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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur enzymatischen Herstellung von Acyl-Derivaten bioaktiver Stoffe.
Das Verfahren ist in der biotechnologischen Industrie anwendbar.
Die mit dem Verfahren hergestellten Acyl-Derivate sind in der Pharmazie,
in der Kosmetik, in der Feinchemie, in der Lebensmittelindustrie
und in der Futtermittelindustrie anwendbar.
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Lipasen sind in der Lage, Acyltransferreaktionen
zu katalysieren. Diese Art von Reaktion läuft nach folgendem allgemeinen
Schema ab:
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Je nach gewährtem Donator und Akzeptor
entspricht dieses Schema verschiedenen Reaktionen:
- – Mit
Wasser als Akzeptor-OH und einem Triglycerid als Acylgruppen-Donator
entspricht diese Reaktion der Hydrolyse von Triglyceriden.
- – Mit
einem Alkohol (z.B. Ethanol) als Akzeptor-OH und einer Fettsäure (z.B.
Palmitinsäure)
als Acylgruppen-Donator entspricht diese Reaktion der enzymatischen
Kondensierung zur Synthese von Estern.
- – Mit
einem Alkohol (z.B. Butanol) als Akzeptor-OH und einem Ester (z.B.
Palmitinsäureethylester)
als Acylgruppen-Donator entspricht diese Reaktion einer
enzymatischen
Transesterifikation.
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Wie man aus diesen Beispielen sieht,
läßt sich
die Basisreaktion für
einen breiten Anwendungsbereich realisieren.
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Als Acylgruppen-Donator können Fettsäuren und
Fettsäureester
eingesetzt werden. Die transferierte Acylgruppe ist in der Regel
eine gesättigte
oder ungesättigte
aliphatische Kette, deren Länge
von kurz (z.B. Acetyl) bis lang (z.B. Stearyl) variieren kann.
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Als Akzeptor-OH kann eine breite
Auswahl von Stoffen dienen, wie z.B. Wasser in der Hydrolysereaktion
oder aliphatische Alkohole in Transesterifikationen. Auch zahlreiche
andere Stoffe, die eine OH-Gruppe tragen, können als Akzeptor-OH in der
Reaktion dienen.
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Der Akzeptor von Acylgruppen kann
eine wasserlösliche
bioaktive Verbindung sein, die eine oder mehrere OH-Gruppen trägt. Wasserlösliche Vitamine
wie Ascorbinsäure
(Vitamin C) oder Pyridoxin können
in der Acylierungsreaktion eingesetzt werden, ebenso sekundäre Metaboliten
aus Pflanzen oder Mikroorganismen wie Kojinsäure. Die Acylierung solcher
Verbindungen mit einer mittellangen (z.B. Lauryl-) bis langen (z.B. Stearyl-)
aliphatischen Kette dieser Klasse von Stoffen stellt die Zielreaktion
der Erfindung dar.
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Die enzymatische Reaktion von bioaktiven
Stoffen als Akzeptor von Acylgruppen ist bekannt. Baldessari et
al (Baldessari A, Mangone CP, Gros EG (1998). Lipasecatalyzed acylation
and deacylation reactions of pyridoxin, a member of vitamin-B6 group.
Helvetica chimica acta 81 2407-2413) haben eine Reihe von Acyl-Derivaten
von Pyridoxin durch Transesterifikation von Pyridoxin mit Ethylestern
synthetisiert. Insbesondere wurde ein Myristylester von Pyridoxin
mit der Lipase von Candida antarctica im Aceton synthetisiert. Das erhaltene
Produkt wurde durch eine chromatographische Methode mit Kieselgel
als Feststoffphase gereinigt.
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Humeau et al (Humeau C, Girardin
M, Rovel B, Miclo A (1998). Effect of the thermodynamic water activity
and the reaction medium hydrophobicity on the enzymatic synthesis
of ascorbyl palmitate. Journal of Biotechnology 63 1-8) haben die
enzymatische Synthese von Ascorbylpalmitat im t-Butanol aus Palmitinsäuremethylester
und Ascorbinsäure
durchgeführt.
Die Autoren untersuchten den Einfluss der thermodynamischen Aktivität des Wassers
auf die Reaktion.
