JPH10506790A - 疎水性生成物を酵素により連続的に生成させる方法及びこれに適する装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細孔質の生成物- 透過膜を通して連続的に酵素- 触媒処理された生成物含有水性反応混合物（生成物の流れ）から疎水性生成物を有機溶剤中に抽出し、その一方では生成物が乏しくなった反応混合物を生成物を生成させる目的で再循環させる。酵素により触媒作用を受けるこの反応は、固定化された酵素を含有する反応器中で、好ましくは酵素膜反応器中で特に起こる。生成物を分離するために、生成物含有反応混合物は中空ファイバーメンブラン束を通過するのが好ましく、この束のまわりを生成物溶剤が外部から、特に対向流で流れる。膜の有効細孔サイズは特に５〜５００μｍであり、処理を特に水相と有機溶剤との差圧０．５〜５バールで行う。特に中空ファイバーメンブラン束の形で抽出カートリッジが生成物透過性細孔膜と共に組み込まれた生成物生成循環系は、この処理を実施する装置として適している。

Description

【発明の詳細な説明】 疎水性生成物を酵素により連続的に生成させる方法及びこれに適する装置 本発明は、水溶液の形で疎水性生成物を酵素により連続的に生成させる方法及 びこれに適する装置に関する。 特に酵素による通常の方法に於ける生物形質転換は、光学活性物質の合成に、 しかもまた巨大化学物質に対してますます重要になっている。この場合水性媒体 中で活性な酵素の、一般に極めて選択的化学作用が利用される。 基質を反応させねばならない場合、水に難溶性である生成物が生じるという障 害が生じる。この問題を解決するために、種々の出発化合物が存在する。たとえ ば有機溶剤中に懸濁された固形キャリヤー上に固定化された形での酵素の使用、 水と混和しうる溶剤との均質溶液の形での酵素の使用又は逆ミセル中に酵素の封 入である。 有機溶剤（水に混和しうる又は水に混和しない）がそのまま存在することによ って加水分解酵素のクラスに属する酵素はわずかしか持ちこたえられない（たと えばＷＯ８９／０４７８４）。この様な酵素はその際一般に二次元で膜中に固定 化使用される。しかし活性及び生成物質- 特異的使用の点で改良された触媒利用 並びに取り扱いの容易性の観点から、均質に、溶液中に分配される触媒が有利で ある。 上述した様に、反応域中に有機溶剤のより多量の存在は、酵素の脱活性化又は 変性を生ずるので、本発明によれば有機溶剤を反応域中で使用せず、反応すべき 基質を反応域に直接連続供給して、基質濃度をその最大溶解度に応じて維持し、 生じる疎水性生成物を（基質残部と共に）反応混合物から選択的分離処理を経て 除去する（十分な表面を有する適当な生成物透過性膜の使用下に）。一方では反 応混合物の水溶性成分は、変化せずに溶液中に残存する。 前述の本発明の方法は、生成物を生成物含有反応混合物から生成物透過性細孔 膜を介して有機溶剤中に抽出し、生成物が乏しくなった反応混合物を生成工程に 再循環することを特徴とするものである。 “細孔”としてこの場合僅かな数のｎｍ、特に≧１０までの大きさの細孔を有 する穿孔された膜が挙げられる。上限は厳密なものでない。これは界面が安定化 されていることが前提である。それ故１０μｍ及びそれ以上の細孔の大きさを有 する場合に安全な処理法を達成することができる。膜の厚さは─特に極めて微細 な孔の膜の場合─有効な交換に対してできる限り小さくなければならない。この 際細孔の疎水性膜を用いて、特に中空ファイバーメンブラン束を用いて処理する のが好ましい。それによって大きい膜面と僅かな厚みの液相を実現することがで きる。