DE3841914C1

DE3841914C1 -

Info

Publication number: DE3841914C1
Application number: DE3841914A
Authority: DE
Inventors: Nagaraj Narayan Dr. Bangalore In Rao; Christian Prof. Dipl.-Chem. Dr. 5170 Juelich De Wandrey; Maike Dr. 4040 Neuss De Petersen; August Wilhelm Prof. Dr. 4006 Erkrath De Alfermann
Original assignee: Kernforschungsanlage Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1988-12-13
Filing date: 1988-12-13
Publication date: 1990-06-07
Anticipated expiration: 2008-12-14
Also published as: JPH02215390A; US5011775A; IN170179B

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von Rosmarinsäure der Formel

durch enzymatische Umsetzung von 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-milchsäure mit Caffeoyl-Coenzym A in Gegenwart von Rosmarinsäure-Synthase.

Die Ester aus kernsubstituierten Zimtsäuren und kernsubstituierten Phenylmilchsäuren weisen entzündungshemmende Eigenschaften auf. Rosmarinsäure (RS), der Ester aus Kaffeesäure und den R(+)-Form der 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-milchsäure, wurde erstmals aus der Heilpflanze Rosmarinus officinalis als Naturstoff gewonnen. Sie wird seit einigen Jahren als potentieller Entzündungshemmer intensiv erforscht. Bisher wurde die RS entweder aus Pflanzen oder aus Pflanzenzellkulturen erhalten.

In jüngerer Zeit wurde festgestellt, daß Zellkulturen von Coleus blumei in erheblichem Maße Rosmarinsäure produzieren. Bei der Extraktion der Zellmasse wurde von M. Petersen und A. W. Alfermann (Z. Naturforsch. 43c (1988) 501-504) zwei Enzyme isoliert und hinsichtlich ihrer Wirksamkeit identifiziert: als maßgebliches Enzym für die Rosmarinsäure-Synthese aus Caffeoyl-CoA und 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-milchsäure wurde eine Rosmarinsäure-Synthase gefunden und als weiteres Enzym Dihydroxyphenylpyruvat-Reduktase mit der die Reduktion der Ketosäure zur Hydroxysäure in Gegenwart von NADH erreicht wird.

Ziel der Erfindung ist nun ein praktisch brauchbarer Weg zur Rosmarinsäure-Synthese, bei dem das aus Dopa gut zugängliche Ketodopa als Ausgangsmaterial verwendet wird und vorzugsweise Caffeoyl-CoA unter Zugabe von Kaffeesäure regeneriert wird.

Das zu diesem Zweck entwickelte Verfahren der eingangs genannten Art ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß die 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-milchsäure vorangehend oder gleichzeitig durch enzymatische Umsetzung von Ketodopa in Gegenwart von Dehydrogenase und NADH₂ gebildet wird.

Als Dehydrogenase dient dabei z. B. D-Lactat-Dehydrogenase insbesondere aber D-Hydroxyisocaproat-Dehydrogenase.

Die Regenerierung von Carreoyl-CoA durch Zugabe von Kaffeesäure ATP und CoA-Ligase erfolgt insbesondere in situ simultan zur Rosmarinsäure-Synthese.

Weitere Besonderheiten gehen aus der nachfolgenden Beschreibung anhand des beigefügten Schemas sowie der Ausführungsbeispiele hervor.

In dem Schema erkennt man, daß die Umsetzung von Hydroxydopa und Caffeoyl-CoA mit Rosmarinsäure-Synthase unter Bildung von Produktlösung erfolgt, von der nicht umgesetztes Hydroxydopa einerseits und Coenzym A andererseits abgetrennt werden können.

Das abgetrennte nicht umgesetzte Hydroxydopa kann unmittelbar zur Synthese zurückgegeben werden, während das Coenzym A mit Kaffeesäure, ATP und CoA-Ligase zum für die Synthese benötigten Caffeoyl-CoA umgesetzt wird. Diese Umsetzung (C) kann gleichzeitig mit der Rosmarinsäure-Synthese-Reaktion (A) in der Reaktionsmischung ablaufen.

Die Gewinnung von Hydroxydopa aus Ketodopa mittels Dehydrogenase (Reaktion B) kann der Umsetzung (A) vorgeschaltet werden oder auch unmittelbar in der Reaktionsmischung A ablaufen, wie im nachfolgenden Beispiel 1 gezeigt ist.