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In der ersten dieser Arbeiten wurde
das Produkt der Reaktion (Pyridoxinester) durch eine aufwändige Prozedur,
chromatographische Schritte beinhaltend, gewonnen. Zur Extraktion
und Reinigung des Produkts wurde in der zweiten Arbeit keine Information
gegeben. Ganz allgemein läßt sich
feststellen, dass das Problem der Extraktion und der Reinigung des
Esterprodukts die bisherigen Verfahren für eine technologische Anwendung
ungeeignet macht.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde,
die enzymatische Synthese von Acylderivaten soweit zu verbessern,
dass eine technische Anwendung möglich
ist. Insbesondere sollen die Reinigungs- und Isolierungsschritte
so gestaltet werden, dass Ausgangs- und Nebenprodukte weitgehend
abgetrennt und das Endprodukt in hoher Reinheit erhalten wird.
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Das Verfahren nutzt die Erkenntnis,
dass das erhaltene Endprodukt (Esterprodukt der Lipase-katalysierten
Reaktion) weder im Wasser noch in apolaren Lösungsmitteln löslich ist.
Die Aufarbeitung der Reaktionsprodukte erfolgt erfindungsgemäß durch
einen Schritt zur Fest-Flüssig-Extraktion
des nicht umgesetzten Acylgruppen-Donators und einen Schritt zur
Flüssig-Flüssig-Extraktion
des nicht umgesetzten Akzeptors von Acylgruppen. Das Reaktionsmedium
enthält
nach der Kondensierungsreaktion Esterprodukt, nicht-umgesetzten
Donator (Fettsäure),
nicht-umgesetzten Akzeptor (bioaktiven wasserlöslichen Stoff) und das Enzym.
Die Lipase ist im Lösungsmittel
unlöslich
und kann einfach abfrltriert oder abzentrifugiert werden. Der nicht
umgesetzte Akzeptor ist wasserlöslich
im Gegenteil zum Esterprodukt. Er kann durch Flüssig-Flüssig Extraktion (z.B. mit dem
System Ethylacetat-Wasser) aus dem Reaktionsprodukt entfernt werden.
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Es wurde nun überraschenderweise gefunden,
dass beim Einsatz von Laurinsäure
als Acyl-Donator der gebildete Laurinsäureester nicht nur in Wasser,
sondern auch in Hexan unlöslich
ist, die Laurinsäure
selbst dagegen ist in Hexan löslich.
Das ist ein unerwarteter Unterschied zum analogen Einsatz von Palmitin-
und Stearinsäure.
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Die restliche Laurinsäure kann
dadurch aus dem rohen Reaktionsprodukt durch Feststoff-Flüssig Extraktion
entfernt werden. Auf diese Weise kann das Produkt der Acylierung
auf einfache Weise in zwei Extraktionsschritten mit hoher Reinheit
gewonnen werden.
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Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung
wird ein Medium aus wasserlöslichem
Akzeptor (bioaktive Verbindung) und Laurinsäure hergestellt. Diese Ausgangsstoffe
werden in einem polaren Lösungsmittel gelöst bzw.
suspendiert, dazu eignet sich z.B. Aceton. Die Laurinsäure ist
in Aceton löslich,
der wasserlösliche Akzeptor
(bioaktive Verbindung) ist in Aceton nur partiell löslich. Die
Lipase wird dem Medium zugegeben. Als Lipase eignet sich das Präparat Novozym
435, eine immobilisierte Lipase aus Candida antarctica. Zum Medium
wird ein Molekularsieb 3 Angström
gegeben. Das Molekularsieb dient zur Trocknung des Reaktionsmediums,
es dient dazu, das bei der Reaktion entstehende Wasser aus dem Reaktionsgemisch
zu entfernen. Dadurch werden die Reaktionsausbeuten erhöht. Das
Medium wird unter Rührung
inkubiert, die Inkubationstemperaturen betragen 20 – 50°C, die erforderlichen
Inkubationszeiten betragen 6 – 96
h.