これらは、酵素による生成物生成の速度を測定して生成物を分離すること ができる。 本発明のその他の特徴は、請求の範囲及び下記の説明から明らかである。 ドイツ特許第４０４１８９６号明細書から、有機化合物の酵素による合成法は 知られている。この場合反応域中に生じる“有機化合物”を酵素１種又はそれ以 上から溶液拡散膜によって分離し、分離すべき化合物への選択的変換作用を有す る官能基が含まれる。この際たとえばスルホン化されたポリマー膜を備え、有機 化合物を膜の透析蒸発による又は脱活性化(pertraktive)による放出によって排 除する。後者の場合、“脱離”はいわゆる洗浄液体を用いて行われ、これにたと えばシアンヒドリン- 分離のためにメチレンクロライド、無水酢酸及び塩化アセ チルが添加される。膜を用いる成分の数年来公知の選択に対するこの変法に関連 して、特に反応混合物が高分子酵素から分離される酵素- 膜- 反応器に関して、 膜の多孔性が特に指摘されている。 これと対照的に本発明によれば、疎水性生成物を液／液- 抽出に変えることに よって反応混合物から選択的に生成物が分離される。この際細孔に形成される界 面─特に対向流中に─は連続的に再生される。 原則的に、本発明は、水相が再循環する生成物循環系中に使用される膜カート リッジを適用することによって実現することができる。この様な実施にあたり、 酵素を膜安定化された界面に有機溶剤を用いて細孔膜の使用下に接触させる。こ のことは場合により酵素活性の妨害を生じる。この様な場合、反応域を、これに 固定化される酵素と共に、好ましくは酵素膜反応器の形で使用するのが有利であ る。 本発明によれば、純粋な出発化合物を直接供給し、そして疎水性生成物を放出 することによって、生成物が乏しくなった混合物をこれに溶解された酵素及び補 因子と共に再循環することができる。これは循環数の増加及び同時に費用の減少 を生じる。 本発明によれば疎水性材料、たとえば場合によりフッ素化された炭化水素ポリ マー、たとえばポリプロピレン及びポリエチレンから成る中空ファイバー束を使 用するのが特に好ましく、その比較的高い多孔性及び小さい被膜強度は比較的小 さい細孔開口部の場合、本発明の好ましい実現化に適する。 細孔膜が使用され、これは疎水性が又は親水性であってよいが、好ましくは疎 水性でなければならない。 有機溶剤相は、膜によって形成された界面に水相と共に接触し、（疎水性膜の 使用で）その空隙中に流出する。それ故に水相と有機相の間に比較的に小さい有 利な圧力差が考慮される。 次に、本発明を添付図面及び実施例に従って詳細に説明する： 図解して示す： 図１：反応図式； 図２：抽出モデル； 図３：本発明の生成装置に連結する抽出モデル； 図４：連続的抽出剤精留器と連結された図３による装置； 図５：抽出モデルに接続された酵素膜反応器を備えた本発明による生成装置 図１中に、本発明の装置中で実施することができる代表的な反応を示す。疎水 性基質Ｓを酵素１による触媒反応で疎水性生成物Ｐに変換する。これに補因子、 この場合はＮＡＤＨが必要であり、これは消散してＮＡＤとなり、酵素２による 第二触媒反応（ギ酸の酸化でＣＯ₂となる）によって再生される。 図２中に、本発明の装置の構成要素であってよい抽出モデル（１）を示す。こ の場合代表的な生成物水溶液から緩衝液、未反応基質Ｓ、酵素触媒反応によって 生じる生成物Ｐ、還元された形（ＮＡＤＨ）及び酸化された形（ＮＡＤ）で補基 質（この場合ギ酸（ＨＣＯＯＨ）を用いて細孔膜（２）を介して対向流で疎水性 溶剤を加え、選択的に基質Ｓは生成物Ｐを抽出する。緩衝液、補因子（ＮＡＤ（ Ｈ））及び補基質（ＨＣＯＯＨ）は、水相中にその親水性質により残存する。 