JPS63133989A - 酵素反応方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酸化型および還元型ニコチンアミドアデニンヂヌクレオ
チド（ＮＡＤ（ＩＩ））あるいはニコチンアミドアデニ
ンヂヌクレオチド燐酸（ＮＡＤＰ（ＩＩ））　　（以下
ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）と略記する）等の補酵素を必要とす
る酸化還元反応酵素を用いて水難溶性の基質を変換する
試みは、ステロイドの水酸化あるいはケトステロイドの
還元等で行われている。これらの酵素群を工業的に利用
する場合は高価かつ貴重な酵素およびＮＡＤ（Ｐ）（＋
（）の回収・再利用が前（：ｌとなり、この目的に適し
たバイオリアクターの開発が必要となる。本発明は酵素
および補酵素を利用して、水難溶性の基質を変換せしめ
る様なバイオリアクター（生体触媒反応器）において、
水溶性の補酵素を含む水相と有機溶媒相あるいは水難溶
性の基質相とでエマルジョンを形成させ、水相を通さな
い膜を用いることによって連続反応を行い、補酵素の漏
出を極めて少１に抑え、効率良く反応を進行せしめる様
なシステムを提供することに閏するものであり、種々の
ステロイドやテルベ使用する方法として、■補酵素を水
溶性の高分子に結合させて限外濾過膜によってトランプ
する、■はう酸を結合した担体を用いて、分子内にヂオ
ールを有する補酵素をトラップする、■反応系内の酵素
潤度を高め、補酵素との親和性を利用してトラップする
、および■荷電型限外濾過膜を用いてネイティブの補酵
素をトラップする等が知られるところであり、それぞれ
の特徴を生かしたバイオリアクターが開発されている。

一方、補酵素の関与した水難溶性基質を変換する酵素反
応において、Ａｎｔｏｎｉｎｉら（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉ
ｃｒ−ｏｂ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、、Ｖｏｌ、３．２９１（
１９８１））が有ａ溶媒中におけるステロイドの酵素的
変換を行っているが、補酵素を積極的に反復・再使用す
る試みは成されていなかった。

［発明が解決しようとする問題点コ 水溶液中において、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）関与の酸化還元
酵素を用いて連続的に酵素的変換を行う場合、補酵素の
反復・再使用の代表的な方法は上記の■〜■が有効な手
段として、確立されているか、もさ（ 示されていない。有ｎ溶媒系においてこの反復・再使用
方法を確立することによって水溶系と同様に有効なバイ
オリアクターを開発する事ができる。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは上記の課題を解決すべく、天然のＮＡＤ（
Ｐ）（１１）をそのままの形で、酵素と共にバイオリア
クター系内に固定化する方法について鋭た有機溶媒相お
よび／または水難溶性の油状基質相とでエマルジョンを
作ることによって反応を行い、更に予め反応容器に装着
した撥水性の透過性膜によって酵素的に変換された反応
生産物を系外に除去しつつ、補酵素および酵素を系内に
ととめたままで連続的に反応を行わしめることが可能で
あることを見いだし、本発明に到着したものである。以
下に、本発明の酵素反応方法について詳細に説明する。

本発明方法で使用する酵素として種々のステロイド脱水
素酵素、テルペン還元酵素、ステロイド脱水素酵素やテ
ルペン還元酵素を含有する菌体、及びそれらの処理菌体
あるいは菌体破砕物等を用いることが出来る。また水難
溶性基質として、具体的にはステロイド脱水素酵素を用
いる場合、テストステロンやアンドロステロンなどを、
またテルペン還元酵素を用いる場合、ルメントンやシト
ロネラールなどを例示できる。これらの中では有機溶媒
中で比較的安定なβ−ヒドロキシステロイド脱水素酵素
とテストステロンとの刊み合せが好ましい。さらに必要
ならば、上記酵素する事になる。

一方、補酵素は未修飾のままで、あるいはポリエチレン
グリコールやポリアクリルアミド等の高分子に結合した
ｇＱのものを用いることが出来るが、複雑な製造行程を
要する高分子結合型補酵素を用いなくても未修飾のまま
で使用した場合に、それらを反復・再使用できる点で、
大なる効果を発揮する。

エマルジョンは、水相として酵素および補酵素を水また
は酵素反応に有利な緩衝液に溶解した水溶液５〜８０％
（Ｖ／Ｖ）、有機溶媒相として９５〜２０％（Ｖ／Ｖ）
とを混合し、Ｐ；を拌あるいは超音波等によって良く混
和して調製される。この水溶液と有４Ｆｌ？ａ媒との混
合比を変えることによって、すなわち前者の比率が高い
場合にはＯ／　Ｗの、また後者の比率が高い場合にはＷ
　／　Ｏ型のエマルジョンになるが何れの場合にも有機
溶媒相だけが選択的に濾過される。しかし有機溶媒相の
１！過速度はＷ２Ｏ型の方が大きく、この型のエマルジ
ョンを選ぶ方がより好ましい。有機溶媒相は、ステロイ
ド等くい溶媒単独で、あるいはこれらから適当に選ばれ
た少なくとも２種類以上の溶媒に溶解させたものを用い
る。