Beispiel 1 Integriertes Verfahren, Batch-Ansatz

Eine Lösung von "Ketodopa" (10 mmol/l) und NADH₂ (20 mmol/l) in TRIS-Maleat-Puffer (25 mmolar) mit pH 7,5 wird mit Caffeoyl-CoA (10 mmol/l), D-Hydroxyisocaproat-Dehydrogenase (5 U/ml) und Rosmarinsäure-Synthase (1 U/ml) versetzt und 8 h lang rühren gelassen. Durch Ultrafiltration werden die Proteine getrennt und das Filtrat eingeengt und mit Essigester extrahiert. Diese Produkt-Lösung wird eingeengt und Rosmarinsäure, nicht-reagiertes (+)-Hydroxydopa und Ketodopa mittels präparativer HPLC voneinander getrennt. Nicht-reagierte Hydroxydopa und Ketodopa werden ebenso wie die Enzyme wieder verwendet.

Beispiel 2 Integriertes Verfahren, kontinuierlicher Ansatz

Eine Lösung von "Ketodopa" (30 mmol/l), Ammoniumformiat (100 mmol/l) in TRIS-Maleat-Puffer (25 mmolar) mit pH 7,5 wird in eine Ultrafiltrationszelle mit Rührmöglichkeit, beispielsweise eine Amiconzelle, kontinuierlich eingeführt. In die Ultrafiltrationszelle wird vorher D-Hydroxyisocaproate-Dehydrogenase (20 U/ml), Formiat-Dehydrogenase (20 U/ml) und polymergebundenes NADH₂ (beispielsweise PEG-NADH₂) (1 mmol/l) eingeführt. Nach einer Verweilzeit von 2-3 h wird mittels UV-Spektrosphotometrie und/oder Polarimetrie analysiert und der Umsatz bestimmt.

Die Auslauf-Lösung wird mit Kaffeesäure und ATP (je 30 mmol/l) versetzt und in eine zweite Ultrafiltrationszelle, die Rosmarinsäure-Synthase (5 U/ml), Caffeoyl-CoA (30 mmol/l), ATP und CoA-Ligase (5 U/ml) in TRIS-Maleat-Puffer (25 mmolar) mit pH 7,5 enthält, eingeführt. Nach einer Verweilzeit von 1 h wird der Auslauf auf Rosmarinsäure und (+)-Hydroxydopa analysiert und mittels präp. HPLC getrennt. Nichtreagiertes (+)-Hydroxydopa wird wieder verwendet.

Beispiel 3 Integiertes Verfahren, halbkontinuierlicher Ansatz

A. Wie in Beispiel 2, wobei die Produkt-Lösung von der 1. Stufe gesammelt wird und chargenweise mit Caffeoyl-CoA, Kaffeesäure, ATP, Rosmarinsäure-Synthase und CoA-Ligase (in den o. g. Mengen) in einer Ultrafiltrationszelle umgesetzt wird.
B. Wie in Beispiel 2, wobei Hydroxydopa in einem Batchansatz hergestellt wird (siehe Beispiel 1, jedoch ohne Caffeoyl-CoA und Rosmarinsäure-Synthase) und die Produkt-Lösung wie im 2. Teil des 2. Beispiels umgesetzt wird.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von Rosmarinsäure der Formel durch enzymatische Umsetzung von 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-milchsäure mit Caffeoyl-Coenzym A in Gegenwart von Rosmarinsäure-Synthase, dadurch gekennzeichnet, daß die 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-milchsäure vorangehend oder gleichzeitig durch enzymatische Umsetzung von Ketodopa in Gegenwart von Dehydrogenase und NADH₂ gebildet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-milchsäure in Gegenwart von D-Hydroxyisocaproat-Dehydrogenase gebildet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Caffeoyl-CoA in situ durch Anwesenheit von Kaffeesäure, ATP und CoA-Ligase regeneriert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Caffeoyl-CoA in situ durch Anwesenheit von Kaffeesäure, ATP und CoA-Ligase regeneriert wird, wobei gleichzeitig ATP z. B. mit Acetylphosphat und Acetylkinase regeneriert wird.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Rosmarinsäure-Synthese kontinuierlich in zwei Stufen durchgeführt wird, indem in einer 1. Ultrafiltrationszelle 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-milchsäure aus Ketodopa gebildet und der Produktstrom der 1. Zelle in einer 2. Ultrafiltrationszelle mit Caffeoyl-CoA unter gleichzeitiger Regenerierung desselben umgesetzt wird unter Gewinnung von Rosmarinsäure, die aus dem Produktstrom der 2. Zelle isoliert wird.