膜（２）は、疎水相と水相との間の相界面の安定化に使用する。中空ファイバ ー束として膜（２）の設置は、大きい相界面を生じる。これは急速な物質移動を 促進する。 疎水性、細孔膜の場合、水相に疎水性溶剤の浸透を阻止するために、水性媒体 の側に過圧（Ｐ₂＞Ｐ₂）しなければならない。同様に親水性、細孔膜の使用に際 しては、疎水相中で反応水溶液の流出を阻止するために過圧（Ｐ₁≧Ｐ₂）を疎水 性溶剤の側に与えねばならない。 図３中に描写された本発明の装置は、図１中に描写された抽出モデル（１）を 反応器循環工程（３）中で連結する。反応溶液を循環ポンプ（４）によって反応 器循環工程（３）に供給する。酵素（５）と共に抽出モデル（１）の前の反応溶 液は、補因子ＮＡＤ及びＮＡＤＨ、補基質ＨＣＯＯＨ、未反応基質Ｓ及び酵素- 触媒された反応によって生じる生成物Ｐを含有する。後者を抽出モデル（１）中 で疎水性溶剤中に抽出する。この溶剤は水相に対して対向流で抽出剤ポンプ（６ ）を用いて抽出モデル中に圧入される。抽出モデルの前方を流れる、残存する親 水性成分（酵素、ＮＡＤ（Ｈ）、ＨＣＯＯＨ）含有水流に（７）での定量添加に よって再び基質Ｓを加える。同様に（７）での定量添加によって、反応によって 使用された補基質ＨＣＯＯＨ、そして脱活性化によって失われた補因子ＮＡＤが 補充される。 図４に示された装置は、抽出モデル（１）及び反応循環工程（３）を有する図 ３に一部対応する；しかしこれはヘキサン循環（８）によって拡大される。この ヘキサン循環（８）中で連続精留塔（９）が接続され、この塔で抽出された物質 （基質Ｓ、生成物Ｐ）を抽出剤から分離する。 精留されるヘキサンを、抽出剤ポンプ（６）によって再び抽出モデル（１）に 供給する。それによって有効な抽出に必要な溶剤量を減少させる。 図５中に描写された本発明の装置は、反応器循環工程（３）から成り、これ中 で反応器循環ポンプ（４）によって、基質Ｓ、補因子ＮＡＤ（Ｈ）及び補基質Ｈ ＣＯＯＨから成る基質溶液を酵素膜反応器（１０）中に圧入する。酵素膜反応器 （１０）は酵素循環ポンプ（１１）と限外濾過中空ファイバーモデル（１２）か ら成る循環系として配列される。この循環系で、酵素（５）を親水性限外濾過膜 （１３）の後側に固定化する。 限外濾過中空ファイバーモデル（１２）の濾過面上で酵素膜反応器（１０）か ら離れる酵素不含生成物溶液から、抽出モデル（１）中で連続ヘキサン流中の未 反応基質Ｓ及び生じる生成物Ｐを抽出する。基質Ｓ及び生成物Ｐを含有するヘキ サン流を、連続精留塔（９）中で基質Ｓ／精製物Ｐ混合物とヘキサンに分離する 。ヘキサンをヘキサン循環系（８）を経て、抽出モデル（１）に再び供給する。 抽出によって生成物Ｐが乏しい水溶液を、（７）で基質Ｓ及び補因子ＮＡＤの 定量添加によって、そして（１４）で補基質ＨＣＯＯＨのｐＨ- 調節された定量 添加によって再び基質溶液として酵素膜反応器（１０）に供給することができる 。 図５中に描写された装置は、（Ｓ）-１- フエニル -２- プロパノールの生成 に使用される。処理条件を下記例中に記載する。 例１ 並列された循環ポンプと限外濾過中空ファイバーモデル(Amicon hollow fibre ，Typ H1P10-43，cut off：10000 Da)を備えた５０ｍｌ- 酵素膜反応器（ＥＭＲ ）中で、酵素： ロードコッカスエリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）からのアルコール 分解酵素：０．９Ｕ／ｍｌ ＥＭＲ- Ｖｏｌ．カンジダボイジニ（candida boid inii）からのギ酸塩分解酵素：１．