kohlenwasserstoffe sowie der Halogenide gewählt wurde.
3- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch ge-,:
kennzeichnet, daß das Substrat dem organischen
Lösungsmittel als Lösung zugesetzt wird.
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