一方、テルペン化合物のように常温で液体の基質につい
ては、それらをそのまま有８１溶媒相とするか、あるい
は上述の有ｎ溶媒に溶解させたものを用いる。

本発明で使用する撥水性の透過性膜はテフロン膜（例え
ばミリボア社製フロリナート膜、東洋成紙製ポリフロン
膜や分液成紙Ｎｏ、２５、日東電工社製ポリアミド膜等
）などの有機溶媒を通過するが、水を通さない膜であれ
ば原理的に使用可能である。

それらの材質から成る膜は、孔径１０μｍ以下の精密１
！過膜や限外濾過膜が適している。Ｗ　／　Ｏ型エマル
ジョンの場合には、限外濾過膜のように孔径が小さくな
るほど微水滴を、より完全に除去出来る点で優れている
。また精密濾過膜のように幾分孔径の大きな膜は小さな
圧力でｌＪ過でき、大きな濾過速度が得られる点で優れ
ている。これらの膜は平膜あるいはホローファイバーに
成形したもの等を行うことができる。この場合の該生産
物とじて具体的には、水難溶性の基質としてテストステ
ロンを用いた場合には、β−ヒドロキシステロイド脱水
素酵素の作用により生成する４−アンドロステン−３，
１７ジオンを、また該基質としてρ−メントンを用いた
場合には、メントン還元酵素の作用により生成する又−
メントールを、さらに該基質としてシクロヘキサノンを
用いた場合、馬肝臓アルコール脱水素酵素の作用により
生成するシクロヘキサノールを例示できる。

［発明の効果］ 酵素及び補酵素を利用して水難溶性の基質を酵素反応に
よって目的の生産物に変換せしめるようなバイオリアク
ターにおいて、本発明に係わる酵素反応方法を用いれば
、本発明の方法では水溶性の酵素および補酵素を含む水
相と、有機溶媒相あるいは水難溶性の基質相とでエマル
ジョンを形成させると共に、水相を通さない撥水性の透
過性膜を用いて生産物のみを連続的に系外へ取り出しな
がら反応を行うことができる様にしているので、高価且
つ貴重な酵素および補酵素の漏出を極めて少量に抑えて
反応を行うことが出きるだけでなく、以下、本発明の実
施例を挙げて具体的に述べるが本発明はこれらによって
何ら限定されるものではない。

実施例１゜ 撥水性の透過性膜（東洋濾紙製ＮＯ，２Ｓ）の補酵素捕
捉効率を調べた。有機溶媒としてシクロへキサノン２１
と補酵素溶液として２０μ信０１のＮＡＤを１１の０．
１Ｍ燐酸緩衝液に溶解したものを撥水性膜を装着した限
外濾過装置に入れてよく攪拌しながら半連続的にシクロ
ヘキサノンを加えつつ濾過した。

総量３０１のシクロヘキサノンを入れ終わったところで
系内の水相を取り出し補酵素の残量を高速液体クロマト
で分析した。その結果、初めに添加したＮＡＤの９０％
が系内に残存していた。すなわち１容量相当（３１）の
シクロヘキサノンが通過するときのＮＡＤの捕捉効率は
９９％と計算される。このように本性を用いることによ
って未修飾のＮＡＤ（Ｈ）でも有効に系内に保持できる
ことを確認し・た。

実施例２゜ β−ケトヒドロキシステロイト脱水素酵素［ＥＣ−タノ
ール０．１μｍ、Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａｏ、７６吋を添加した
液を水相とする。またテストステロン２００７１ｍｏｌ
および１μｍのスパン８５をシクロへキサノン４ｍｌに
溶解したものを有機溶媒相（油相）とする。これと前述
の水相とをよく攪拌し、Ｗ　／　Ｏ型のエマルジョンを
作り、撥水性膜（東洋濾紙製ＮＯ，２Ｓ）を装着した攪
拌装置付きの限外濾過器内に入れて、２４℃で反応を行
った。反応中、シクロヘキサノンに溶解したテストステ
ロン溶液（１００ａ＋Ｍ）を４＋ｗｌ／ｈｒの速度で添
加すると同時に同速度で有ａｉ媒相を濾過した。

！Ｏｈ「反応後、濾液（有８Ｎ溶媒相４０１）中の生産
物を分析し、５．６ｍＭの４−アンドロステン−３，１
７−ジオンおよび６．３ｍＭのシクロヘキサノールを認
めた。

一方、注液中の補酵素を高速液体クロマトで分析した結
果、補酵素は全く検出されなかった。この様にエマルジ
ョンの状態におけろ水相中の補酵素は撥水性膜を介して
系内に捕捉されるため、連続反応における補酵素の再利
用に大なる効果を発揮する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素および補酵素を用いて反応を行うに当たり、
   酵素および補酵素を水相とし、水難溶性の基質を有機溶
   媒相とするエマルジョンを作り、撥水性の透過性膜を用
   いることに依って水溶性の酵素および補酵素を系内にと
   どめ生産物を連続的に取り出しながら反応を行わせるこ
   とを特徴とする酵素反応方法