９Ｕ／ｍｌ ＥＭＲ- Ｖｏｌ．を加え、反応 混合物として フエニルアセトン ９ ｍＭ ＮＡＤ ０．１２４ ｍＭ ギ酸ナトリウム ５０ ｍＭ ギ酸 １４．１５ ｍＭ ジーリン酸水素カリウム ６０ ｍＭ を有するｐＨ６．７の水溶液を供給する。 ＥＭＲ中で０．３３時間の平均滞留時間（全反応循環流：１５０ｍｌ／ｈ）及 び２０℃の反応温度で、変換は基質フエニルアセトンに関して７３％である。 酵素膜反応器を離れた生成物溶液は、疎水性、ミクロ細孔性ポリプロピレン膜 （膜面：０．２３ｍ²；有効な細孔の大きさ：０．０５μｍ）を備えた液／液- 中空糸抽出モデル（Liqui-Cel ^R Phasenkontakt-Labormodul 5PCM-106,ヘキスト セラニーズ社）に連続的に供給する。この際連続的ヘキサン対向流（１０００ｍ ｌ／ｈ）によって生成物溶液から(Ｓ)-１- フエニル -２- プロパノール及び未 反応フエニルアセトンを連続的に抽出する。生成物含有ヘキサン溶液を、連続精 留に供給し、精留されたヘキサンを新たに抽出モデルに圧入する。ヘキサン相の 全容量は８００ｍｌである。 疎水性膜によるヘキサンの浸透を、水側面に過圧０．５バールの付与して阻止 する。 抽出モデルを離れた生成物不含水溶液を、フエニルアセトンの連続的定量（１ ．３５ｍｍｏｌ／ｈ）、ギ酸のｐＨ- 調節された定量及び脱活性により乏しくな った補因子の補充（０．７２４μｍｏｌ／ｈ）によって再び反応溶液として使用 し、新たに酵素膜反応器に供給する。 水相の全容量は、４５０ｍｌである。 空時収量はＥＭＲ- 容量に対して６４．３ｇ／(¹ＥＭＲ^*d)である。 補因子の循環数は１３６１ｍｏｌ_p／ｍｏｌ_NADである。（７３％^*１．３５^*１ ０００／０．７２４μｍｏｌ_p／μｍｏｌ_NAD）。 比較としての補因子の循環数、すなわちＥＭＲに供給される再循環流からの連 続的生成物の抽出をしない場合の補因子の循環数は、５３である。ｍｏｌ_p／ｍ ｏｌ_NAD（７３％^*９．０／０．１２４ｍｍｏｌ_p／ｍｍｏｌ_NAD）。 それ故に本発明の抽出再循環は、高価な補因子の２５倍より多くの改良された 利用をもたらす。 更に全部が、酵素膜反応器に供給される反応液体から本発明の連続生成物の採 取は、ＥＭＲ中への補因子のその他に必要な、一定の供給（一般に基質溶液と共 ）を実質上不必要とする。これは単に必要な量の数パーセントで存在する（熱脱 活性化によって引き起される）損失を相殺しなければならない。特に上述の様に 中空糸束の形での疎水性膜はそれ自体１０年来公知であり、入手できる。疎水性 生成物の酵素による生成にその特別な有利な作用は利用されない。 例２ 例１と同一の条件下で４- フエニル -２- ブタンを還元して(Ｓ)-４- フエニ ル -２- ブタノールとする。 連続的な基質添加によって、ＥＭＲ- 循環系中での４- フエニル -２- ブタノ ンの循環濃度は１２ｍｍｏｌ／Ｌを調整する。十分に高い変換を得るために、Ｎ ＡＤ(Ｈ)-濃度を１．２ｍｍｏｌ／Ｌに上げる。 ＥＭＲ中の滞留時間０．３３時間で平均変換率は、空時収量１０３．８ｇ／（ ｌ×ｄ）で８０％である。 補因子の脱活性化に応じて、補因子を９．１μｍｏｌ／ｈで定量添加する。 補因子の循環数は、１５８ｍｏｌ_p／ｍｏｌ_NADである。 比較として、すなわち抽出及び返環のない場合、補因子の循環数は８ｍｏｌ_p ／ｍｏ_NADである。例１の比較よりも低い循環数は、補因子の必要な高められた 濃度１．２ｍｍｏｌ／ｌに基づく。 それにもかかわらず本発明の抽出再循環によって２０倍改良された補因子利用 ももたらされる。 