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Nach der Inkubation wird das Gemisch
aufgearbeitet. Das unlösliche
Enzym und das unlösliche
Molekularsieb werden abzentrifugiert bzw. abfiltriert. Aus dem Überstand
bzw. Filtrat wird das Aceton durch Verdampfung entfernt. Es wird
ein sirupartiger Rohextrakt der Reaktion erhalten. Dieser Extrakt
wird mit Hexan in Kontakt gebracht, dadurch wird die restliche Laurinsäure in die
Hexanphase extrahiert. Die Hexanphase wird durch Zentrifugation
abgetrennt und für
die Wiederverwendung der Laurinsäure
zur Verfügung
gestellt. Der Feststoff wird in Ethylacetat gelöst und Wasser zugegeben. Der
nicht umgesetzte Akzeptor wird dadurch in die wässrige Phase extrahiert. Die
wässrige
Phase steht für
die Wiederverwendung des Pyridoxins zur Verfügung. Die organische Phase
wird durch Verdampfung des Ethylacetats konzentriert und aus dem
Ethylacetat wird das Produkt der Reaktion kristallisiert. Durch
diese Methode wird ein pulvriges Produkt mit 90 % Reinheit oder höher gewonnen.
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Beim Einsatz von langkettigen Fettsäuren wie
Palmitinsäure
oder Stearinsäure
wird das erfindungsgemäße Verfahren
etwas modifiziert. Die Esterprodukte dieser Säuren sind zum Unterschied von
den Esterprodukten der Laurinsäure
in Hexan löslich,
dagegen unlöslich
in Wasser. Deshalb wird die erfindungsgemäße Fest-Flüssig-Extraktion mit Octan,
Isooctan, Decan oder Dodecan durchgeführt, die Flüssig-Flüssig-Extraktion dagegen ebenfalls
mit dem System Wasser-Ethylacetat.
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Mit der vorliegenden Erfindung wird
ein technisch anwendbares Verfahren für die Extraktion und Reinigung
des Esterproduktes aus dem Reaktionsmedium vorgestellt. Unter bestimmten
Reaktionsbedingungen kann das Reaktionsprodukt erfindungsgemäß sehr einfach
aus dem Reaktionsmedium mit hoher Reinheit extrahiert werden.
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Die erfindungsgemäß hergestellten Acyl-Verbindungen
besitzen die Funktionalität
(z.B. als Vitamin) der entsprechenden nicht-acylierten Verbindung
und weisen durch die Anlagerung des Fettsäurerestes modifizierte, vorteilhafte
Eigenschaften bezüglich
der Molekulargröße, Löslichkeit,
Diffusionsfähigkeit,
Stabilität
und Metabolisierungsgeschwindigkeit auf.
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Diese gewonnenen Acylderivate werden
als solche oder in verschiedenen Präparaten eingesetzt. Abhängig von
den Eigenschaften der als Akzeptor von Acylgruppen eingesetzten
Rohstoffen können
durch dieses Verfahren Acylderivate hergestellt werden, die wie
Antibiotika, Vitamine, Hormone, Aminosäuren, Peptide, Antioxidationsmittel,
sekundäre
Metaboliten aus Pflanzen oder Mikroorganismen, Hydroxysäure und
alpha-Hydroxysäure, Poly-,
Oligo- und Mononucleotide, Nucleoside, Antioxidationsmittel, Radikalfänger, Arzneistoffe,
Aroma- und Geschmacksstoffe, Duftstoffe und Farbstoffe wirken.
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Diese neuen Eigenschaften machen
die Produkte der Erfindung in der Pharmazie, in der Kosmetik, in der
Feinchemie, in der Lebensmittelindustrie und in der Futtermittelindustrie
besonders wertvoll.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich
insbesondere als Wirkstoffe zur topischen Anwendung, z.B. in kosmetischen
Mitteln.
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So kann durch die Verwendung einer
geeigneten Acyl-Akzeptor Verbindung eine verbesserte Verfügbarkeit
des Wirkstoffes erreicht werden, was auf die verbesserte Löslichkeit
der Verbindung in Fettphase und somit der Bioverfügbarkeit
des Wirkstoffs zurückzuführen ist,
bzw. auf den langsameren Abbau der Verbindung auf der Haut, wodurch
eine langhaltende Pflege ermöglicht
wird.