例３ 例１と同一の条件下で、６- メチル -５- ヘプタン -２- オン(Ｓ)-６- メチ ル -５- ヘプタン -２- オール((Ｓ)-(＋)-スルカトール)を還元する。(Ｓ)-(＋ )-スルカトールはキクイムシ Gnathotrichos sp．の雄性フエロモンであり、誘 惑物質として害虫駆除に使用することができる。 連続基質添加によって６- メチル -５- ヘプテン -２- オンの循環濃度をＥＭ Ｒ- 循環１０ｍｍｏｌ／ｌで調整する。一定のＮＡＤ(Ｈ)-濃度を０．２ｍｍｏ ｌ／ｌ調整する。 ＥＭＲ中での滞留時間０．３３時間で平均変換率は、空時収量６０ｇ／（１× ｄ）で６７％である。 補因子の脱活性化に応じて、補因子を１．５μｍｏｌ／ｈで定量添加する。 補因子の循環数は７４７ｍｏｌ_p／ｍｏｌ_NADである。 比較として、すなわち生成物の抽出及び返環をしない場合、循環数は３３ｍｏ ｌ_P／ｍｏｌ_NADである。 本発明の抽出再循環法の適用によってその利用率は、因子２３まで改良される 本発明の方法は、当然のことながら純粋な酵素処理に限定されず、原則として 反応を阻害するか又は二次反応を行う疎水性生成物を水性反応混合物から分離す るのに適する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴァンドライ・クリスティアン ドイツ連邦共和国、デー−52428 ユーリ ッヒ、ブォルフスホーフェナー・ストラー セ、139

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．水溶液の形で疎水性生成物を酵素触媒により連続的に生成させる方法に於て 、生成物を生成物含有反応混合物から生成物透過性細孔膜を介して有機溶剤中に 抽出し、生成物が乏しくなった反応混合物を生成物生成工程に再循環させること を特徴とする、上記方法。 ２．疎水性膜を使用する、請求の範囲１記載の方法。 ３．補因子依存性酵素反応を補因子- 再生と共に実施する、請求の範囲１又は２ 記載の方法。 ４．酵素触媒反応を反応器中でこれに固定化された酵素を用いて実施する、請求 の範囲１ないし３のいずれかに記載の方法。 ５．反応を酵素膜反応器中で実施する、請求の範囲１ないし４のいずれかに記載 の方法。 ６．生成物含有反応混合物が生成物の分離のために有機溶剤によって外側から環 流されている中空ファイバーメンブラン束を通して送り出される、請求の範囲１ ないし５のいずれかに記載の方法。 ７．中空ファイバーメンブラン束が、反応混合物に対して対向流で有機溶剤によ って環流されている、請求の範囲６記載の方法。 ８．有効細孔の大きさ５〜５００μｍを有する細孔膜で、そして水相と有機溶剤 の差圧０．５〜５バールで処理する、請求の範囲１ないし７のいずれかに記載の 方法。 ９．キラルアルコール、アミン、シアンヒドリンを生成する、請求の範囲１ない し８のいずれかに記載の方法。 10．生成物抽出も含まれる、有機溶剤のための再循環系である、請求の範囲１な いし９のいずれかに記載の方法。 11．生成物単離工程及び生成工程への基質の返環工程が接続する、請求の範囲１ ないし９のいずれかに記載の方法。 12．生成物透過性細孔膜を有する抽出カートリッジを含む生成循環系を特徴とす る、請求の範囲１ないし１１による方法の実施に適する、水性反応混合物から疎 水性生成物を連続的に生成させるための装置。 13．抽出カートリッジが中空糸膜束を有する、請求の範囲１２記載の装置。 14．カートリッジ中に水性相と有機相の間に差圧を生じる、請求の範囲１２又は １３記載の装置。 15．生成循環系で酵素反応に関するＥＭＲ- 配列がある、請求の範囲１２ないし １４のいずれかに記載の装置。