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Darüber hinaus können durch
die Verwendung einer geeigneten Acyl-Verbindung die üblichen
Nebenwirkungen eines Wirkstoffes erheblich vermindert werden.
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Die Erfindung wird durch folgendes
Ausführungsbeispiel
erläutert:
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1. Laurinsäurederivat
aus Pyridoxin
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Zur Synthese von Laurinsäurederivat
aus Pyridoxin wurde ein Medium mit 2 g (11,8 mmol) Pyridoxin, 2,36
g (11,8 mmol) Laurinsäure
und 50 ml Aceton hergestellt. Pyridoxin war im Medium partiell gelöst, Laurinsäure war
vollständig
löslich.
Es wurden 2,2 g Lipase (Novozym 435) und 2,2 g Molekularsieb 3 Angström zum Medium
zugegeben. Das Medium wurde unter Rührung 24 h inkubiert.
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Nach der Inkubation wurde das Medium
aufgearbeitet. Zunächst
wurde 10 min bei 30°C
und 5.000 min–1 zentrifugiert.
Das Sediment wurde mit 50 ml Aceton gewaschen und wieder zentrifugiert.
Die Acetonphasen wurden vereinigt, das Aceton wurde im Rotationsverdampfer
unter reduziertem Druck bei 50°C
Badtemperatur verdampft, wonach man einen weißen Sirup erhielt.
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Dieser Rückstand wurde in 25 ml Hexan
suspendiert und 5 min kräftig
geschüttelt.
Die Suspension wurde anschließend
zentrifugiert. Es wurde ein klarer, leicht gelb gefärbter Überstand
und ein weißes
Sediment erhalten. Der Überstand
wurde abgegossen.
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Das Sediment wurde in 30 ml Ethylacetat
suspendiert und 10 ml Wasser zugegeben. Das Medium wurde klar. Es
enthielt eine organische obere Phase und eine wässrige untere Phase. Das Medium
wurde 5 min langsam geschüttelt
und anschließend
zentrifugiert, die wässrige
Phase wurde abpipettiert.
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Die organische Phase wurde im Rotationsverdampfer
konzentriert. An die Oberfläche
der Verdampferflasche lagerte sich ein weißer Feststoff an. 1,5 g dieses
Produktes wurden der Verdampferflasche entnommen.
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Das Produkt wurde durch HPLC in direkter
Phase zur Analyse von Ester und Pyridoxin und in der Umkehrphase
zur Analyse von Fettsäure
analysiert.
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1 zeigt
die Chromatogramme einer 10 g/l Lösung von Esterprodukt. Es wurden
0,2 g/l Pyridoxin und 0,7 g/l Laurinsäure detektiert. Die Fläche des
Peaks des Esterprodukts bei 284 nm entsprach der Fläche von
5,6 g/l Pyridoxin.
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2 stellt
das UV-Spektrum des Esterproduktes und das der Pyridoxin dar. Beide
sind durch ein Maximum bei 284 nm charakterisiert. Pyridoxin und
das Esterpro dukt besitzen einen ähnlichen
UV-aktiven Strukturteil. Es wird davon ausgegangen, dass die molaren
Extinktionskoeffizienten für
Pyridoxin und Pyridoxinester ähnlich
groß sind.
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Die Molgewichte betragen 169 für Pyridoxin,
200 für
Laurinsäure,
351 für
den Monoester und 533 für den
Diester. Unter der Annahme, dass das Esterprodukt ein Monoester
bzw. ein Diester ist, ergibt sich aus 9,1 g/l Pyridoxinester 4,4
g/l bzw. 2,9 g/l im Ester kovalent gebundenes Pyridoxin. Die durch
UV-Detektor gemessene Menge an im Ester kovalent gebundenem Pyridoxin
beträgt
5,6 g/l. Dieses experimentelle Ergebnis entspricht der Annahme,
dass das Produkt ein Monoester ist.
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Das durch das Verfahren der Erfindung
synthetisierte und gereinigte Produkt war ein Monoester von Laurinsäure und
Pyridoxin. Es enthielt 2% restliches Pyridoxin und 7% restliche
Laurinsäure.
